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Biology

CD133 + क्लोनल विस्तार के लिए यकृत स्टेम सेल का अलगाव

Published: October 10, 2011 doi: 10.3791/3183
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3
1Department of Pediatrics and Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pediatrics, University of California Los Angeles, School of Medicine

Summary

यहाँ हम CD133 स्टेम व्यक्त जिगर और पूरे murine जिगर, एक प्रक्रिया है कि ऊतक पाचन, सेल, संवर्धन और प्रवाह cytometry अलगाव की आवश्यकता से कोशिकाओं को कैंसर स्टेम कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन. हम उन्नत एक सेल अलगाव और clonal विस्तार के लिए तरीके शामिल हैं.

Abstract

लिवर स्टेम सेल, या अंडाकार कोशिकाओं, जीर्ण जिगर की चोट के दौरान पैदा कर रहे हैं, और दोनों hepatocytes और cholangiocytes में अंतर करने का प्रस्ताव है. इसके अलावा, जिगर स्टेम कोशिकाओं यकृत कैंसर, hepatocellular कार्सिनोमा के एक सबसेट के लिए व्यापारियों की धारणा कर रहे हैं. प्राथमिक जिगर की तरह किसी भी ठोस अंग में स्टेम सेल काम करने की चुनौतियों की कोशिकाओं के एक दुर्लभ आबादी के विस्तृत विश्लेषण के लिए अलग है. उदाहरण के लिए, जिगर में कोशिकाओं के विशाल बहुमत hepatocytes (parenchymal अंश), जो गैर parenchymal कोशिकाओं की तुलना में काफी बड़े होते हैं. जिगर की विशिष्ट सेलुलर डिब्बों (यानी parenchymal और गैर parenchymal fractions) को समृद्ध और CD45 नकारात्मक कोशिकाओं के लिए चयन करके, हम 600-fold.The स्टेम सेल के शुरू जनसंख्या के लिए अनुमति देने के इस रिपोर्ट में proceduresdetailed को समृद्ध करने में सक्षम हैं एक ठोस अंग से कोशिकाओं के एक अपेक्षाकृत दुर्लभ जनसंख्या कुशलतापूर्वक हल. इस प्रक्रिया isolateli करने के लिए उपयोग किया जा सकता हैदेखें सामान्य murine जिगर से स्टेम कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीर्ण जिगर चोट मॉडल है, जो वृद्धि हुई जिगर स्टेम सेल प्रसार का प्रदर्शन. इस पद्धति जमी या formalin निश्चित जिगर के मानक immunohistochemistry पर स्पष्ट लाभ के रूप में कार्य जीवित कोशिकाओं का उपयोग करते हुए अध्ययन के प्रारंभिक सह स्थानीयकरण प्रयोगों के बाद किया जा सकता है. इस रिपोर्ट में उल्लिखित प्रक्रिया को पूरा करने के लिए, एक शोध आधारित मूल प्रवाह cytometry के साथ एक काम कर रिश्ता दृढ़ता से FACS अलगाव के विवरण के रूप में विशेष उपकरण और बुनियादी प्रवाह cytometry प्रक्रियाओं के एक मजबूत कार्यसाधक ज्ञान पर अत्यधिक निर्भर हैं प्रोत्साहित किया जाता है. इस प्रक्रिया के विशिष्ट लक्ष्य जिगर स्टेम कोशिकाओं कि clonally इन विट्रो में विस्तारित किया जा सकता है की एक आबादी को अलग करने के लिए है.

Protocol

सभी समाधान, मीडिया, उपकरणों, फिल्टर, और ट्यूबों बाँझ हो सकता है और संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए बाँझ तकनीक के साथ संभाला जाना चाहिए. 4 डिग्री सेल्सियस पर अग्रिम और दुकान में सभी buffers और 24 घंटे मीडिया की तैयारी

1. पूरे जिगर से parenchymal और गैर parenchymal जुदाई

  1. पेंच शीर्ष के साथ 10 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस 5 मिलीग्राम कोलैजिनेज, 5 मिलीग्राम pronase, और 1 मिलीग्राम DNase को नियंत्रित करने में एक 15 सीसी ट्यूब का उपयोग पाचन के लिए एंजाइम समाधान तैयार.
  2. संस्था को मंजूरी दी (संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति) सीओ 2 asphyxiation के रूप में ऐसी विधि का उपयोग माउस euthanize. Euthanized जानवरों के पेट क्षेत्र 70% इथेनॉल समाधान के साथ साफ कर लें. उपकरणों बाँझ, खुले उदर गुहा और explant जिगर ब्लॉक का उपयोग. Explanted जिगर से पित्त की थैली से निकालें. लामिना का प्रवाह हुड बंद बाँझ पकवान में पूरे जिगर स्थानांतरण.
  3. लामिना का प्रवाह हुड में यह प्रक्रिया पूरा हो गया है. एक बाँझ रेजर ब्लेड का उपयोग, साथ जिगर बोटी - बोटी करनाबाँझ पकवान में 1 मिनट के लिए कई क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर कटौती की संयोजन. प्लेस ¼ साथ 10 सीसी कोलैजिनेज पीबीएस pronase, और 1.1 ऊपर कदम से DNase के साथ 15 सीसी ट्यूब में कीमा बनाया हुआ जिगर लुगदी के. प्रत्येक ¼ कीमा बनाया हुआ जिगर से दोहराएँ.
  4. ¼ कीमा बनाया हुआ जिगर लुगदी और पानी के स्नान में एंजाइमों 37 डिग्री सेल्सियस में 1-2 चक्र / 2 में बरतन के साथ 45 मिनट के लिए, के साथ जगह ट्यूब. 70% इथेनॉल के साथ पानी से स्नान हटाने लामिना का प्रवाह हुड में स्थानांतरित करने के लिए पूर्व के बाद ट्यूब साफ कर लें.
  5. लामिना का प्रवाह हुड में यह प्रक्रिया पूरा हो गया है. 70 माइक्रोन जाल फिल्टर के माध्यम से पच जिगर लुगदी तनाव एक बाँझ पकवान में इकट्ठा करने के लिए. बाँझ DMEM के 2 मिलीलीटर aliquots का उपयोग: 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ F12 मीडिया, फिल्टर कुल्ला और फिल्टर के माध्यम से पच लुगदी मैश के एक सिरिंज सवार के अंत रबर का उपयोग करें. 5 बार दोहराएँ छानना लगभग 20 एमएल की कुल मात्रा. छानना 2 बराबर 15 एमएल ट्यूबों में विभाजित करते हैं.
  6. सभी स्थानान्तरण ला में पूरा किया जाना चाहिएमीनार प्रवाह हुड, और 4 डिग्री सेल्सियस पर अगर उपलब्ध प्रशीतित अपकेंद्रित्र का उपयोग करें. 1 मिनट के लिए 50 XG पर अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला # 1 सहेजें और parenchymal गोली त्यागें. तैरनेवाला 1 मिनट के लिए 50 XG पर अपकेंद्रित्र # 1. # 2 तैरनेवाला सहेजें और गोली त्यागें. 1 मिनट के लिए 50 XG # 2 तैरनेवाला अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला # 3 सहेजें और गोली त्यागें. अंतिम 8 मिनट के लिए सतह पर तैरनेवाला 180 XG लिए 3 गैर parenchymal अंश प्राप्त अपकेंद्रित्र.

