Summary
Hier beschrijven we de isolatie van CD133 tot expressie lever stamcellen en kanker stamcellen van muizen gehele lever, een proces dat weefsel spijsvertering, cel verrijkingscocktail en flowcytometrie isolatie vereist. Wij omvatten methoden voor geavanceerde single cell isolatie en klonale expansie.
Abstract
Leverstamceltechnologie of ovale cellen prolifereren bij chronische leverschade en voorgesteld te differentiëren tot zowel hepatocyten en cholangiocyten. Bovendien, lever stamcellen hypothese als de voorlopers voor een subset van leverkanker, hepatocellulair carcinoom. Een van de belangrijkste uitdagingen cel werken stam in elke vaste orgaan zoals de lever is het isoleren van een populatie van zeldzame cellen voor gedetailleerde analyse. Bijvoorbeeld, de meeste cellen in de lever hepatocyten (parenchymale fractie), die aanzienlijk groter zijn dan niet-parenchymale cellen. Door verrijking van het specifieke cellulaire compartimenten van de lever (ie parenchym en niet-parenchymale fracties) en het selecteren op CD45 negatieve cellen, kunnen we beginnen de populatie van stamcellen verrijken met meer dan 600 fold.The proceduresdetailed in dit rapport mogelijk een relatief zeldzame populatie van cellen van een orgaantransplantatie efficiënt worden gesorteerd. Dit proces kan worden gebruikt om isolateliver stamcellen van normale muizen lever en chronische leverbeschadiging modellen die verhoogde lever stamcelproliferatie tonen. Deze methode heeft duidelijke voordelen ten opzichte van standaard immunohistochemie bevroren of formaline gefixeerde lever functionele studies met levende cellen kan worden uitgevoerd na de eerste co-lokalisatie experimenten. Om de procedure die in dit rapport te bereiken wordt een werkrelatie met een op onderzoek gebaseerde flow-cytometrie kern sterk aangemoedigd als de details van FACS isolatie zijn sterk afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie en een sterke praktische kennis van elementaire flow-cytometrie procedures. Het specifieke doel van deze werkwijze is het isoleren van een populatie van lever stamcellen die klonaal kan worden uitgebreid in vitro.
Protocol
Alle oplossingen, media, instrumenten, filters en buizen moeten steriel en behandeld met steriele techniek om het risico op verontreiniging. Bereid alle buffers en media 24 uur van tevoren en bewaar bij 4 ° C.
1. Parenchymale en niet-parenchymale scheiding van hele lever
- Bereid de enzymoplossing voor digestie met een 15 cc buis met schroefdop in 10 ml steriel PBS bevattende 5 mg collagenase, 5 mg pronase en 1 mg DNAse.
- Euthanaseren muis met behulp van instelling goedgekeurde (Institutionele Animal Care en gebruik Comite) methode zoals CO 2 stikken. Veeg buikstreek van euthanasie dieren met 70% ethanol-oplossing. Met behulp van steriele instrumenten, open buikholte en explantatie lever en-blok. Verwijder galblaas van geëxplanteerd lever. Overdracht hele lever om laminaire stroming kap in gesloten steriele schotel.
- Deze procedure wordt voltooid in een laminaire stroming kap. Met behulp van een steriele scheermesje, gehakt lever metcombinatie van meerdere horizontale en verticale delen 1 minuut in steriele schotel. Plaats ¼ van gehakt lever pulp in 15 cc tube met 10 cc PBS met collagenase, pronase, en DNAse vanaf stap 1.1 hiervoor. Herhaal dit met elke ¼ gehakt lever.
- Place buizen met ¼ gehakt lever pulp en enzymen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 45 minuten, met shaker bij 1-2 cycli / seconde. Veeg buizen met 70% ethanol na verwijdering van waterbad vóór de overdracht naar laminaire stroming kap.
- Deze procedure wordt voltooid in een laminaire stroming kap. Zeef verteerd lever pulp door 70 micron gaasfilter te verzamelen in een steriele schaal. Met 2 ml steriele DMEM: F12 medium met 10% hitte geïnactiveerd foetaal runderserum, spoel het filter en de rubber uiteinde van een zuigerstang mash de pulp verteerd door het filter. Herhaal 5 keer de totale hoeveelheid filtraat ongeveer 20 ml. Verdeel het filtraat in 2 gelijke 15 ml buizen.
