腫瘍細胞のVasculogenic活性を評価するためにマトリゲルベースの​​チューブ形成アッセイ

Summary

チューブ形成アッセイは、腫瘍細胞の血管活性を評価するために使用されます。

Abstract

過去数十年にわたって、チューブ形成アッセイを使用して成長因子を減らしたマトリゲルは通常、 体外 ^1-5 の血管内皮細胞の血管形成活性を実証するために採用されています。しかし、最近成長している証拠は、このアッセイは、内皮細胞の血管の動作をテストするために限定されないことが示されている。その代わりに、それはまた、血管の表現型^6-8を開発するために腫瘍細胞の数の能力をテストするために使用されています。この機能により、異種移植動物、vasculogenic擬態^（VM）9と呼ばれるプロセスで特定された彼らのvasculogenic行動と一致していた。その腫瘍細胞媒介性のVMを証明する証拠の多くがある内皮細胞の血管新生^6、10-13の独立した腫瘍の発生に重要な役割を、果たしている。例えば、腫瘍細胞は、悪性黒色腫と神経膠芽腫患者の^8、10、11から組織サンプルにおける血液灌流、血管チャネルの形成に関与することが見出された。ここで、我々は、腫瘍細胞のvasculogenic活性の評価に有用なツールとして、この筒状のネットワークのアッセイを説明した。我々はそのようなメラノーマB16F1細胞、神経膠芽腫U87細胞、および乳癌MDA - MB - 435細胞のようないくつかの腫瘍細胞株は、血管の細管を形成することができることを発見、しかし、一部には、結腸癌HCT116細胞などしないでください。さらに、この血管の表現型は、マトリゲル上に播種した細胞数に依存しています。したがって、このアッセイは、血管細胞、腫瘍細胞だけでなく、他の細胞を含む種々の細胞型の血管性をスクリーニングするための強力なユーティリティとして機能することができる。

Protocol

1。腫瘍細胞のVasculogenic活性を評価するためにマトリゲルベースの​​チューブ形成アッセイ

1. 腫瘍細胞と微小血管内皮細胞の調製：そのようなU87細胞、メラノーマ細胞B16F1、乳癌MDA - MB - 435、および結腸細胞HCT116、脳の腫瘍細胞（10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で増殖させたインビトロジェンからすべての）。内皮細胞株ヒト微小血管内皮細胞（HMVECs）は1μg/ mlのヒドロコルチゾン、1 ng / mlの上皮増殖因子、10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したEBM2培地（ロンザ）で培養した。細胞をPBSで3回洗浄し、0.05％トリプシン/ EDTA（Invitrogen）で剥離した。 5分間、2000回転で遠心後、細胞ペレットをPBSで再度洗浄した。その後、ペレット化した細胞を、血球計でカウントした。
2. マトリゲルの準備：成長因子-減のアリコートマトリゲル（BDバイオサイエンス）を室温で暖めていた。完全に融解する前に、それを氷上に移し、その液体は、少なくとも10分間氷上で保存した。その後、マトリゲル50μlのマトリゲルが均一に分散させることができる水平レベルで96ウェルプレートに播種し、37℃で30分間インキュベートした。
3. チューブの形成：細胞は（1〜2 × 10 ^4）内皮細胞の腫瘍細胞やEBM - 2の無血清DMEMに再懸濁し、およびマトリゲルの先頭にロードされました。このアッセイは、尿細管の開発にいくつかの薬剤の効果を測定するために使用された場合、これらのエージェントは、（促進剤または阻害剤）無血清培地に追加されました。各条件グループは4-6井戸が含まれていました。
4. 画像とデータ解析：37℃でインキュベーション℃で一晩、各ウェルは、直接顕微鏡で分析した。尿細管が固定のために必要だった場合、10％ホルマリン生理食塩水ベースの溶液100μlを静かに追加された、10分後、それは分析のための準備ができていた。 10倍の位相差を持つ顕微鏡下で、各フィールド内の細管は、画像化したと各ウェル3-5確率場から尿細管の平均を計測した。

