Summary
A continuación se describe el aislamiento de CD133 que expresan las células madre del hígado y las células madre del cáncer de hígado en su totalidad murino, un proceso que requiere de digestión de los tejidos, el enriquecimiento celular y citometría de flujo aislamiento. Se incluyen métodos para el aislamiento avanzado de células individuales y la expansión clonal.
Abstract
Células madre del hígado, o células ovales, proliferan durante la lesión crónica del hígado, y se proponen de diferenciarse en hepatocitos y cholangiocytes. Además, las células madre del hígado son la hipótesis de que los precursores de un subgrupo de cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular. Uno de los principales desafíos para frenar el trabajo de células de cualquier órgano sólido como el hígado es el aislamiento de una población poco común de células para su análisis detallado. Por ejemplo, la gran mayoría de las células en el hígado son los hepatocitos (fracción de parénquima), que son significativamente mayores que las células no parenquimatosas. Enriqueciendo los compartimentos celulares específicos del hígado (es decir, del parénquima y las fracciones no parenquimatosas), y la selección de células CD45 negativas, que son capaces de enriquecer a la población a partir de células madre de más de 600 fold.The proceduresdetailed en este informe permiten una población relativamente raro de células de un órgano sólido que se ordenan de manera eficiente. Este proceso puede ser utilizado para las células madre del hígado isolateliver murino normal, así como la lesión hepática crónica modelos, que demuestran los tallos aumentó la proliferación de células del hígado. Este método tiene claras ventajas sobre técnicas de inmunohistoquímica estándar de hígado congelado o fijado en formol como los estudios funcionales utilizando células vivas se puede realizar después de la primera co-localización de los experimentos. Para llevar a cabo el procedimiento descrito en este informe, una relación de trabajo con una investigación basada en la citometría de flujo principal se recomienda que los detalles de aislamiento FACS son altamente dependientes de instrumentación especializada y un gran conocimiento práctico de la citometría de flujo básico procedimientos. El objetivo específico de este proceso consiste en aislar a una población de células madre del hígado que puede ser ampliado clonal in vitro.
Protocol
Todas las soluciones, los medios de comunicación, instrumentos, filtros y tubos deben ser estériles y manipularse con una técnica estéril para reducir el riesgo de contaminación. Prepare todos los tampones y los medios de comunicación 24 horas de antelación y almacenar a 4 ° C.
1. Separación del parénquima y no parénquima del hígado de todo
- Prepare la solución de enzimas para la digestión con un tubo de 15 cc con tapón de rosca de 10 ml de PBS estéril que contiene 5 mg de colagenasa, 5 pronasa mg y 1 mg DNAsa.
- Eutanasia ratón usando institución aprobada (Cuidado de Animales institucional y el empleo) como método de asfixia de CO 2. Limpie el área abdominal de los animales sacrificados con una solución de etanol al 70%. Utilizando instrumentos estériles, de la cavidad abdominal abierta y el hígado explante en bloque. Quitar la vesícula biliar del hígado explantado. Transferencia de hígado en su totalidad a la campana de flujo laminar en un molde cerrado estéril.
- Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. Usando una hoja de afeitar estéril, carne picada de hígado con una combinación de varios cortes horizontales y verticales durante 1 minuto en una fuente estéril. Colocar ¼ de pulpa de hígado picado en el tubo de 15 cc con 10 cc de PBS con colagenasa, pronasa, ADNasa y desde el paso 1.1. Repita el procedimiento con cada uno de hígado picado ¼.
- Se colocan los tubos de pasta de hígado picado ¼ y de las enzimas en el baño de agua a 37 ° C durante 45 minutos, con agitación a 1-2 ciclos / segundo. Limpie los tubos con etanol al 70% después de la eliminación del baño de agua antes de la transferencia de campana de flujo laminar.
- Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. Cuele la pulpa digerida del hígado a través de 70 micras de malla del filtro para recoger en un recipiente estéril. Utilizando alícuotas de 2 ml de DMEM estéril: los medios de comunicación F12 con 10% inactivado por calor suero fetal bovino, lavar el filtro y el uso final de goma de un émbolo de la jeringa para triturar la pulpa digerida a través del filtro. Repita 5 veces para que el volumen total de aproximadamente 20 ml de filtrado. Dividir el filtrado en dos tubos iguales de 15 ml.
- Todas las transferencias deben ser completado en campana de flujo laminar, y el uso de centrífuga refrigerada a 4 ° C si está disponible. Se centrifuga a 50 g durante 1 minuto. Guardar el sobrenadante # 1 y desechar parénquima pellet. Centrifugar el sobrenadante # 1 a 50 xg durante 1 minuto. Guardar el sobrenadante # 2 y descartar pellet. Centrifugar el sobrenadante # 2 a 50 xg durante 1 minuto. Guardar el sobrenadante # 3 y descartar pellet. Centrifugar el sobrenadante final # 3 de 180 g durante 8 minutos para obtener no parenquimatosas fracción.
2. Lisis de glóbulos rojos
El trabajo en campana de flujo laminar, mantener las células en frío, y las soluciones de uso se enfría a 4 ° C.
- La noche antes del procedimiento, preparar buffer rojo lisis celular mediante la dilución de 10 veces la concentración de las BD Pharm Lyse buffer con una dilución 1:10 con agua destilada estéril. 1X solutionshould ser almacenado durante 30 días a 4 ° C.
- La noche antes del procedimiento, preparar buffer Miltenyi con PBS estéril, un 0,5% de albúmina de suero bovino y 2 mM EDTA. Filtrar la solución con unidad de filtro de vacío con filtro de 0,45 micras. Cubierta superior de la unidad de volcador con tapa de plástico original y seguro con una envoltura de plástico. Storeentire filtro de la unidad a 4 ° C durante 12 horas para desgasificar EDTA. Unidad de filtro se puede reemplazar con tapa estándar estériles después de 12 horas.
- Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. El uso de un tubo de 5 ml estéril, una nueva suspensión no parenquimatosas de pellets a partir del paso por encima de 1,6 a 1 ml de 1X tampón diluido lisis de glóbulos rojos a partir de 2.1. Tape el tubo de transferencia de la campana de flujo laminar.
- Suavemente vórtice de cinco segundos e incubar durante 15 minutos a 4 ° C protegido de la luz.
- Centrifugar a 200 xg durante 5 minutos.
- Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. Deseche los eritrocitos lisados en el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón de Miltenyi helada y estéril.
- Centrifugar a 200 xg durante 5 minutos.
- Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón de Miltenyi helada y estéril.
- Retire 10 l de suspensión celular PBS y se añaden 10 l azul tryan. Conde remainingnon del parénquima células utilizando un hemocitómetro.
3. CD45 agotamiento de las células hematopoyéticas de la fracción no parenquimatosas
El trabajo en campana de flujo laminar, mantener las células en frío, y las soluciones de uso se enfría a 4 ° C.
- Suspender las células en 100 l de tampón Miltenyi por 107 células de hasta 108 células totales.
- Aplicar 20 l Miltenyi anticuerpos CD45 microesferas por cada 107 células y se incuba a 4 ° C durante 15 minutos.
- Añadir adicional de 2 ml de tampón de Miltenyi y centrifugar a 200 xg durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular (hasta 108 células en total) en 1 ml de tampón de Miltenyi.
- En campana de flujo laminar, las células de filtro con Miltenyi columna LD magnético. Comience por colocar la columna en soporte magnético (MidiMACS Miltenyi o QuadroMACS). Lugar estériles de 5 ml por debajo de tubo de filtro para atrapar filtrado. Preparar la columna por la carga de Milte 2 mlnyi buffer.