- Alle transfers moet worden ingevuld in laMinar zuurkast, en het gebruik van gekoelde centrifuge bij 4 ° C indien beschikbaar. Centrifugeer bij 50 xg gedurende 1 minuut. Sla supernatant # 1 en gooi parenchymale pellet. Centrifugeer supernatant # 1 bij 50 xg gedurende 1 minuut. Sla supernatant # 2 en gooi pellet. Centrifugeer supernatant # 2 bij 50 xg gedurende 1 minuut. Sla supernatant # 3 en gooi pellet. Centrifugeer laatste supernatant # 3 voor 180 xg gedurende 8 minuten tot niet-parenchymale fractie te verkrijgen.
2. Erytrocyten lysis
Werken in laminaire stroming kap, houden cellen koud en gebruiksklare oplossingen afgekoeld tot 4 ° C.
- De nacht voordat de procedure, voor te bereiden rode cel lysis buffer door verdunning van 10X concentratie voorraad BD Pharm buffer Lyse met een 1:10 verdunning met steriel gedestilleerd water. 1X solutionshould worden 30 dagen bewaard bij 4 ° C.
- De nacht voor de procedure voor te bereiden Miltenyi buffer met steriele PBS, 0,5% runderserumalbumine, en 2 mM EDTA. Filter oplossing met vacuümfilterunit met 0,45 micron filter. Cover top van tilter apparaat met originele plastic deksel en zet hem vast met plastic omslag. Storeentire filtereenheid bij 4 ° C gedurende 12 uur te ontgassen EDTA. Filtereenheid kan worden vervangen door standaard steriele dop na 12 uur.
- Deze procedure wordt voltooid in een laminaire stroming kap. Een 5 ml steriele buis, resuspendeer niet-parenchymale pellet uit stap 1.6 hierboven in 1 ml 1X verdund rode bloedcellen lysis buffer van 2.1. Doe het buisje voor de overdracht van de laminaire stroming kap.
- Voorzichtig vortexen voor 5 seconden en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C beschermd tegen licht.
- Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
- Deze procedure wordt voltooid in een laminaire stroming kap. Gooi gelyseerde RBC's in supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml ijskoud en steriel Miltenyi buffer.
- Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
- Deze procedure wordt voltooid in een laminaire stroming kap. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml ijskoud en sterielMiltenyi buffer.
- Verwijder 10 ul van PBS celsuspensie en voeg 10 ul tryan blauw. Tellen remainingnon-parenchymale cellen met hemocytometer.
3. CD45 hematopoietische celdepletie van niet-parenchymale fractie
Werken in laminaire stroming kap, houden cellen koud en gebruiksklare oplossingen afgekoeld tot 4 ° C.
- Suspendeer cellen in 100 ul buffer Miltenyi per 107 cellen tot 108 totale cellen.
- 20 pi toepassing Miltenyi CD45 antilichaam microbead per 107 cellen en incuberen bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
- Voeg extra 2 ml Miltenyi buffer en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant. Resuspendeer celpellet (tot 108 totaal cellen) in 1 ml buffer Miltenyi.
- In laminaire stroming kap, filter cellen met behulp van Miltenyi LD magnetische kolom. Begin met het plaatsen kolom in magnetische houder (Miltenyi MidiMACS of QuadroMACS). Hieronder Plaats steriele 5 ml tube filter filtraat op te vangen. Bereid kolom door het laden van 2 ml MilteNJI buffer.
- Zodra voorfilter wassen is voltooid, laadt cellen op LD kolom. Zodra de celsuspensie is in de kolom, voeg 1 ml Miltenyi buffer en herhaal 1 ml Miltenyi buffer te wassen 2 extra keer. Gebruik GEEN plunjer voorzien van kolom om de snelheid van filtratie te verhogen. ALLEEN verzamelen filtraat wanneer de filter in geplaatst in de magnetische houder.
- Centrifugeer het filtraat verzameld van ongeveer 5 ml (kolom heeft de resterende 1 ml) van CD45-verarmde niet-parenchymale cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten. Gooi de kolom met de bewaarde CD45 positieve cellen.
4. Flowcytometrie isolatie van CD133 positieve cellen
- Bereid ovale cel media. Gebruik 01:01 DMEM: F12 medium met 10% hitte geïnactiveerd foetaal kalfserum als base, en voeg insuline (1 pg / ml), HEPES (5 mol / L) en penicilline / streptomycine (1% volume / volume). Filter oplossing met vacuüm filter van 0,45 micron filter.