2. लाल सेल

लामिना का प्रवाह हुड में काम करने के लिए, कोशिकाओं ठंडा रखने के लिए, और समाधान का उपयोग करें 4 ठंडा करने के लिए डिग्री सेल्सियस

  1. प्रक्रिया से पहले रात, 10X एकाग्रता स्टॉक BD फार्म बाँझ आसुत जल के साथ एक 1:10 कमजोर पड़ने के साथ बफर lyse गिराए द्वारा लाल सेल lysis बफर तैयार करते हैं. 1X 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 दिनों के लिए भंडारित किया जा solutionshould
  2. प्रक्रिया से पहले रात Miltenyi बफर का उपयोग कर बाँझ पीबीएस, 0.5% गोजातीय सीरम albumin, और 2mm EDTA तैयार. फ़िल्टर वैक्यूम फिल्टर का उपयोग कर समाधान0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ इकाई. मूल प्लास्टिक के ढक्कन के साथ कवर tilter इकाई के शीर्ष और प्लास्टिक की चादर के साथ सुरक्षित है. Storeentire 4 फिल्टर यूनिट ° सी degas EDTA से 12 घंटे के लिए. फ़िल्टर इकाई 12 घंटे के बाद मानक बाँझ टोपी के साथ बदला जा सकता है.
  3. लामिना का प्रवाह हुड में यह प्रक्रिया पूरा हो गया है. एक 5 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब का प्रयोग, ऊपर 1.6 कदम से 2.1 ऊपर से 1X पतला लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 1 एमएल में गैर parenchymal गोली फिर से स्थगित कर देते हैं. लामिना का प्रवाह हुड के बाहर स्थानांतरण के लिए ट्यूब टोपी.
  4. धीरे 5seconds और 4 पर 15 मिनट के लिए सेते के लिए भंवर ° C प्रकाश से रक्षा की.
  5. 5 मिनट के लिए 200 XG अपकेंद्रित्र.
  6. लामिना का प्रवाह हुड में यह प्रक्रिया पूरा हो गया है. तैरनेवाला में lysed RBCs त्यागें, और फिर से स्थगित 1 मिलीग्राम ठंडा और बाँझ Miltenyi बफर में गोली.
  7. 5 मिनट के लिए 200 XG अपकेंद्रित्र.
  8. लामिना का प्रवाह हुड में यह प्रक्रिया पूरा हो गया है. तैरनेवाला त्यागें और 1 मिलीग्राम ठंडा और बाँझ में फिर से को निलंबित गोलीMiltenyi बफर.
  9. पीबीएस सेल निलंबन के 10 μl निकालें और 10 μl tryan नीले रंग जोड़ें. Remainingnon parenchymal कोशिकाओं की गणना hemocytometer का उपयोग कर.

3. CD45 गैर parenchymal अंश से hematopoietic सेल रिक्तीकरण

लामिना का प्रवाह हुड में काम करने के लिए, कोशिकाओं ठंडा रखने के लिए, और समाधान का उपयोग करें 4 ठंडा करने के लिए डिग्री सेल्सियस

  1. Miltenyi 107 कोशिकाओं प्रति 108 कुल कोशिकाओं के लिए बफर के 100 μL में कोशिकाओं निलंबित.
  2. प्रत्येक 107 कोशिकाओं के लिए 20 μL Miltenyi CD45 microbead एंटीबॉडी लागू करें और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. अतिरिक्त 2 मिलीलीटर Miltenyi बफर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 200 XG अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला निकालें. 1 मिलीलीटर Miltenyi बफर में सेल गोली (अप करने के लिए 108 कुल कोशिकाओं) को स्थगित कर देते हैं.
  4. लामिना का प्रवाह हुड में, फिल्टर का कोशिकाओं Miltenyi LD चुंबकीय स्तंभ का उपयोग कर. चुंबकीय धारक (Miltenyi MidiMACS या QuadroMACS) में स्तंभ रखने के द्वारा शुरू करो. बाँझ 5 मिलीलीटर ट्यूब नीचे जगह फिल्टर छानना को पकड़ने के. 2 मिलीलीटर Milte लोड करके स्तंभ तैयारNYI बफर.
  5. एक बार पूर्व फिल्टर धोने पूरा हो गया है, LD स्तंभ पर कोशिकाओं लोड. एक बार सेल निलंबन स्तंभ के भीतर है, 1 मिलीलीटर Miltenyi बफर जोड़ने और फिर 1 मिलीलीटर Miltenyi बफर 2 अतिरिक्त बार धोने. छानने का काम की गति को बढ़ाने के लिए स्तंभ के साथ प्रदान करने के लिए सवार नहीं का उपयोग करें. केवल छानना है जब चुंबकीय धारक में फिल्टर में रखा इकट्ठा.
  6. 5 मिनट के लिए 200 XG पर एकत्र लगभग 5 मिलीलीटर की CD45 समाप्त गैर parenchymal कोशिकाओं (स्तंभ शेष 1 मिलीग्राम धारण) छानना अपकेंद्रित्र. बनाए रखा CD45 पॉजिटिव कोशिकाओं के साथ स्तंभ छोड़ें.