- Una vez pre-filtro de lavado es completo, las celdas de carga sobre la columna de LD. Una vez que la suspensión de células se encuentra dentro de la columna, agregar 1 ml de tampón de Miltenyi y repetir 1 ml de solución de lavado Miltenyi dos veces más. NO utilice el émbolo provisto de columna para aumentar la velocidad de filtración. Sólo recogemos filtrado cuando el filtro de colocado en el soporte magnético.
- Centrifugar el filtrado recogido de aproximadamente 5 ml (la columna tiene el restante 1 ml) de CD45-agotado células no parenquimatosas a 200 xg durante 5 minutos. Desechar la columna con la conserva células CD45 positivas.
4. Flujo de aislamiento citometría de células CD133 positivas
- Prepare los medios de comunicación oval de la célula. Use 01:01 DMEM: medio F12 con 10% inactivado por calor suero fetal bovino como base, y añadir la insulina (1 mg / ml), HEPES (5 mol / L) y penicilina / estreptomicina (1% volumen / volumen). Filtrar la solución con unidad de filtro de vacío con filtro de 0,45 micras.
- Vuelva a suspender las células en tampón Miltenyi a 100 l por 10 7 células. Añadir 2 l de CD133-PE anticuerpo conjugado. El uso de un segundo grupo de células, se incuban con IgG-PE anticuerpo conjugado como un control. Mantener un tercer grupo de células sin manchar como un control de mancha de FACS.
- Incubar a 4 ° C durante 15 minutos en la oscuridad. Vuelva a suspender en 2 ml de buffer de tinción. Centrifugar a 200 xg durante 5 minutos. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón de Miltenyi.
- Este paso se lleva a cabo utilizando procedimientos estándar de citometría de flujo clasificación de células, que pueden ser específicas de la institución. El uso de células sin teñir y IgG células PE de colores, ajustar los parámetros de clasificación de gating optimizada de CD133 + población de células. PE (R-Phytoerythrin) en general, se puede utilizar con cualquier citómetro de flujo que tiene un láser que emite a 488 nm. El pico de emisión de la EP es 575 nm y se detecta en el canal FL-2.
Nota: El uso de un BD FACS Calibur o máquinas BD FACS Vantage, con el programa Cell Quest para la recolección de datos, utilizamos Adelante vista de dispersión y dispersión lateral en la escala de registro para identificar las poblaciones de células, con dispersión lateral establecido en 250. FL1 y FL2 son tanto en escala logarítmica y se puso a 550. Estos parámetros proporcionan un lugar de partida inicial para ver el hígado células no parenquimatosas, y se ajustan según sea necesario sobre la base de intensidad de la tinción de las poblaciones positivas y negativas. - Aislar el CD133 + población de células con CD133 + puerta y recoger las células en los medios de comunicación celular estéril filtrada.
5. Métodos de cultivo celular
- FACS centrífuga recolectaron células a 200 xg durante 5 minutos. Vuelva a suspender el sedimento celular en los medios de comunicación de células ovaladas, con aproximadamente 5000 células por ml. Puede comenzar con concentraciones más altas, de hasta 50.000 células / ml para los experimentos iniciales, y reducir a medida que mejora la técnica y la viabilidad de las células y mejora el rendimiento general.
- Células de la placa en BD Biocoat laminina recubierto con placas de 96 y 1000 células / cm 2. Lugar en cultivo de células humidificado incubadora a 37 ° C, con 5% de CO 2. Después de 24 horas, añadir el factor de crecimiento de hepatocitos (50 ng / nl) y factor de crecimiento epidérmico (20 ng / ml).
- De las células individuales, aislar las células directamente en 50 l de los medios de comunicación celular oval en cada pocillo de una placa de 96 pocillos recubiertos laminina. De un solo uso celular FACS la configuración de una estricta selección de una célula positivos. Después de 24 horas, se añaden 50 l de los medios de comunicación celular oval con HGF y EGF que el anterior en el paso 5.2. Cambiar los medios de comunicación totalmente después de 5-7 días.