- Resuspendeer cellen in Miltenyi buffer bij 100 μL per 10 7 cellen. Voeg 2 pl CD133-PE geconjugeerd antilichaam. Gebruikmaking van een tweede groep cellen geïncubeerd met IgG-PE geconjugeerd antilichaam als een controle. Bewaar een derde groep cellen zonder kleuring als ongekleurde controle voor FACS.
- Incubeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten in het donker. Resuspendeer in 2 ml vlekken buffer. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml Miltenyi buffer.
- Deze stap wordt uitgevoerd onder normale flowcytometrie celsortering procedures, die instellingsspecifieke zijn. Met behulp van ongekleurde cellen en IgG PE gekleurde cellen, aan te passen sorteren parameters voor optimale gating van CD133 + celpopulatie. PE (R-Phytoerythrin) kunnen in het algemeen worden gebruikt met een flowcytometer die een laser die uitzendt bij 488 nm. De piekemissie van PE is 575 nm en wordt gedetecteerd in de FL-2 kanaal.
Opmerking: Het gebruik van een BD FACS Calibur of BD FACS Vantage machines, met het Cell Quest-programma voor het verzamelen van gegevens, gebruiken we vooruit Scatter en Side Scatter weergave in de log schaal celpopulaties identificeren met zijwaartse verstrooiing ingesteld op 250. FL1 en FL2 zijn zowel in log-schaal en is ingesteld op 550. Deze parameters een eerste startpunt aan de lever niet-parenchymale cellen weergeven, en worden aangepast indien nodig op basis kleurintensiteit van positieve en negatieve populaties. - Isoleer de CD133 + celpopulatie met behulp van CD133 + poort en het verzamelen van de cellen in steriel gefiltreerd cel media.
5. Celcultuurmethoden
- Centrifuge FACS verzamelde cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer celpellet in ovaal celmedium met ongeveer 5000 cellen per ml. Kan beginnen met hogere concentraties tot 50.000 cellen / ml voor de eerste experimenten en verminderen techniek verbetert en de totale opbrengst en levensvatbaarheid van de cellen verbetert.
- Cellaag op BD Biocoat laminine 96 putjes bekleed met 1000 cellen / cm 2. In bevochtigde incubator celkweek bij 37 ° C met 5% CO2. Na 24 h toe hepatocytgroeifactor (50 ng / nl) en epidermale groeifactor (20 ng / ml).
- Voor enkele cellen direct isoleren cellen in 50 ui ovaal celmedia in elke well van een 96 well laminine beklede plaat. Gebruik enkele cel FACS instellingen voor strenge selectie van een positieve cel alleen. Na 24 uur, voeg 50 ul ovaal celmedium met HGF en EGF zoals hierboven in stap 5.2. Wijzig media volledig na 5-7 dagen.
- Zodra de groeiende kolonies groter zijn dan 50% confluent is meestal het geval na 2 weken, afhankelijk van het totale aantal cellen geplateerd en cellevensvatbaarheid, kunnen de cellen worden gesplitst 01:03 als volgt.
- Split cellen met trypsine-EDTA 0,05%. Breng net genoeg om te dekken en onderkant, 50-100 ul / goed op plaat met 96 putjes. In plaats incubator bij 37 ° C gedurende 3-5 minuten.
- Voeg 100 ul van media aan elk putje en de overdracht van alle vloeistof 5 ml buis. Voeg 1 mL media aan elke buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer cellen in media plaat in laminine gecoate schaal, met behulp van cellen van 1 goed op plaat in 3 nieuwe putten (1:3 verhouding).
6. Bevestiging van bi-potentieel status met behulp van RT-PCR
Deze procedure wordt beschreven in het handboek RNeasy protocol dat wordt geleverd met de RNeasy Kit.
- Gebruik RNeasy micro kolommen voor plaat met 96 putjes kolonies. Zuig kweekmedium uit elk putje. Voeg 75 pl buffer RLT (van RNeasy Kit) direct aan elk putje. Schraap plaat bodem met steriele rubberen politieman. Pipettelysate in micro-centrifugebuis en vortex mengsel gedurende 1 minuut. Voeg 70% ethanol om lysaten en meng door pipetteren.
- Breng de oplossing RNeasy kolom in een 2 ml verzamelbuis (als vermeld in RNeasy Kit) en gecentrifugeerd in micro-centrifuge gedurende 15 seconden bij 10.000 rpm. Gooi geëlueerd filtraat.
- Hergebruik de verzamelbuis. Voeg 350 ul Buffer RW1 (RNeasy Kit) de RNeasy kolom en centrifugeer gedurende 15 seconden bij 10.000 rpm om de kolom te wassenmembraan. Gooi geëlueerd wassen.