4. CD133 सकारात्मक कोशिकाओं का प्रवाह cytometry अलगाव

  1. अंडाकार सेल मीडिया तैयार. 10% गर्मी निष्क्रिय आधार के रूप में भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ F12, मध्यम और इंसुलिन (1 ग्राम / मिली) जोड़ने के लिए, HEPES (5 mol / एल), और पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1% मात्रा / मात्रा): 01:01 DMEM का प्रयोग करें. फ़िल्टर 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ वैक्यूम फिल्टर इकाई का उपयोग कर समाधान.
  2. 100 μ में पुनः स्थगित Miltenyi बफर में कोशिकाओं10 7 कोशिकाओं प्रति एल. CD133 पीई संयुग्मित एंटीबॉडी के 2 μL जोड़ें. कोशिकाओं के एक दूसरे समूह का प्रयोग, आईजीजी पीई एक नियंत्रण के रूप में संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ सेते हैं. FACS के लिए एक अस्थिर नियंत्रण के रूप में धुंधला बिना कोशिकाओं का एक तीसरा समूह बनाये रखें.
  3. अंधेरे में 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. 2 मिलीलीटर धुंधला हो जाना बफर में पुनः स्थगित कर देते हैं. 5 मिनट के लिए 200 XG अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला त्यागें और 1 मिलीलीटर Miltenyi बफर में फिर से को निलंबित गोली.
  4. यह कदम मानक प्रवाह cytometry सेल छँटाई प्रक्रियाओं, जो संस्था के विशिष्ट हो सकता है का उपयोग किया जाता है. अस्थिर कोशिकाओं और आईजीजी पीई दाग कोशिकाओं का उपयोग, CD133 + सेल की आबादी के लिए अनुकूलित gating के लिए मानकों छँटाई समायोजित करें. पीई (R-Phytoerythrin) आम तौर पर किसी भी प्रवाह cytometer कि एक लेजर है कि 488 एनएम पर उत्सर्जन करता है के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. पीई के लिए चोटी उत्सर्जन 575 एनएम और FL-2 चैनल में पाया.

    नोट: एक बी.डी. FACS Calibur या बी.डी. FACS सहूलियत मशीनों का उपयोग, डेटा संग्रह के लिए सेल क्वेस्ट कार्यक्रम के साथ, हम आगे का उपयोग करें Scatter और साइड लॉग पैमाने में तितर बितर दृश्य सेल आबादी की पहचान करने के लिए, 250 करने के लिए सेट की ओर तितर बितर साथ. FL1 और FL2 दोनों लॉग पैमाने में और 550 करने के लिए सेट कर रहे हैं. इन मानकों को एक प्रारंभिक शुरू करने के लिए गैर parenchymal जिगर कोशिकाओं को देखने के लिए जगह प्रदान करते हैं, और समायोजित के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक आबादी की तीव्रता धुंधला के आधार पर की जरूरत है.
  5. CD133 + कोशिकाओं CD133 + फाटक का उपयोग आबादी अलग और बाँझ फ़िल्टर्ड कोशिका मीडिया में कोशिकाओं को इकट्ठा.

5. सेल संस्कृति तरीकों

  1. 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र FACS कोशिकाओं एकत्र की. अंडाकार सेल मीडिया में लगभग 5000 मिलीग्राम प्रति कोशिकाओं के साथ सेल गोली को स्थगित कर देते हैं. उच्च सांद्रता, 50,000 कोशिकाओं / प्रारंभिक प्रयोगों के लिए मिलीलीटर के साथ शुरू कर सकते हैं और कम करने के रूप में इस तकनीक में सुधार और समग्र सेल व्यवहार्यता और उपज में सुधार.
  2. BD Biocoat laminin पर प्लेट कोशिकाओं साथ 96 1000 कोशिकाओं / 2 सेमी का उपयोग कर प्लेटें लेपित. Humidified सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ, प्लेस. 24 घंटे बाद, Hepatocyte ग्रोथ फैक्टर (50 एनजी / nl) और Epidermal विकास फैक्टर (20 एनजी / एमएल) जोड़ने.
  3. एकल कक्षों के लिए, सीधे कोशिकाओं को अलग एक साथ 96 laminin लेपित प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह अंडाकार सेल मीडिया के 50 μl में. एक सकारात्मक केवल सेल की कड़ी चयन के लिए एकल कक्ष FACS सेटिंग्स का उपयोग करें. 24 घंटे बाद, HGF और EGF साथ अंडाकार सेल मीडिया के 50 μl जोड़ने के ऊपर 5.2 चरण में के रूप में. 5-7 दिनों के बाद पूरी तरह से मीडिया को बदलें.
  4. एक बार कालोनियों के विस्तार के 50% मिला हुआ है, जो आम तौर पर दो सप्ताह के बाद होता है, कोशिकाओं को चढ़ाया और सेल व्यवहार्यता की कुल संख्या पर निर्भर करता है की तुलना में अधिक हैं, कोशिकाओं नीचे के रूप में किया जा 01:03 विभाजित कर सकते हैं.
  5. भाजित ट्रिप्सिन 0.05% EDTA कोशिकाओं का उपयोग कर. बस अच्छी तरह से नीचे कवर करने के लिए पर्याप्त नहीं है, 50-100 μL / 96 पर अच्छी तरह से अच्छी तरह से थाली लागू. इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए रखें.
  6. एक अच्छी तरह से मीडिया के 100 μL जोड़ें और 5 मिलीग्राम ट्यूब सभी तरल हस्तांतरण. प्रत्येक और 5 मिनट के लिए 200 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र 1 एमएल मीडिया जोड़ें.
  7. मैं मीडिया थाली में पुनः को निलंबित कोशिकाओंn laminin लेपित पकवान, 3 नए कुओं (01:03 अनुपात) में 1 अच्छी तरह से कोशिकाओं की थाली के लिए उपयोग कर.