- Una vez que las colonias están en expansión superior al 50% confluentes, que normalmente ocurre después de 2 semanas, dependiendo del número total de células viabilidad plateado y celular, las células se pueden dividir 1:03 de la siguiente manera.
- Las células se dividen con tripsina 0,05%-EDTA. Aplique la cantidad suficiente para cubrir bien el fondo, desde 50 hasta 100 l / pocillo de placa de 96 pocillos. Lugar en la incubadora a 37 ° C durante 3-5 minutos.
- Añadir 100 ml de los medios de comunicación a cada pocillo y la transferencia de todo el líquido a un tubo de 5 ml. Añadir 1 ml de medio en cada tubo y centrifugar a 200 xg durante 5 minutos.
- Vuelva a suspender las células en la placa de los medios de comunicación en un plato recubierto de laminina, utilizando células de un bien a la placa en 3 nuevos pozos (1:3).
6. La confirmación de la bi-potencial de estado mediante RT-PCR
Este procedimiento se detalla en el manual RNeasy protocolo, que se suministra con el kit RNeasy.
- Use RNeasy columnas micro para 96 colonias y placa. Aspirar los medios de cultivo de cada pocillo. Añadir 75 l RLT buffer (de Kit RNeasy) directamente a cada pocillo. Raspar la placa inferior con policía de goma estéril. Pipettelysate en el tubo de microcentrífuga y la mezcla de vortex durante 1 minuto. Agregar 70% de etanol a lisados y mezclar con la pipeta.
- Transferir la solución a la columna RNeasy coloca en un tubo de 2 ml de recolección (que se suministra en el kit RNeasy) y se centrifuga en microcentrífuga durante 15 segundos a 10.000 rpm. Deseche eluye filtrado.
- Volver a utilizar el tubo de recolección. Añadir 350 l de búfer RW1 (RNeasy Kit) a la columna RNeasy y centrifugar durante 15 segundos a 10.000 rpm para lavar la columnamembrana. Deseche lavar eluido.
- Añadir 10 l DNasa solución madre I a 70 l Buffer RDD (ambos suministrados en el kit RNeasy). Agregar los 80 l DNasa I Buffer mezcla de incubación RDD a la membrana de la columna RNeasy e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 350 l de búfer RW1 (RNeasy kit) a la columna RNeasy y centrifugar durante 15 segundos a 10.000 rpm para lavar la membrana. Deseche lavado eluye y tubo de recolección.
- Colocar la columna de RNeasy en un nuevo tubo de 2 ml de recogida (suministrado en el kit RNeasy). Añadir 500 l Buffer RPE (RNeasy Kit) a la columna RNeasy y centrifugar durante 15 segundos a 10.000 rpm para lavar la membrana. Deseche lavar eluido.
- Preparar etanol al 80% con agua libre de RNasa (RNeasy Kit). Añadir 500 l de etanol al 80% de la centrífuga columnand RNeasy durante 2 minutos a 10.000 rpm. Deseche lavar eluido.
- Colocar la columna de RNeasy en un nuevo tubo de recogida de 2 ml (RNeasy Kit) y se centrifuga a máxima velocidad durante 5 minutos. Deseche cualquier lavado de eluido y tubo de recolección.
- Colocar la columna de RNeasy en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml (kit RNeasy). Agregar 14 l agua libre de RNasa (RNeasy Kit) para el centro de la membrana de la columna y centrifugar durante 1 minuto a máxima velocidad. Recoger filtrado con ARN purificado y traslado al hielo si la creación de cDNA inmediatamente o almacenar a temperaturas de 80 ° C para su uso futuro.
- Transcripción reversa utilizando Omniscript.Dilute inhibidor de RNasa a una concentración final de 10 unidades / l en el helado RT 1x Buffer. Vortex durante 5 segundos y centrifugar el pulso durante 5 segundos. Prepare una mezcla maestra fresco en hielo de acuerdo a la página 13 de Omniscript protocolo. Vortex durante 5 segundos y centrifugar el pulso durante 5 segundos. Recomienda a preparar un volumen de mastermix 10% mayor que la necesaria para el total requerido para todas las reacciones.
