Een Matrigel-Based Tube Formation Assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen

Summary

Een buis formatie test wordt gebruikt om de vasculaire activiteit van tumorcellen te evalueren.

Abstract

In de afgelopen decennia, een buis formatie test met behulp van groeifactor-gereduceerde Matrigel is meestal gebruikt om de angiogene activiteit van de vasculaire endotheliale cellen aan te tonen in vitro ^1-5. Heeft echter recent steeds meer bewijzen zien dat deze test niet beperkt tot de vasculaire endotheliale cellen gedrag voor te testen. In plaats daarvan, maar ook is gebruikt om het vermogen van een aantal tumorcellen aan een vasculaire fenotype ^6-8 ontwikkelen, testen. Deze mogelijkheid is in overeenstemming met hun vasculogene het gedrag die in xenotransplanted dieren, een proces dat bekend staat als vasculogene mimicry (VM) ^9. Er is een veelheid aan bewijsmateriaal waaruit blijkt dat de tumor cel-gemedieerde VM speelt een vitale rol in de ontwikkeling van tumoren, onafhankelijk van de endotheelcellen angiogenese ^{6, 10-13.} Zo werden de tumorcellen gevonden om deel te nemen in het bloed geperfuseerde, vasculaire kanaal formatie in weefselmonsters van melanoom en glioblastoma patiënten ^{8, 10, 11.} Hier beschreven we deze buisvormige netwerk assay als een nuttig instrument bij de evaluatie van de vasculogene activiteit van de tumorcellen. We ontdekten dat sommige tumor cellijnen zoals melanoom B16F1 cellen, glioblastoma U87 cellen, en borstkanker MDA-MB-435-cellen zijn in staat om vasculaire tubuli vormen, maar sommige niet zoals de dikke darm kanker HCT116 cellen. Bovendien is dit vasculaire fenotype is afhankelijk van aantal cellen uitgeplaat op de Matrigel. Daarom kan deze test dienen als krachtig hulpmiddel om de vasculaire potentieel van een groot aantal celtypen met inbegrip van vasculaire cellen, tumorcellen en andere cellen scherm.

Protocol

1. Een Matrigel-Based Tube Formation Assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen

1. Voorbereiding van de tumorcellen en microvasculaire endotheelcellen: hersentumor cellen zoals U87-cellen, melanoomcellen B16F1, borstkanker MDA-MB-435, en dikke darm cellen HCT116 werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS en penicilline / streptomycine (alle van Invitrogen ). Endotheel cellijn menselijke microvasculaire endotheelcellen (HMVECs) werden gekweekt in EBM2 medium (Lonza), aangevuld met 1 ug / ml hydrocortison en 1 ng / ml epidermale groeifactor, 10% FBS en penicilline / streptomycine. De cellen werden gewassen met PBS drie keer en vrijstaande met 0,05% trypsine / EDTA (Invitrogen). Na het centrifugeren met 2000 rpm gedurende 5 minuten werden celpellets opnieuw gewassen met PBS. Vervolgens werden de cellen gepelleteerd geteld met een hemocytometer.
2. Matrigel voorbereiding: Een deel van de groei factor-gereduceerd Matrigel (BD Bioscience) werd opgewarmd bij kamertemperatuur. Voor volledig gesmolten is, werd het overgebracht naar ijs en de vloeistof werd bewaard op ijs gedurende ten minste 10 minuten. Dan 50 ul van Matrigel werd uitgeplaat op 96-well platen op een horizontaal niveau die het mogelijk maakt de Matrigel gelijkmatig te verdelen, en geïncubeerd gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
3. Tube formatie: Cells (1-2 x 10 ⁴⁾ werden opnieuw gesuspendeerd met serum-vrij DMEM voor tumor cellen of EBM-2 voor endotheliale cellen, en geladen op de top van de Matrigel. Als deze test werd gebruikt voor het meten van effecten van een aantal agenten op de tubulus ontwikkeling, werden deze middelen (stimulators of remmers) toegevoegd aan de serum-vrij medium. Elke voorwaardelijke groep bevatte 4-6 putten.
4. Beeld-en data-analyse: Na incubatie bij 37 ° C gedurende de nacht, elk putje werd direct geanalyseerd onder een microscoop. Als buisjes nodig waren voor de fixatie, werd 100 ul van 10% formaline zout-gebaseerde oplossing voorzichtig toegevoegd en tien minuten later, was hij klaar voor analyse. Onder een microscoop met 10x fasecontrast, werden tubuli in elk veld afgebeeld en een gemiddelde van buisjes 3-5 willekeurige velden in elk putje werd geteld.