6. द्वि - संभावित स्थिति की पुष्टि RT-पीसीआर का उपयोग

इस प्रक्रिया RNeasy प्रोटोकॉल पुस्तिका है, जो RNeasy किट के साथ आपूर्ति की है में विस्तृत है.

  1. RNeasy सूक्ष्म कॉलम 96 अच्छी तरह से थाली कालोनियों के लिए प्रयोग करें. प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति मीडिया Aspirate. 75 μl बफर RLT (RNeasy किट से) सीधे एक अच्छी तरह से जोड़ें. बाँझ रबर पुलिसकर्मी के साथ थाली नीचे परिमार्जन. 1 मिनट के लिए सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब और भंवर मिश्रण में Pipettelysate. Lysates 70% इथेनॉल जोडें और pipetting द्वारा मिश्रण.
  2. 10,000 rpm पर 15 सेकंड के लिए 2 मिलीलीटर संग्रह (RNeasy किट में आपूर्ति) ट्यूब और सूक्ष्म अपकेंद्रित्र में अपकेंद्रित्र में रखा RNeasy स्तंभ समाधान स्थानांतरण. Eluted छानना त्यागें.
  3. संग्रह ट्यूब का उपयोग करें. RNeasy स्तंभ और 15 सेकंड के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र जोड़ें 350 μL बफर RW1 (RNeasy किट) करने के लिए स्तंभ धोनेझिल्ली. Eluted धोने त्यागें.
  4. 10 μL DNase मैं शेयर 70 μL बफर RDD (दोनों RNeasy किट में) की आपूर्ति करने के लिए समाधान RNeasy स्तंभ झिल्ली और सेते कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 80 μL DNase मैं बफर RDD ऊष्मायन मिश्रण जोड़ें. जोड़ें.
  5. RNeasy स्तंभ और अपकेंद्रित्र 10,000 rpm पर 15 सेकंड के लिए 350 μL बफर RW1 (RNeasy किट) जोड़ें झिल्ली धो लो. Eluted धोने और संग्रह ट्यूब त्यागें.
  6. RNeasy स्तंभ एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब (RNeasy किट में आपूर्ति) में रखें. RNeasy स्तंभ और अपकेंद्रित्र 10,000 rpm पर 15 सेकंड के लिए 500 μL बफर RPE (RNeasy किट) जोड़ें झिल्ली धो लो. Eluted धोने त्यागें.
  7. 80% इथेनॉल तैयार RNase मुफ्त पानी (RNeasy किट) का उपयोग. 2 मिनट के लिए 10,000 rpm पर RNeasy columnand अपकेंद्रित्र 80% इथेनॉल के 500 μL जोड़ें. Eluted धोने त्यागें.
  8. एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह (RNeasy किट) ट्यूब और 5 मिनट के लिए पूरी गति पर अपकेंद्रित्र में RNeasy स्तंभ रखें. किसी भी eluted धोने और कर्नल छोड़ेंरूपांतर ट्यूब.
  9. एक नया 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब (RNeasy किट) में RNeasy स्तंभ रखें. पूरी रफ्तार से 1 मिनट के लिए स्तंभ झिल्ली और अपकेंद्रित्र के केंद्र से 14 μL RNase मुक्त पानी (RNeasy किट) जोड़ें. शुद्ध शाही सेना के साथ छानना ले लीजिए और बर्फ के लिए स्थानांतरण अगर सीडीएनए तुरंत या दुकान शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए बनाने.
  10. रिवर्स प्रतिलेखन ठंडा 1x बफर RT में 10 इकाइयों / μL के अंतिम एकाग्रता Omniscript.Dilute RNase अवरोध करनेवाला का उपयोग. 5 सेकंड, और 5 सेकंड के लिए पल्स अपकेंद्रित्र के लिए भंवर. बर्फ पर Omniscript प्रोटोकॉल के 13 पेज के अनुसार एक ताजा मास्टर मिश्रण तैयार करें. 5 सेकंड, और 5 सेकंड के लिए पल्स अपकेंद्रित्र के लिए भंवर. Mastermix की मात्रा 10% सभी प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक कुल के लिए आवश्यक है कि अधिक से अधिक तैयार करने की सिफारिश.
  11. व्यक्तिगत मास्टर मिश्रण युक्त ट्यूबों टेम्पलेट शाही सेना जोड़ें. 5 सेकंड, और 5 सेकंड के लिए पल्स अपकेंद्रित्र के लिए भंवर. 37 पर 60 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
  12. Hepatocyte पीसीआर प्रवर्धन(Albumin) और cholangiocyte विशिष्ट जीन HotStarTaq डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग. HotStarTaq प्रोटोकॉल पुस्तक के पृष्ठ 15 प्रति प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें. 20 बजे / μl की एकाग्रता के लिए स्टॉक प्राइमरों गिराए विग्यापन, और 1 ट्यूब / μL प्रतिक्रिया के साथ आगे और रिवर्स प्राइमरों के लिए इस्तेमाल किया. शाही सेना निष्कर्षण के लिए शुरू में इस्तेमाल किया कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है, हम 3 प्रतिक्रिया ट्यूब (नियंत्रण लोड, Albumin, और KRT19 लिए β-actin) शुरू करने के लिए के बीच अंतिम सीडीएनए विभाजित करने की सलाह देते हैं.
  13. प्राइमर पीसीआर डिजाइन तालिका 1 में सूचीबद्ध है.
  14. Thermocycler में प्रतिक्रिया ट्यूब प्लेस. प्रारंभिक प्रयोगों के लिए निम्नलिखित कार्यक्रम सिफारिश: 95 ° Cfor 15 मिनट x 1 95 द्वारा पीछा चक्र ° सी 30 सेकंड के लिए, 55 ° 30 सेकंड के लिए सी, 72 ° सी 30 सेकंड के लिए x 35 चक्र, 72 द्वारा पीछा ° सी 10 मिनट के लिए.
  15. पीसीआर उत्पादों ethidium ब्रोमाइड गर्भवती agarose जेल का उपयोग का विश्लेषण कर रहे हैं.