- Añadir plantilla de ARN de los tubos individuales que contienen la mezcla maestra. Vortex durante 5 segundos y centrifugar el pulso durante 5 segundos. Incubar durante 60 min a 37 ° C.
- Amplificación por PCR de genes específicos de hepatocitos (albúmina) y cholangiocyte usando la polimerasa de ADN HotStarTaq. Prepare la mezcla de reacción por la página 15 de HotStarTaq libro de protocolo. Recomiendan diluir cartillas de valores a la concentración de 20 pm / l, y con 1 l / reacción de tubo que se usa para adelante y atrás. Dependiendo del número de células inicialmente utilizado para la extracción de ARN, se recomienda dividir final de ADNc entre los tres tubos de reacción (β-actina para el control de carga, la albúmina y KRT19) para empezar.
- PCR primer diseño se muestra en la Tabla 1.
- Coloque los tubos de reacción en el termociclador. Recomendamos el siguiente programa para los experimentos iniciales: 95 ° CFOR 15 minutos x 1 ciclo seguido de 95 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 segundos x 35 ciclos, seguido de 72 ° C durante 10 minutos.
- Los productos de PCR se analizaron con bromuro de etidio impregnadas en gel de agarosa.
7. La confirmación del potencial de tumor de células madre CD133 +
- Este procedimiento puede realizarse con células recién aisladas desde el paso 4 o el uso de células que han sido cultivadas desde el paso 5. Se recomienda realizar los primeros experimentos con cultivos de células, como células recién aisladas se ha reducido la viabilidad y rendimiento reducido.
- Trypsinize células con tripsina-EDTA al 0,05% desde el paso por encima de 5,5. Después de 3-5 minutos de incubación a 37 ° C, añadir 100 ml de los medios de comunicación a cada pocillo y la transferencia de todo el líquido de cada pocillo a los distintos tubos de 5 ml (1 y = 1 metro). Añadir 1 ml de medio en cada tubo y centrifugar a 200 xg durante 5 minutos.
- Vuelva a suspender las células en 1 ml de PBS frío. Retire 10 l de suspensión celular PBS y se añaden 10 l azul tripano. Utilizando azul de tripan exclusión, determinar el número de células vivas. Si está usando FACS células aisladas, el número de células será determinado por el recuento de aislamiento FACS.
- Las células se centrifugan a 200 xg durante 5 minutos y se resuspendieron en PBS a una concentración de 1 x 10 6 l células/100 vivir. Añadir 100 l Matrigel. Seis semanas de edad ratones inmunodeficientes desnudos fueron inyectados por vía subcutánea con 28 agujas gague. Inyectar 1 x 10 6 células en 200 l por cada sitio.
- Los ratones son monitoreados por el crecimiento del tumor al día. Una vez que se forman tumores, por lo general después de la incubación de 3-4 semanas, el volumen del tumor se mide con pinzas (alto x largo x ancho).
8. Los resultados representativos:
De hígado normal, saludables murino, el rendimiento esperado celular de las células madre CD133 + hígado es de 1.000 a 5.000 por el hígado. Estas células son relativamente raros en el hígado en reposo y no se ampliará también en la cultura. Nosotros no recomendamos el uso de análisis de células individuales en el hígado normal y el rendimiento de células viables que se extenderá es extremadamente bajo.
De hígados con lesiones crónicas importantes, como la dieta DDC 0,1% durante 6 semanas una o la modificación genética que resulta en una lesión crónica, como la MAT1a - / - o PTEN específica del hígado - / - ratones, 2-4 el número esperado de cells aislado aumenta, con un máximo de 100.000 células aisladas / hígado (Figura 2). Si el uso de modelos genéticos, los conocimientos de la tasa de tumores espontáneos es fundamental, ya que estos procedimientos para el aislamiento de células madre del hígado debe ser llevado a cabo en el tumor de animales en libertad. Por ejemplo, si el MAT1a - / - modelos de formularios tumores espontáneos a los 18 meses, se recomienda el uso de animales a más tardar el 15 a 16 meses, antes de los tumores reportados espontánea.