- Voeg 10 ul DNase I stockoplossing aan 70 pl Buffer RDD (beide geleverd in RNeasy Kit). Voeg 80 ul DNase I Buffer RDD incubatie mix de RNeasy kolom membraan en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 350 ul Buffer RW1 (RNeasy kit) de RNeasy kolom en centrifugeer gedurende 15 seconden bij 10.000 rpm aan het membraan te wassen. Gooi geëlueerd wassen en verzamelbuis.
- Plaats de RNeasy kolom in een nieuwe 2 ml collectie buis (geleverd in RNeasy kit). Voeg 500 ul Buffer RPE (RNeasy Kit) de RNeasy kolom en centrifugeer gedurende 15 seconden bij 10.000 rpm aan het membraan te wassen. Gooi geëlueerd wassen.
- Bereid 80% ethanol met behulp van RNase-vrij water (RNeasy Kit). Voeg 500 ui 80% ethanol om de RNeasy columnand centrifuge gedurende 2 minuten bij 10.000 rpm. Gooi geëlueerd wassen.
- Plaats de kolom in een RNeasy nieuwe 2 ml verzamelbuis (RNeasy Kit) en centrifugeer op volle snelheid gedurende 5 minuten. Gooi alle geëlueerd wassen en colmeling buis.
- Plaats de kolom in een RNeasy nieuwe 1,5 ml verzamelbuis (RNeasy kit). Voeg 14 ul RNase-vrij water (RNeasy Kit) naar het midden van de kolom membraan en centrifugeer gedurende 1 minuut bij volle snelheid. Verzamel het filtraat met gezuiverd RNA en transfer naar ijs als maken cDNA onmiddellijk of bewaar bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
- Reverse transcriptie die Omniscript.Dilute RNase inhibitor tot een eindconcentratie van 10 eenheden / ul in ijskoude 1x Buffer RT. Vortex gedurende 5 seconden, en hartslag centrifuge gedurende 5 seconden. Bereid een nieuwe master mix op ijs volgens pagina 13 van Omniscript protocol. Vortex gedurende 5 seconden, en hartslag centrifuge gedurende 5 seconden. Aanbevolen tot een volume van mastermix 10% groter dan voor de totale vereiste voor alle reacties te bereiden.
- Toevoegen template RNA de individuele buizen met master mix. Vortex gedurende 5 seconden, en hartslag centrifuge gedurende 5 seconden. Incubeer gedurende 60 min bij 37 ° C.
- PCR amplificatie van hepatocyten(Albumine) en cholangiocyte specifieke genen gebruik HotStarTaq DNA polymerase. Bereid reactiemengsel per pagina 15 van HotStarTaq protocol boek. Aanbevolen verdunning stock primers concentratie van 20 pm / pl en met 1 ul / reactiebuis gebruikt voor forward en reverse primers. Afhankelijk van het aantal cellen aanvankelijk gebruikt voor RNA-extractie, raden verdelen laatste cDNA uit 3 reactiebuizen (β-actine voor ladingcontrole, albumine en KRT19) om te beginnen.
- PCR primer design is vermeld in tabel 1.
- Plaats reageerbuisjes in thermocycler. Aanbevolen volgende programma initiële experimenten: 95 ° CVoor x 15 minuten 1 cyclus gevolgd door 95 ° C gedurende 30 seconden, 55 ° C gedurende 30 seconden, 72 ° C gedurende 30 seconden x 35 cycli, gevolgd door 72 ° C gedurende 10 minuten.
- PCR-producten worden geanalyseerd met ethidiumbromide geïmpregneerde agarose gel.
7. Bevestiging van tumor potentieel van CD133 + stamcellen
- Deze procedure kanworden uitgevoerd met vers geïsoleerde cellen van 4 of van cellen die zijn gekweekt van stap 5. Wij raden het uitvoeren van de eerste experimenten met gekweekte cellen, zal zo vers geïsoleerde cellen hebben verminderd levensvatbaarheid en verminderde opbrengst.
- Trypsinize cellen met trypsine-EDTA 0,05% van stap 5.5 hierboven. Na 3-5 minuten incubatie bij 37 ° C, voeg 100 ul van de media aan elk putje en de overdracht van alle vloeistof uit elk putje om individuele 5 ml buizen (1 well = 1 tube). Voeg 1 ml media aan elke buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer cellen in 1 ml ijskoude PBS. Verwijder 10 ul van PBS celsuspensie en voeg 10 ul trypan blauw. Met trypan blauw exclusie, vast aantal levende cellen. Bij gebruik van FACS geïsoleerde cellen, wordt het aantal cellen bepaald door FACS isolatie tellen.