7. CD133 + स्टेम कोशिकाओं का ट्यूमर क्षमता की पुष्टि

  1. यह प्रक्रिया कर सकते हैंहौसले से 4 कदम या कोशिकाओं है कि 5 कदम से संवर्धित किया गया है का उपयोग कर से अलग कक्षों के साथ किया जा सकता है. हम संवर्धित कोशिकाओं के साथ प्रारंभिक प्रयोगों प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं, के रूप में हौसले से अलग कक्षों व्यवहार्यता और कम उपज को कम कर दिया जाएगा.
  2. ऊपर 5.5 कदम से ट्रिप्सिन 0.05% EDTA का उपयोग कोशिकाओं Trypsinize. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट ऊष्मायन के बाद, एक अच्छी तरह से मीडिया के 100 μL जोड़ने और प्रत्येक में अच्छी तरह से व्यक्तिगत 5 मिलीलीटर ट्यूब (1 अच्छी तरह = 1 ट्यूब) के सभी तरल हस्तांतरण. प्रत्येक और 5 मिनट के लिए 200 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र 1 मिलीग्राम मीडिया जोड़ें.
  3. 1 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस में कोशिकाओं को स्थगित कर देते हैं. पीबीएस सेल निलंबन के 10 μl निकालें और 10 μl trypan नीले रंग जोड़ें. Trypan नीले अपवर्जन का प्रयोग, जीवित कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण करते हैं. FACS अलग कोशिकाओं का उपयोग अगर, सेल नंबर FACS अलगाव गिनती द्वारा निर्धारित किया जाएगा.
  4. 200 XG पर कोशिकाओं और 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र पीबीएस में 1 एक्स 10 6 रहते cells/100 μl के एक एकाग्रता में फिर से निलंबित कर दिया. 100 μl Matrigel जोड़ें. छह सप्ताह पुरानी प्रतिरक्षा कमी NUDई subcutaneously 28 gague सुई का प्रयोग चूहों अंतःक्षिप्त थे. साइट प्रति 200 μl में 1 x 10 6 कोशिकाओं इंजेक्षन.
  5. चूहे ट्यूमर के विकास के लिए दैनिक निगरानी कर रहे हैं. एक बार ट्यूमर ऊष्मायन के बाद आम तौर पर 3-4 सप्ताह के रूप में, ट्यूमर मात्रा कैलिपरस (ऊंचाई x लंबाई x चौड़ाई) का उपयोग कर मापा जाता है.

8. प्रतिनिधि परिणाम:

सामान्य, स्वस्थ murine जिगर से, CD133 + जिगर स्टेम कोशिकाओं की उम्मीद सेलुलर उपज 1,000 जिगर प्रति 5,000 है. इन कोशिकाओं को अपेक्षाकृत मौन जिगर में दुर्लभ हैं और संस्कृति में अच्छी तरह से नहीं विस्तार होगा. हम सामान्य जिगर और व्यवहार्य कोशिकाओं है कि विस्तार होगा की उपज बहुत कम है पर एकल कोशिका विश्लेषण का उपयोग करने की सिफारिश नहीं है.

/ - या जिगर विशिष्ट Pten / - चूहों, 2-4 cel की उम्मीद की संख्या महत्वपूर्ण पुरानी चोट के साथ 6 1 सप्ताह या आनुवंशिक पुरानी चोट में जिसके परिणामस्वरूप MAT1a के रूप में, संशोधन के लिए डीडीसी 0.1% आहार के रूप में यकृत,रास 100.000 पृथक जिगर / (2 चित्रा) कोशिकाओं को बढ़ जाती है, के साथ अलग. यदि आनुवंशिक मॉडल का उपयोग कर, सहज ट्यूमर दर का ज्ञान महत्वपूर्ण है, क्योंकि जिगर स्टेम सेल अलगाव के लिए इन प्रक्रियाओं ट्यूमर मुक्त जानवरों में आयोजित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, MAT1a अगर - / - मॉडल 18 महीनों में सहज ट्यूमर रूपों, हम जानवरों का उपयोग नहीं 15-16 महीने की तुलना में बाद में की सलाह देते हैं किसी भी रिपोर्ट सहज ट्यूमर के लिए पहले.

पुरानी चोट मॉडल से एकल कक्षों के अलगाव कई कालोनियों कि एकल कक्षों से विस्तार एक बार प्रक्रिया में महारत हासिल है, और सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित किया जाता है (3-9 colonies/96 अच्छी तरह से थाली) निकलेगा. 3 वर्तमान एकल CD133 + कोशिकाओं को 7 दिनों के बाद विस्तार से प्राप्त कालोनियों के प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों चित्रा.

द्वि - संभावित स्थिति की पुष्टि Albumin और Krt19 RT-पीसीआर का उपयोग किया जाता है. विस्तारित एकल कक्षों से कालोनियों hepatocytes के मार्कर के लिए दोनों अभिव्यक्ति का प्रदर्शन (अल) bumin और cholangiocytes (Krt19). चित्रा 4 7 दिनों में लगभग 25 / कॉलोनी कोशिकाओं के साथ तीन अलग कालोनियों से द्वि - संभावित अभिव्यक्ति को दर्शाता है.

CD133 + सामान्य जिगर और रासायनिक प्रेरित जिगर चोट (जैसे डीडीसी 6 सप्ताह के लिए 0.1% आहार) से स्टेम कोशिकाओं ट्यूमर नग्न चूहों में नहीं बनेगी. CD133 + विशिष्ट आनुवंशिक मॉडल से स्टेम कोशिकाओं (MAT1a - / - जिगर या विशिष्ट Pten - / - चूहों) नग्न चूहों में ट्यूमर के रूप में अगर देर पूर्व ट्यूमर पुरानी चोट चरण में देर से पृथक है. यह ट्यूमर गठन phenotype वर्तमान में एक कैंसर स्टेम सेल के रूप में पहचान की है, उदाहरण के लिए 2-4, MAT1a / - चूहों की उम्र के 18 सप्ताह में सहज जिगर ट्यूमर के रूप में. CD133 + जिगर जिगर की बीमारी के एक देर पुरानी चोट चरण के दौरान 15-16 सप्ताह में अलग - थलग स्टेम कोशिकाओं, नग्न चूहों में ट्यूमर बनेगी. चित्रा 5 1 x 10 एकल CD133 + जिगर स्टेम सेल से 6 इन विट्रो में विस्तार कोशिकाओं के द्विपक्षीय इंजेक्शन से प्रतिनिधि ट्यूमर को दर्शाता हैहै.