El aislamiento de células individuales de los modelos de lesión crónica dará varias (3-9 colonies/96 y placa) colonias que se expanden a partir de células individuales una vez que el procedimiento se domina, y la viabilidad celular está garantizada. Figura 3 se presentan imágenes representativas de contraste de fase de colonias derivadas de una sola células CD133 + ampliado después de 7 días.
La confirmación de la bi-estado potencial se lleva a cabo usando albúmina y Krt19 RT-PCR. Las colonias de células individuales se amplió demostrar tanto la expresión de marcadores de los hepatocitos (albúmina) y cholangiocytes (Krt19). Figura 4 muestra bi-expresión potencial de tres colonias aisladas, con aproximadamente 25 células / colonia en 7 días.
CD133 + células madre de hígado normal y las lesiones hepáticas inducidas químicamente (por ejemplo, la dieta DDC 0,1% durante 6 semanas) no se forman tumores en ratones desnudos. CD133 + células madre específicas de los modelos genéticos (MAT1a - / - o PTEN específica del hígado - / - ratones) se forman tumores en ratones desnudos si se aísla a finales a finales de la fase pre-tumor lesión crónica. La formación de este fenotipo tumoral ha sido identificada como una célula madre del cáncer de 04.02, por ejemplo, la MAT1a -. / - Ratones se forman los tumores de hígado espontáneo a las 18 semanas de edad. CD133 + células madre hepáticas aisladas de 15-16 semanas, durante una fase de lesión crónica tardía de la enfermedad hepática, se forman tumores en ratones desnudos. La Figura 5 muestra los tumores representante de la inyección bilateral de 1 x 10 6 células expandidas in vitro a partir de un solo CD133 + células madre del hígado.
| Gene | Primer avance | Primer inversa |
| β-actina | 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' | 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ' |
| Albúmina | 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' | 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 ' |
| Queratina 19 | 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' | 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 ' |
Tabla 1: Primer diseño de RT-PCR
Figura 1: Esquema general de los métodos.
Figura 2: CD133 + células madre del hígado identificados en altamente enriquecido CD45 agotado no parenquimatosas del hígado fracción de Control ileso de ratones de tipo salvaje demuestra un 0,4% CD133 + células en el altamente enriquecido CD45 agotado no parenquimatosas fracción.. En la estructura genética de knock-out MAT1a - / -, que es un modelo de daño hepático crónico, la población CD133 se expande 10 veces o más en la misma fracción altamente enriquecido.
Figura 3: Ampliación de las colonias de un solo CD133 + clones de contraste de fase imágenes de cuatro colonias derivadas de una sola células CD133 + expandido recubierto de laminina placas de 96 pocillos..
Figura 4:. Bi-potencial de la expresión génica de células madre CD133 + hígado colonias clonal ampliado en el día 7, las colonias son de aproximadamente 25 células. La expresión de genes demuestra la expresión del marcador de marcador de hepatocitos albúmina y cholangiocyte Krt19, lo que confirma el potencial bi-estado de las células CD133 +.
Figura 5: CD133 + células madre del hígado se forman los tumores en ratones desnudos Las flechas indican el crecimiento del tumor a 4 semanas después de 1x10 células CD133 + 6 inyectado desde MAT1a - / - modelo.. CD133 + células de la toxina inducida por la lesión crónica del hígado, como por ejemplo CCl 4 o 0,1% de la dieta DDC, no forman tumores. La formación de tumores se utiliza para identificar el potencial maligno, el cáncer o el fenotipo de las células madre dentro de la población de células madre.