- Centrifugeer cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten en opnieuw gesuspendeerd in PBS bij een concentratie van 1 x 10 6 levende cellen/100 pl. Voeg 100 ul Matrigel. Zes weken oude immuun-deficiënte Nude muizen werden subcutaan geïnjecteerd met behulp van 28 gague naald. Injecteer 1 x 10 6 cellen in 200 pi per plaats.
- Muizen worden gecontroleerd tumorgroei dag. Eenmaal tumoren vormen, meestal na 3-4 weken incubatie wordt tumorvolume gemeten met behulp van remklauwen (hoogte x lengte x breedte).
8. Representatieve resultaten:
Van normale, gezonde muizen lever, de verwachte opbrengst van cellulaire CD133 + lever stamcellen is 1.000 tot 5.000 per lever. Deze cellen zijn relatief zeldzaam in rustige lever en zal niet goed groeien in cultuur. Wij raden u niet aan single cell analyse van normale lever en de opbrengst van levensvatbare cellen die zal uitbreiden is extreem laag.
Van levers met significante chronische schade, zoals DDC 0,1% dieet gedurende 6 weken 1 of genetische modificatie resulteert in chronische letsels, zoals MAT1a - / - of lever specifieke PTEN - / - muizen, 2-4 het verwachte aantal cells geïsoleerd stijgt, tot 100.000 cellen geïsoleerd / lever (figuur 2). Bij gebruik van genetische modellen, kennis van spontane tumoren tarief is van cruciaal belang, omdat deze procedures voor de lever stamcellen geïsoleerd moeten worden uitgevoerd in tumorvrij dieren. Bijvoorbeeld, als de MAT1a - / - modelformulieren spontane tumoren op 18 maanden, adviseren wij het gebruik van dieren uiterlijk 15 tot 16 maanden, voorafgaand aan de gemelde spontane tumoren.
Isolatie van enkele cellen van chronische blessure modellen levert een aantal (3-9 colonies/96 wells-plaat) kolonies die uit te breiden van een enkele cellen eenmaal de procedure wordt beheerst, en levensvatbaarheid van de cellen wordt gewaarborgd. Figuur 3 aanwezig vertegenwoordiger fasecontrast beelden van kolonies afkomstig van enkele CD133 + cellen uitgebreid na 7 dagen.
Bevestiging van bi-potentiële status wordt uitgevoerd met albumine en Krt19 RT-PCR. Kolonies van geëxpandeerde enkelvoudige cellen demonstreert zowel expressie van markers van hepatocyten (Albumin) en cholangiocyten (Krt19). Figuur 4 toont bi-potentieel expressie van drie geïsoleerde kolonies, met ongeveer 25 cellen / kolonie na 7 dagen.
CD133 + stamcellen uit normale lever en chemisch geïnduceerde leverbeschadiging (bijv. DDC 0,1% dieet gedurende 6 weken) niet tumoren te vormen in naakt muizen. CD133 + stamcellen van specifieke genetische modellen (MAT1a - / - of lever specifieke PTEN - / - muizen) zal vormen tumoren in naakt muizen als die laat late pre-tumor chronisch letsel fase. Deze tumor vormen fenotype wordt momenteel beschouwd als een kankerstamcel 2-4 voor bijvoorbeeld de MAT1a -. / - Muizen vormen spontane levertumoren op 18 weken. CD133 + lever stamcellen in 15-16 weken tijdens een late fase van chronisch letsel leverziekte, vormt tumoren in naakt muizen. Figuur 5 toont representatieve tumoren bilaterale injectie van 1 x 10 6 cellen geëxpandeerd in vitro uit een CD133 + leverstamceltechnologies.
| Gen | Forward Primer | Reverse Primer |
| β-actine | 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' | 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ' |
| Albumine | 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' | 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 ' |
| Keratine 19 | 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' | 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 ' |
Tabel 1: Primer ontwerp voor RT-PCR
Figuur 1: Algemeen schema methoden.
Figuur 2: CD133 + lever stamcellen die in sterk verrijkte CD45 verarmd niet-parenchymale fractie Controle onbeschadigde lever van wild-type. muizen toont aan 0,4% CD133 + cellen binnen de hoogverrijkt CD45 verarmd niet-parenchymale fractie. In de genetische knock-out MAT1a - / -, een model van chronische leverbeschadiging, de CD133 bevolking omhoog 10 maal of meer in dezelfde hoog verrijkte fractie.