2. Representatieve resultaten:

HMVECs werden gebruikt als een positieve controle, omdat deze buisjes werden ontwikkeld van heldere langgerekte cellichamen die verbinding maken met polygoon netwerk te vormen. B16F1, U87, en MDA-MB-435 cellen ontwikkelde vasculaire tubuli vergelijkbaar met die gevormd wordt door HMVECs, maar HCT116 cellen niet (figuur 1). Een cel dosis-afhankelijke buis formatie werd getest in U87 cellen. Zoals aangetoond in figuur 2, 10.000 cellen gevormd gestaakt tubuli. Nadat de cellen werden verdubbeld, een solide vasculaire netwerk is vergelijkbaar met die bij HMVECs. In tegenstelling tot cellen die minder dan 5000 niet in geslaagd een vasculaire fenotype vormen.

Figuur 1. Tube vorming veroorzaakt door HMVECs, U87, MDA-MB-435, en B16F1 cellen, maar niet HCT116 cellen. Alle cellen (2 x 10 ⁴⁾ werden geladen op Matrigel en geïncubeerd gedurende de nacht. Buisjes werden afgebeeld met behulp van fase-contrast. HMVECs werden gebruikt als een positieve controle. Een vertegenwoordiger van 3-5 velden werd getoond. Bar: 100 urn.

Figuur 2. U87 cell-geïnduceerde tubuli in een cel nummer-afhankelijke manier. Verschillende nummers van U87-cellen, zoals aangegeven in de hoeken werden gebruikt voor de vorming buis. HMVECs werden gebruikt voor een positieve controle. Bar: 100 mm.

Discussion

Om deze test te slagen, moet de kwaliteit van Matrigel eerst worden getest. Een klein monster kan worden verkregen bij BD bio-vooraf-run de test met behulp van HMVECs. Andere partij producten kunnen verschillend kwaliteiten waarin sommige percelen niet voorzien in een optimale conditie voor buis vorming. Ten tweede moet elke luchtbellen worden vermeden wanneer een portie van Matrigel wordt geladen in 96-well platen, omdat de bubbels kan tubuli vorming verstoren. Als kleine belletjes zijn te vinden in een goed, kan de Matrigel terug onmiddellijk verplaatst worden naar de oorspronkelijke Matrigel buizen die moet op ijs worden gehouden tijdens het experiment. Daarnaast moet getest cellen worden gehandhaafd in een groei op een log-fase. Wanneer een gekweekte voorwaarden aangeeft trage groei van de cellen optreden, moet ze worden vervangen door gezonde cellen. Ten slotte moet de analyse van de buizen die onder een microscoop worden niet langer dan een uur als de buizen zijn niet vast, omdat verminderde temperatuur (kamertemperatuur) kunnen buis formatie beïnvloeden. De hele test moet binnen 24 uur tot een verstoring van de buisvormige structuur veroorzaakt door celdood te voorkomen. Het is bekend dat de buis formatie wordt gekenmerkt door meerdere cellulaire-geactiveerde processen zoals celmigratie, cel-cel adhesie, overleving, en apoptose. Bijvoorbeeld, celmigratie en cel-cel adhesie zijn merkbaar tijdens de buis ontwikkeling. Na 24 uur, echter significant cel apoptose vindt plaats als beëindigde netwerk is in toenemende mate waargenomen. Dit evenement vindt plaats in zowel de endotheelcellen en tumor cel afkomstige buis formatie.

Het is ontstaan ​​dat deze test is van cruciaal belang voor het evalueren van tumorcel vasculogene activiteit in vitro, de gebeurtenis die onafhankelijk is van endotheliale cel-geassocieerde angiogenese. Hier hebben we aangetoond dat melanomen cellijn B16F1 en borstkanker lijn MDA-MB-435 ontwikkelde vasculaire netwerken op Matrigel, in overeenstemming met vasculogene gedrag van deze typen tumoren in de menselijke als in diermodellen ^14-17. Hoewel het uitblijven van een vasculaire fenotype ontwikkelen door HCT116 cellen op Matrigel is mechanistisch onbekend is, wordt gespeculeerd dat deze de goederen kan vasculaire tumor celtype afhankelijk zijn. Het zou interessant zijn om te weten of HCT116 cellen missen het vermogen om te VM in vivo te genereren in vergelijking met B16F1 en MDA-MB-435 cellen. Daarom, de oprichting van deze test is van het grootste belang in de studie van kanker biologie, vasculaire biologie en drug discovery.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995
FBS	Invitrogen	16000-044
Growth factor-reduced Matrigel	BD Biosciences	47743-720
EBM2 kit	Lonza Inc.	CC-3156
Nikon ECLIPSE TS100 microscope	Nikon Instruments