Discussion
A diferencia del sistema hematopoyético, en la que las células madre hematopoyéticas son responsables de mantener un sistema de diferenciación celular que replacesnormal fisiológicos turn-over de los leucocitos, los glóbulos rojos y las plaquetas, las células madre del hígado, o un adulto las células progenitoras del hígado, no participan en el hígado normal homeostasis. 5,6 Después de la lesión hepática aguda o hepatectomía parcial, los hepatocitos, el epitelio del hígado diferenciada, someterse a varias sesiones de la proliferación de sustituir la masa hepática perdida. 5,6 Sólo en una lesión crónica son células madre del hígado observado la proliferación de 1,5. Estos -11 adultos, las células madre órgano específico se propone diferenciarse en hepatocitos y cholangiocytes. 1,5-8 Curiosamente, la gran mayoría de los cáncer de hígado se desarrolla en el fondo de una lesión crónica, y por lo tanto las células madre del hígado son también la hipótesis de que se los precursores de un subgrupo de cáncer de hígado. 2-4,12-17
Uno de los retos más importantes para detener el trabajo de células en el hígado es el aislamiento de poblaciones raras de células para el análisis funcional. Por ejemplo, la gran mayoría de las células en el hígado son los hepatocitos, que son significativamente mayores que cholangiocytes y otras más pequeñas células no parenquimatosas. Al romper el hígado entero en compartimentos celulares (hepatocitos grandes - fracción del parénquima y células más pequeñas - no parenquimatosas fracción) y, además, la selección de células CD45 negativas (no células hematopoyéticas), somos capaces de enriquecer a la población a partir de células madre por más de 600 veces. 1,18-21 Cabe destacar, que no son en absoluto lo que indica que la población CD133 + es un 100% de la población pura de células madre, pero es evidente que representa una población heterogénea de células, con un linaje diferente y el potencial de repoblación. Una de las principales limitaciones del campo es la definición de las células madre y células progenitoras. Usamos el término "célula madre" de manera más amplia en este trabajo, pero en la definición estricta, CD133 + células no parenquimatosas representan una población de progenitores bi-linaje. Dado el estado de la madre y la investigación actuales progenitor en el hígado, este informe proporciona un punto de partida para los investigadores que estén interesados en este campo. Como marcadores surgen nuevas, como EpCAM 22,23, o factores de transcripción, como Sox9, 24 de ellos se pueden incorporar. Por ejemplo, hemos encontrado un índice bastante alto de solapamiento entre las células EpCAM + y células CD133 +.
En este informe, se detalla un proceso de aislamiento de células madre de hígado normal murino, así como la lesión hepática crónica modelos, que demuestran los tallos aumentó la proliferación de células del hígado. Este método tiene claras ventajas sobre técnicas de inmunohistoquímica estándar de hígado congelado o fijado en formol como los estudios funcionales utilizando células vivas se puede realizar después de su aislamiento. 1,3,4 El objetivo específico de este proceso consiste en aislar a una población relativamente pura de células madre del hígado que puede ser ampliado clonal in vitro.
La principal limitación de este procedimiento es que la mayoría de las células aisladas no será viable después de la citometría de flujo (véase la sección Solución de problemas). Este es el resultado de las horas necesarias para preparar las células, y los numerosos procedimientos necesarios para perfeccionar la población antes de su aislamiento. Si el hígado se digiere en suspensión de células individuales para el análisis de FACS inmediata, la diferencia de tamaño entre los hepatocitos y otras células no parenquimatosas hará efectiva la creación de la puerta FACS imposible. Si el hígado no parenquimatosas células se utilizan, sin la eliminación de las células hematopoyéticas, se corre el riesgo de que un número significativo de células CD133 + puede ser de origen hematopoyético pueden contaminar la fracción. Además, mediante el procesamiento de las células a través del filtro Miltenyi, sólo las células individuales y grupos pequeños de células se extraen. Esto asegura que la muestra no va a tapar la aguja consumo de FACS.