Figuur 3: Uitbreiding van kolonies van enkele CD133 + klonen Fase-contrast beelden van vier kolonies afkomstig van enkele CD133 + cellen uitgebreid op laminine beklede platen met 96 putjes..
Figuur 4: Bi-potentieel genexpressie van CD133 + leverstamceltechnologie klonaal uitgebreid kolonies op dag 7, kolonies zijn ongeveer 25 cellen.. Genexpressie toont uitdrukking van hepatocyt marker albumine en cholangiocyte marker Krt19, bevestigt bi-potentiële status van CD133 + cellen.
Figuur 5: CD133 + lever stamcellen vormen tumoren in naakt muizen Pijlen geven tumoren groeien 4 weken na 1x10 6 CD133 + cellen geïnjecteerd MAT1a - / - model.. CD133 + cellen van toxine geïnduceerde chronische leverbeschadiging zoals CCI4 of 0,1% DDC dieet, vormen geen tumoren. Tumorvorming gebruikt om maligne potentieel of kanker stamcel fenotype in de stamcelpopulatie identificeren.
Discussion
In tegenstelling tot de hematopoietische systeem, waarin hematopoietische stamcellen zijn verantwoordelijk voor een systeem dat celdifferentiatie replacesnormal fysiologische omzetsnelheid van leukocyten, rode bloedcellen en bloedplaatjes leverstamceltechnologie of volwassen progenitorcellen, niet deelnemen in normale lever homeostase. 5,6 Na acute leverbeschadiging of gedeeltelijke hepatectomie, hepatocyten, zoals gedifferentieerde lever epitheel, ondergaan verschillende rondes van proliferatie om de verloren lever massa te vervangen. 5,6 Alleen tijdens chronische blessure zijn lever waargenomen stamcellen te vermenigvuldigen. 1,5 -11 Deze volwassen, orgaan-specifieke stamcellen voorgesteld te differentiëren tot zowel hepatocyten en cholangiocyten. 1,5-8 Interessant is dat de overgrote meerderheid van leverkanker ontwikkelt zich op de achtergrond van chronische schade, en dus lever stamcellen ook hypothese te de voorlopers voor een subset van leverkanker. 2-4,12-17
One van de belangrijkste uitdagingen naar cel werk voort in de lever is isolatie van zeldzame populaties van cellen voor functionele analyse. Bijvoorbeeld, de meeste cellen in de lever hepatocyten, die aanzienlijk groter zijn dan cholangiocyten en kleinere niet-parenchymale cellen. Door het breken van de gehele lever in celcompartimenten (grote hepatocyten - parenchymale fractie en kleinere cellen - niet-parenchymale fractie), en verder selecteren van CD45 negatieve cellen (niet-hematopoëtische cellen), kunnen wij de startpopulatie van stamcellen verrijken meer dan 600-voudige. 1,18-21 We merken wij geenszins aangeeft dat de CD133 + populatie is een 100% zuiver stamcelpopulatie, maar duidelijk een heterogene populatie van cellen met verschillende afkomst en herbevolking potentieel. Een van de belangrijkste beperkingen van het veld definities van stamcellen en progenitorcellen. We gebruiken de term "stamcel" ruimer in dit werk, maar in strikte definitie, CD133 + niet-parenchymal cellen vormen een bi-lijn stamvader bevolking. Gezien de stand van de huidige stam en progenitor onderzoek in de lever, dit rapport geeft wel een startplaats voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in dit gebied. Als nieuwe markers ontstaan zoals EpCAM, 22,23 of transcriptiefactoren, zoals Sox9, 24 kunnen worden opgenomen. Zo hebben we een vrij hoge mate van overlap tussen EpCAM + CD133 + cellen en cellen.
In dit rapport hebben we detail een werkwijze voor de stamcel los van de normale muizen lever en chronische leverschade modellen, die aantonen verhoogde lever stamcel proliferatie. Deze methode heeft duidelijke voordelen ten opzichte van standaard immunohistochemie bevroren of formaline gefixeerde lever functionele studies met levende cellen kan worden uitgevoerd na isolatie. 1,3,4 Het specifieke doel van deze werkwijze is het isoleren van een relatief zuivere populatie lever stamcellen die kunnen klonaal worden uitgebreid in vitro.