2。代表的な結果：

これらの細管が多角形のネットワークを形成するために接続する明確な細長い細胞体から開発されたとしてHMVECsは、陽性対照として使用した。 B16F1、U87、およびMDA - MB - 435細胞は、HMVECsによって形成されたものと同様の血管の細管を開発したが、HCT116細胞は（図1）しなかった。細胞の用量依存性の管腔形成はU87細胞でテストされました。図2に示すように、10,000個の細胞は中止細管を形成した。細胞が倍増された後は、固体血管網はHMVECsに見られるものに匹敵するものであった。対照的に、5,000未満の細胞は、血管の表現型を形成するために失敗しました。

HMVECs、U87、MDA - MB - 435、およびB16F1細胞ではなく、HCT116細胞により誘導される図1。 チューブの形成。全ての細胞（2 × 10 ^4）マトリゲル上にロードし、一晩インキュベートした。細管は、位相コントラストを用いて画像化した。 HMVECsは、陽性対照として使用した。 3月5日フィールドの代表が示された。バー：100μmである。

細胞数依存的に図2。U87細胞誘導管。として隅に示されているU87細胞の異なる番号が管腔形成のために使用された。 HMVECsは陽性対照のために使用された。バー：100 mmです。

Discussion

成功するために、このアッセイのためには、マトリゲルの品質は、最初にテストする必要があります。小さなサンプルがHMVECsを使用してアッセイを事前に実行するためのバイオサイエンスBDから得ることができる。別のバッチの製品には、いくつかの多くは管腔形成のための最適な条件を提供しないような異なる資質を表示することがあります。マトリゲルのアリコートを96ウェルプレートにロードされたときに気泡が細管形成を混乱させることができるので、第二に、あらゆる気泡が、避けるべきである。小さな気泡が十分に書かれていた場合に、マトリゲルは、すぐに実験中に氷上で保存する元マトリゲル管に戻すことができます。さらに、テストされた細胞は対数増殖期での成長率で維持されるべきである。細胞の低成長を示す任意の培養条件が発生した場合、それらは健康な細胞に置き換える必要があります。減少温度（室温）はチューブの形成に影響を与える可能性があるため、管が固定されていない場合最後に、顕微鏡下で管の解析は1時間を超えるべきではない。全アッセイは、細胞死が誘導された管状構造の混乱を避けるために、24時間以内に終了してください。それは、チューブ形成が細胞移動、細胞間接着、生存、およびアポトーシスを含む複数の細胞の活性化過程によって特徴付けられることはよく知られています。例えば、細胞遊走および細胞間接着は、管の開発時に顕著である。廃止ネットワークがますます観察されるように24時間後、しかし、重要な細胞のアポトーシスが行われます。このイベントは、内皮細胞と腫瘍細胞由来の管腔形成の両方で発生します。

それは、このアッセイは、in vitroで 、内皮細胞関連血管新生とは独立したイベントの腫瘍細胞vasculogenic 活性を評価するために重要であることが浮上している。ここで、我々はその黒色腫細胞系B16F1と乳がん人間にだけでなく、動物モデル^14-17の腫瘍は、これらのタイプのvasculogenic動作と一貫性マトリゲル上でラインMDA - MB - 435開発した血管網、示されている。マトリゲル上でHCT116細胞による血管の表現型を開発するために障害が機械的に不明であるが、それはこの血管のプロパティは依存性腫瘍細胞のタイプになるかもしれないと推測される。それは、HCT116細胞はB16F1およびMDA - MB - 435細胞と比較して生体内の VMを生成する能力を欠いているかどうかを知るために興味深いものになるだろう。したがって、このアッセイの確立は、がんの生物学、血管生物学だけでなく、薬剤スクリーニングの研究で最も重要である。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995
FBS	Invitrogen	16000-044
Growth factor-reduced Matrigel	BD Biosciences	47743-720
EBM2 kit	Lonza Inc.	CC-3156
Nikon ECLIPSE TS100 microscope	Nikon Instruments