जीन फॉरवर्ड प्राइमर प्राइमर रिवर्स
β-actin 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 '
अन्नसार 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 '
19 केरातिन 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 '

तालिका 1: RT-पीसीआर के लिए प्राइमर डिजाइन

चित्रा 1
चित्रा 1: तरीकों के कुल मिलाकर योजनाबद्ध.

चित्रा 2
चित्रा 2: CD133 + जिगर स्टेम अत्यधिक समृद्ध CD45 समाप्त गैर parenchymal अंश में पहचान जंगली प्रकार से नियंत्रण रिहाई जिगर की कोशिकाओं. चूहों अत्यधिक समृद्ध CD45 समाप्त गैर parenchymal अंश के भीतर 0.4% CD133 + कोशिकाओं को दर्शाता है. दस्तक बाहर आनुवंशिक MAT1a - / -, जो जीर्ण जिगर की चोट के एक मॉडल है, CD133 जनसंख्या 10 गुना या एक ही अत्यधिक समृद्ध अंश में अधिक फैलता है.

चित्रा 3
चित्रा 3: एकल CD133 + क्लोन से कालोनियों के विस्तार चार एकल CD133 + कोशिकाओं laminin लेपित साथ 96 प्लेटों पर विस्तार से निकाली गई कालोनियों के चरण विपरीत छवियों.

चित्रा 4
चित्रा 4: द्विपक्षीय संभावित जीन की अभिव्यक्ति से CD133 + जिगर स्टेम clonally का विस्तार कालोनियों 7 दिन सेल, लगभग 25 कालोनियों कोशिकाओं रहे हैं. जीन अभिव्यक्ति hepatocyte मार्कर Albumin और cholangiocyte Krt19 मार्कर की अभिव्यक्ति को दर्शाता है, द्वि - संभावित CD133 + कोशिकाओं की स्थिति की पुष्टि की.

"ve_content> चित्रा 5
चित्रा 5: CD133 + जिगर स्टेम कोशिकाओं नग्न चूहों में ट्यूमर के रूप में तीर 1x10 6 CD133 + MAT1a से इंजेक्शन कोशिकाओं के बाद 4 सप्ताह बढ़ ट्यूमर से संकेत मिलता है - / - मॉडल. CD133 + विष प्रेरित जीर्ण जिगर की चोट से सीसीएल 4 या 0.1% डीडीसी आहार के रूप में, कोशिकाओं, ट्यूमर फार्म नहीं है. ट्यूमर गठन के लिए घातक क्षमता, स्टेम सेल आबादी के भीतर या कैंसर स्टेम सेल phenotype की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

Discussion

Hematopoietic प्रणाली के विपरीत है, जो hematopoietic स्टेम सेल एक सेलुलर भेदभाव की प्रणाली को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार हैं कि replacesnormal शारीरिक बारी पर leukocytes, लाल रक्त कोशिकाओं, और प्लेटलेट्स, जिगर स्टेम सेल, या वयस्क जिगर पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के सामान्य जिगर में नहीं भाग ले सकता हूं homeostasis. 5,6 विभेदित जिगर उपकला के रूप में तीव्र जिगर चोट या आंशिक hepatectomy, hepatocytes, के बाद प्रसार के कई दौर से गुजरना खो जिगर जन की जगह पुरानी चोट के दौरान. 5,6 केवल जिगर स्टेम कोशिकाओं मनाया पैदा करना. 1,5 -11 ये वयस्क, अंग विशेष स्टेम कोशिकाओं प्रस्तावित कर रहे हैं दोनों hepatocytes और cholangiocytes में अंतर 1,5-8 दिलचस्प है, यकृत कैंसर के विशाल बहुमत पुरानी चोट की पृष्ठभूमि पर विकसित है, और इस प्रकार जिगर स्टेम कोशिकाओं को भी हो धारणा जिगर के कैंसर का एक सबसेट के लिए व्यापारियों 2-4,12-17.

हेप्रमुख जिगर में स्टेम सेल काम करने की चुनौतियों के पूर्वोत्तर कार्यात्मक विश्लेषण के लिए कक्षों की दुर्लभ आबादी के अलगाव है. उदाहरण के लिए, जिगर में कोशिकाओं के विशाल बहुमत hepatocytes, जो काफी cholangiocytes और अन्य छोटे गैर parenchymal कोशिकाओं की तुलना में बड़े होते हैं. सेल (parenchymal अंश और छोटी कोशिकाओं - बड़े hepatocytes गैर parenchymal अंश) डिब्बों में पूरे जिगर तोड़ने, और आगे CD45 नकारात्मक कोशिकाओं (गैर hematopoietic कोशिकाओं) के लिए चयन, हम करने के लिए स्टेम सेल के शुरू जनसंख्या को समृद्ध करने में सक्षम हैं 600 गुना से अधिक 1,18-21 ध्यान से, हम कोई संकेत है कि CD133 + जनसंख्या एक 100% शुद्ध स्टेम सेल की आबादी है, लेकिन स्पष्ट रूप से अलग वंश और repopulation क्षमता के साथ कोशिकाओं के एक विषम आबादी का प्रतिनिधित्व करता है, के माध्यम से कर रहे हैं. क्षेत्र की प्रमुख सीमाओं की स्टेम कोशिकाओं और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की परिभाषा है. हम शब्द "स्टेम सेल" अधिक मोटे तौर पर इस काम में उपयोग करते हैं, लेकिन सख्त परिभाषा में CD133 + गैर parenchymal कोशिकाओं को एक द्वि - वंश पूर्वज आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं. वर्तमान और जिगर में पूर्वज अनुसंधान स्टेम की स्थिति को देखते हुए, इस रिपोर्ट जांचकर्ताओं जो इस क्षेत्र में रुचि रखते हैं के लिए एक प्रारंभिक जगह प्रदान करता है. के रूप में नए मार्करों EpCAM, 22,23 या Sox9 के रूप में प्रतिलेखन कारकों, 24 के रूप में उभरने, वे शामिल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम EpCAM + कोशिकाओं और CD133 + कोशिकाओं के बीच एक ओवरलैप का काफी उच्च दर पाया है.