Alternatieven voor deze procedure omvatten mIJZIGING aan alternatieve celoppervlaktemarker, zoals CD49f, EpCAM of combinatie van merkers, zoals CD133 + + EpCAM Een tweede gepubliceerd rapport gebruikt een dichtheidsgradiënt de lever stamcellen te isoleren uit een niet-parenchymale fractie. Deze procedure vereist een Ultra-centrifuge (8000 xg), voegt aanzienlijke tijd om de procedure en in onze ervaring, aanzienlijk verminderd pre-FACS cellulaire opbrengst en post-FACS levensvatbaarheid. 8
Toekomstige experimenten een breder gamma van genexpressie analyse, inclusief foetale lever genen, zoals HNF3, HNF4α en αfp.In Bovendien Western blot analyse en immunocytochemie van tot expressie gebrachte eiwitten kunnen worden gebruikt voor RT-PCR resultaten van cellen in kweek te bevestigen.
Een probleem om op te merken is recent werk dat CD133 expressie geïdentificeerd op leverstellaatcellen. 25 We hebben nu routinematig onze monsters te screenen op markers van stellaatcellen (zie Problemen oplossen sectie), en hebben niet identified aanzienlijke verontreiniging in onze fracties. Dit kan verband houden met verschillende technieken van lever spijsvertering en celisolatie. 2,3,26
Gebaseerd op het feit dat de meeste cellen niet levensvatbaar onmiddellijk na isolatie FACS raden wij de cellen uitgeplaat zijn, als bulk CD133 + cellen of enkele cellen, voor gebruik bij dieren. 5-7 dagen in vitro geeft significant betere resultaten van de tumor analyse. Bovendien, gezien de ontberingen van enkele cel isolatie, moet deze alleen worden uitgevoerd zodra kolonies kan worden uitgebreid van bulk CD133 + geïsoleerde cellen. Een uitvoerige bespreking van de verschillende kweekomstandigheden en scaffold proteïnen die kunnen worden gebruikt voor cultuur lever stam-en progenitorcellen is goed gekarakteriseerd door Lola Reid. Dit werk biedt alternatieve voorwaarden en wijzigingen, die onderzoekers kunnen nemen in hun onderzoeksprogramma keer elementaire isolatietechnieken worden beheerst. 27,28 Dr Reid's work biedt ook een meer gedetailleerde analyse van het geslacht biologie en rijping tussen hepatische stamcellen en daarvoor bestemde voorlopercellen.
In termen van in vivo tumor analyse hebben we succes gehad met vers geïsoleerde cellen en cellen van klonaal geëxpandeerd CD133 + cellen in vitro, voornamelijk met 1x10 6 cellen. We hebben ons gericht ontwo genetische stammen van chronische leverschade, de MAT1a - / - en de lever specifieke PTEN - / - muizen, en we hebben gebruik gemaakt van zowel naakt muizen en wild-type muizen als gastheren voor tumorgroei. In onze ervaring, zal CD133 + lever stamcellen maken alleen tumoren gebruikt als ze geïsoleerd zijn van aanzienlijke leverbeschadiging modellen die pre-maligne. Merk op dat de tumoren gevormd uit CD133 + cellen algemeen hebben zowel hepatocellulair carcinoom en cholangiocarcinoom functies, hetgeen duidt op een stamcel-of progenitor cel oorsprong naar de tumoren. 2-4,29
Follow-up werk na tumoren worden gedocumenteerd includes standaard pathologische analyse van tumorweefsel (H & E kleuring) en immunohistochemische kleuring. Bovendien kunnen tumoren worden gemalen en gedigereerd voor FACS analyse of re-cultuur. 2-4,30
Tot slot hebben we gedetailleerd een procedure voor de isolatie, uitbreiding, en basiskarakterisering van CD133 + lever stamcellen en CD133 + kankerstamcellen.
Trouble Shooting:
CD45 verontreiniging:
In stap 3 als er verontreiniging van CD45 + cellen, die worden beoordeeld door toevoeging van een CD45-FITC Ab voor FACS-analyse en isolatie, controleer dat de CD45 microbead antilichaam niet is verlopen en het filtraat werd verzameld alleen tijdens de filter is in de magnetische houder. Elke filtraat verzameld als het filter niet in de magnetische houder bevat CD45 + cellen.
Low aantal cellen:
Voor de niet-gewonde lever, de totale number van CD133 + niet-parenchymale geïsoleerd kan minder dan 10.000. Deze cellen zijn zeldzaam in de rustige lever. Een chronisch letsel model, zoals DDC 0,1% dieet, het aantal sterk toenemen tot 100.000 cellen. Als het totale aantal cellen is aanzienlijk lager dan deze nummers, een punt van overweging is de FACS Ab kleuring. Controleer of de CD133 Ab niet is verlopen, een slechte kleuring leidt tot een slechte opbrengst. Tevens raden uitvoeren van een FACS analyse van de lever niet-parenchymale cellen van de relatieve populatie vóór bepalen poging FACS isolatie.