इस रिपोर्ट में, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सामान्य murine जिगर जीर्ण जिगर चोट मॉडल है, जो जिगर स्टेम सेल प्रसार बढ़ दिखाना है से स्टेम सेल अलगाव के लिए हम एक प्रक्रिया विस्तार. इस पद्धति जमी या formalin निश्चित जिगर के मानक immunohistochemistry पर स्पष्ट लाभ के रूप में कार्य जीवित कोशिकाओं का उपयोग करते हुए अध्ययन के अलगाव के बाद किया जा सकता है 1,3,4 इस प्रक्रिया के विशिष्ट लक्ष्य जिगर स्टेम सेल कि कर सकते हैं की एक अपेक्षाकृत शुद्ध आबादी अलग जा clonally इन विट्रो में विस्तार किया गया है.

इस प्रक्रिया के लिए विकल्प मीटर शामिलकिसी भी वैकल्पिक ऐसे CD49f, EpCAM के रूप में सेल सतह मार्कर, या इस तरह के रूप में मार्कर के संयोजन के लिए odification CD133 + EpCAM + एक दूसरे प्रकाशित रिपोर्ट एक घनत्व ढाल का इस्तेमाल करने के लिए एक गैर parenchymal अंश से जिगर स्टेम कोशिकाओं को अलग. यह प्रक्रिया एक अपकेंद्रित्र अल्ट्रा (8000 XG) की आवश्यकता है, प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण समय कहते हैं, और हमारे अनुभव में, काफी पूर्व FACS सेलुलर और उपज के बाद FACS व्यवहार्यता कम 8.

भविष्य प्रयोगों जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की एक व्यापक रेंज सहित भ्रूण जिगर ऐसे HNF3, HNF4α के रूप में जीन और αfp.In इसके अलावा, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण और व्यक्त प्रोटीन की immunocytochemistry संस्कृति में कोशिकाओं की RT-पीसीआर परिणामों की पुष्टि करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, शामिल हैं.

एक नोट को मुद्दा हाल ही में काम यकृत तारामय कोशिकाओं पर CD133 अभिव्यक्ति की पहचान 25 अब हम नियमित तारामय कोशिकाओं के मार्कर (मुसीबत शूटिंग अनुभाग देखें) के लिए हमारे नमूने स्क्रीन, और आईडी नहीं हैहमारे भागों में महत्वपूर्ण संदूषण entified. यह जिगर पाचन और सेल अलगाव की विभिन्न तकनीकों 2,3,26 से संबंधित हो सकता है

तथ्य यह है कि कोशिकाओं के बहुमत FACS अलगाव के तुरंत बाद व्यवहार्य नहीं होगा पर आधारित है, हम अनुशंसा करते हैं कि कोशिकाओं चढ़ाया हुआ हो, या तो थोक CD133 + कोशिकाओं या एकल कक्षों के रूप में, पूर्व पशुओं में उपयोग. इन विट्रो में 5-7 दिनों में काफी ट्यूमर के विश्लेषण के परिणामों में सुधार होगा. इसके अलावा, एकल कोशिका अलगाव की कठोरता दिया, यह केवल एक बार कालोनियों थोक CD133 अलग कक्षों से विस्तारित किया जा सकता है आयोजित किया जाना चाहिए. विभिन्न संस्कृति शर्तों और पाड़ प्रोटीन है जो संस्कृति जिगर स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए उपयोग किया जा सकता है की एक और अधिक गहन चर्चा अच्छी तरह से किया गया है लोला रीड द्वारा विशेषता है. यह काम वैकल्पिक शर्तों और संशोधनों प्रदान करता है, जो जांचकर्ताओं उनके अनुसंधान कार्यक्रम में शामिल एक बार बुनियादी अलगाव तकनीक में महारत हासिल कर रहे हैं हो सकता है 27,28 डॉ.. रीड worकश्मीर भी वंश और यकृत स्टेम कोशिकाओं और प्रतिबद्ध progenitors के बीच जीव विज्ञान परिपक्वता के एक अधिक विस्तृत विश्लेषण प्रदान करता है.

Vivo ट्यूमर विश्लेषण में संदर्भ में, हम सफलता मिली है clonally का विस्तार CD133 + कोशिकाओं से हौसले से अलग कोशिकाओं और कोशिकाओं का उपयोग करते हुए इन विट्रो में, मुख्य रूप से 1x10 6 कोशिकाओं का उपयोग. / - और जिगर विशिष्ट Pten / हम जीर्ण जिगर की चोट के ontwo आनुवंशिक उपभेदों MAT1a ध्यान केंद्रित किया है, चूहों और हम दोनों नग्न चूहों और ट्यूमर के विकास के लिए मेजबान के रूप में जंगली प्रकार चूहों का उपयोग किया है. हमारे अनुभव में, केवल CD133 + जिगर स्टेम कोशिकाओं ट्यूमर फार्म अगर वे महत्वपूर्ण जिगर चोट मॉडल है कि पूर्व घातक हैं से अलग कर रहे हैं. 2-4,29 कि CD133 से गठित ट्यूमर + कोशिकाओं सामान्य दोनों hepatocellular कार्सिनोमा और cholangiocarcinoma सुविधाओं, ट्यूमर के लिए एक स्टेम सेल या पूर्वज सेल मूल का सुझाव दे.

ट्यूमर के बाद काम अनुवर्ती inclu प्रलेखित रहे हैंdes मानक ट्यूमर ऊतक के वैकृत विश्लेषण (धुंधला हो जाना और एच ई) और immunohistochemical धुंधला हो जाना. इसके अलावा, ट्यूमर और कीमा बनाया हुआ जा सकता है FACS विश्लेषण या फिर संस्कृति के लिए पचा 2-4,30.

अंत में, हम अलगाव, विस्तार, + CD133 जिगर स्टेम कोशिकाओं और CD133 + कैंसर स्टेम कोशिकाओं की और बुनियादी लक्षण वर्णन के लिए एक प्रक्रिया का विस्तृत है.

मुसीबत शूटिंग:

CD45 संदूषण:

चरण 3 के लिए, अगर वहाँ CD45 + कोशिकाओं, जो एक CD45 FITC अब FACS विश्लेषण और अलगाव पहले जोड़कर मूल्यांकन किया जा सकता है के संदूषण है, जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि CD45 microbead एंटीबॉडी नहीं की समय सीमा समाप्त हो रहा है और छानना एकत्र किया गया था कि केवल जबकि फिल्टर चुंबकीय धारक में था. कोई छानना एकत्र चुंबकीय धारक CD45 + कोशिकाओं शामिल होंगे जबकि फिल्टर में नहीं है.

कम सेल नंबर:

रिहाई का जिगर, कुल numbeCD133 + r पृथक गैर parenchymal 10,000 से कम हो सकता है. ये कोशिकाओं मौन जिगर में दुर्लभ हैं. डीडीसी 0.1% आहार के रूप में एक पुरानी चोट मॉडल, के लिए, संख्या 100,000 कोशिकाओं को काफी वृद्धि होगी. यदि कुल सेल नंबर इन संख्या काफी नीचे है, एक मुद्दे पर विचार करने के लिए FACS अब धुंधला हो जाना है. जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि CD133 अब समाप्त नहीं हुई है, के रूप में गरीब धुंधला हो जाना एक गरीब उपज में परिणाम देगा. इसके अलावा, हम जिगर गैर parenchymal कोशिकाओं FACS विश्लेषण प्रदर्शन FACS अलगाव के लिए प्रयास करने के लिए रिश्तेदार आबादी पहले से निर्धारित करने की सलाह देते हैं.

FACS के बाद कम सेल व्यवहार्यता:

व्यवहार्यता के मुद्दों में से एक कैसे कोशिकाओं संसाधित कर रहे हैं से संबंधित हो सकता है और क्या समय से अधिक. आदर्श रूप में, पूरे सेल अलगाव प्रक्रिया, 1-4 कदम, कदम के बीच किसी भी देरी के बिना आयोजित किया जाना चाहिए और एक ही दिन में पूरा किया. 1-4 चरणों के बीच कोई महत्वपूर्ण देरी बहुत सेल व्यवहार्यता कम हो जाएगा. 2 ग के लिए संबंधित मुद्देपक्ष व्यवहार्यता म्यान FACS अलगाव के लिए इस्तेमाल किया दबाव से संबंधित हो सकता है. हम एक कम म्यान दबाव का उपयोग करने की सलाह देते हैं. अंत में, एक बार कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, वे तुरंत चढ़ाया हुआ हो सकता है, के रूप में छँटाई के बाद बर्फ पर किसी भी महत्वपूर्ण भंडारण भी व्यवहार्यता कम हो जाएगा चाहिए.

CD133 + parenchymal विजातिता गैर:

हाल की रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि यकृत तारामय कोशिकाओं भी CD133 अभिव्यक्ति हो सकता है और कुछ plasticity है कि 25 इसलिए, Albumin और Krt19, अतिरिक्त सत्यापन के साथ द्वि - शक्ति जीन की पुष्टि करने के अलावा तारामय कोशिकाओं के साथ जुड़े glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन जैसे जीन शामिल कर सकते हैं. मौन तारामय कोशिकाओं और अल्फा चिकनी पेशी actin और सक्रिय तारामय कोशिकाओं में desmin 3,4,26 इसके अलावा, CD133 + जनसंख्या एक व्यापक पूर्वज जनसंख्या का प्रतिनिधित्व करता है. EpCAM के रूप में एक दूसरे मार्कर, के अलावा जनसंख्या को संशोधित करने में मदद कर सकते हैं, और सीमा विजातिता.

Disclosures

डा. Rountree बायर फार्माक्युटिक्स से अनुसंधान का समर्थन प्राप्त है. डीआरएस. डिंग और बदमाश और सुश्री डांग और सुश्री VanKirk खुलासे रिपोर्ट नहीं है.

Acknowledgments

डा. Rountree बच्चों के चमत्कार नेटवर्क, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, K08DK080928 और R03DK088013, और अमेरिकन कैंसर सोसायटी रिसर्च स्कॉलर अवार्ड, MGO 11,651 से मौजूदा समर्थन को स्वीकार करता है. डॉ. Rountree मानता है कि इस प्रक्रिया के शुरू में और विकसित किया गया था परिष्कृत, जबकि बाल वैज्ञानिक विकास कार्यक्रम (NICHD का अनुदान पुरस्कार K12 - HD00850) द्वारा वित्त पोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM:F12 Invitrogen 10565-018 With phenol red
CD45 microbeads Miltenyi Biotec 130-052-301
Hepatocyte Growth Factor Sigma-Aldrich H1404
Epidermal Growth Factor Sigma-Aldrich E4127
DNase Sigma-Aldrich DN25 1 gram
Collagenase D Roche Group 1088874
Pronase Roche Group 0165921
70 micron mesh strainer Fisher Scientific 352350
Omniscript RT Qiagen 205111 50 reactions
HotStarTaq Qiagen 203203
Miltenyi LD column Miltenyi Biotec 130-042-901
CD133-PE FACS Ab eBioscience 12-1331-82
Laminin coated plates BD Biosciences 354410 96 well
Trypsin 0.05% EDTA Invitrogen 25300-354 100 mL
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 50 columns for 5x105 cells or less
Pharm Lyse BD Biosciences 555899 10X concentration

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References

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Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., VanKirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion. J. Vis. Exp. (56), e3183, doi:10.3791/3183 (2011).

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