Laag cellevensvatbaarheid na FACS:
Een van de problemen van de levensvatbaarheid kan worden gerelateerd aan hoe de cellen worden verwerkt en op welk tijdstip. Idealiter zou de hele cel isolatie procedure, stappen 1-4, worden uitgevoerd zonder enige vertraging tussen de stappen en voltooid in op dezelfde dag. Elke belangrijke vertraging tussen de stappen 1-4 zal sterk verminderen van de levensvatbaarheid van de cellen. Een tweede probleem in verband met cell levensvatbaarheid kan worden gerelateerd aan de mantel druk voor FACS isolatie. Wij raden u aan een lagere schede druk. Tenslotte wanneer de cellen worden geïsoleerd, moeten ze direct geplateerd, elke aanzienlijke opslag op ijs na sortering zal ook levensvatbaarheid.
CD133 + niet-parenchymale heterogeniteit:
Recente rapporten blijkt dat leverstellaatcellen kan ook CD133 expressie en enige plasticiteit. 25 Daarom naast controle bi-potentie genen met albumine en Krt19 aanvullende verificatie genen geassocieerd met stellaatcellen, zoals de gliale fibrillaire zure proteïne in zijn rustende stellaatcellen en alfa-gladde spier actine en desmine in geactiveerde stellaatcellen. 3,4,26 Bovendien is de CD133 + populatie vertegenwoordigt een bredere populatie progenitor. De toevoeging van een tweede marker, zoals EpCAM kan bijdragen dat de bevolking verder te verfijnen en beperken heterogeniteit.
Disclosures
Dr Rountree krijgt ondersteuning van het onderzoek van Bayer Farmacie. Drs. Ding en Crooks en mevrouw Dang en mevrouw VanKirk hebben geen mededelingen te melden.
Acknowledgments
Dr Rountree erkent de huidige steun van de Children's Miracle Network, National Institute of Health, K08DK080928 en R03DK088013, en de American Cancer Society Research Scholar Award, MGO-11651. Dr Rountree erkent dat deze procedure in eerste instantie werd ontwikkeld en verfijnd, terwijl gefinancierd door de Pediatric Scientist Development Program (NICHD Grant Award K12-HD00850).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 10565-018 | With phenol red |
| CD45 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma-Aldrich | H1404 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN25 | 1 gram |
| Collagenase D | Roche Group | 1088874 | |
| Pronase | Roche Group | 0165921 | |
| 70 micron mesh strainer | Fisher Scientific | 352350 | |
| Omniscript RT | Qiagen | 205111 | 50 reactions |
| HotStarTaq | Qiagen | 203203 | |
| Miltenyi LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| CD133-PE FACS Ab | eBioscience | 12-1331-82 | |
| Laminin coated plates | BD Biosciences | 354410 | 96 well |
| Trypsin 0.05% EDTA | Invitrogen | 25300-354 | 100 mL |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | 50 columns for 5x105 cells or less |
| Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | 10X concentration |
References
- Rountree, C. B. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).
- Ding, W. CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis. Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).
- Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice. Stem Cells. 27, 290-299 (2009).
- Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice. Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).
- Michalopoulos, G. K.
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J.
- Theise, N. D. Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).
- Wang, X. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).
- Greenbaum, L. E., Wells, R. G. The role of stem cells in liver repair and fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).
- Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).
- Khurana, S. Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury. J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).
- Sell, S., Leffert, H. L.
- Lee, J. S. A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells. Nat. Med. 12, 410-416 (2006).
- Sell, S., Dunsford, H. A. Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma. Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).
- Amin, R., Mishra, L. Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis. Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).
- Tang, Y. Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling. Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).
- Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma. Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).
- Rountree, C. B. Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration. Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).
- Shimano, K. Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1. Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).
- Suzuki, A. Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver. Hepatology. , (2008).
- Suzuki, A. Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver. J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).
- Yamashita, T. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).
- Furuyama, K. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43, 34-41 (2011).
- Kordes, C. CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells. Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).
- Berg, T. Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation. Hepatology. , (2007).
- Turner, R. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).
- Wang, Y. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
- Galicia, V. A. Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2. Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).
- Ding, W. Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion. Hepatology. 52, 945-953 (2010).