Alternativas para este procedimiento incluyen la modificación de cualquier marcador de superficie celular alternativos, tales como CD49f, EpCAM, o una combinación de marcadores, como CD133 + + EpCAM Un segundo informe publicado utiliza un gradiente de densidad para aislar las células madre del hígado de una fracción no parenquimatosas. Este procedimiento requiere una ultra-centrífuga (8000 xg), añade un tiempo considerable en el procedimiento, y en nuestra experiencia, redujo significativamente la pre-FACS rendimiento y la viabilidad celular después de la FACS. 8
Experimentos futuros incluyen una amplia gama de análisis de expresión génica, incluidos los genes del hígado del feto, tales como HNF3, HNF4α, y además αfp.In, Western blot e inmunocitoquímica de proteínas que se expresan pueden ser utilizadas para confirmar los resultados de RT-PCR de células en cultivo.
Una cuestión a destacar es el trabajo reciente que identifican CD133 expresión en las células estrelladas hepáticas. 25 Ahora examinan habitualmente a nuestras muestras de los marcadores de las células estrelladas (véase la sección Solución de problemas), y no han identified contaminación significativa en nuestras fracciones. Esto puede estar relacionado con las diferentes técnicas de la digestión y el aislamiento de células del hígado. 2,3,26
Con base en el hecho de que la mayoría de las células no será viable inmediatamente después de su aislamiento FACS, se recomienda que las células se chapada, ya sea a granel o de células CD133 + células individuales, antes de su uso en animales. 5-7 días in vitro de manera significativa a mejorar los resultados de los análisis del tumor. Además, debido a los rigores de aislamiento de células individuales, esto sólo debe llevarse a cabo una vez que las colonias se puede ampliar a granel células CD133 + aisladas. Una descripción más detallada de las condiciones de cultivo diferentes y proteínas de andamiaje que pueden utilizarse para detener la cultura del hígado y las células progenitoras se ha caracterizado bien por Lola Reid. Este trabajo ofrece condiciones alternativas y modificaciones, que los investigadores pueden incorporar a su programa de investigación una vez que las técnicas básicas de aislamiento se dominan. 27,28 Dr. El trabajo de Reid también proporciona un análisis más detallado de la biología y la maduración de linaje entre las células madre hepáticas y progenitores comprometidos.
En términos de análisis de tumores in vivo, que han tenido éxito utilizando células recién aisladas y células clonal ampliado CD133 + células in vitro, utilizando principalmente 1x10 6 células. Nos hemos centrado ontwo cepas genéticas de la lesión crónica del hígado, el MAT1a - / - y PTEN específica del hígado - / - ratones, y se han utilizado tanto en ratones nude y ratones de tipo salvaje como anfitriones para el crecimiento del tumor. En nuestra experiencia, CD133 + células madre del hígado sólo se forman tumores cuando están aisladas de importantes modelos de lesión hepática que se pre-malignas. Tenga en cuenta que los tumores formados de células CD133 + en general tienen tanto el carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma características, lo que sugiere que una célula madre o el origen de células progenitoras de los tumores. 2-4,29
El trabajo de seguimiento después de los tumores están documentadas incluye el análisis estándar patológico del tejido tumoral (tinción H & E) y la tinción inmunohistoquímica. Además, los tumores pueden ser picada y digerido para el análisis de FACS o volver a la cultura. 2-4,30
En conclusión, hemos detallado un procedimiento para el aislamiento, la expansión, y la caracterización básica de las células madre CD133 + CD133 + hígado y las células madre del cáncer.
Solución de problemas:
CD45 contaminación:
Para el paso 3, si hay contaminación de las células CD45 +, que puede ser evaluado mediante la adición de un Ab CD45-FITC antes del análisis FACS y el aislamiento, asegúrese de que el anticuerpo microesferas CD45 no ha caducado y que el filtrado se recogió sólo mientras el filtro fue en el soporte magnético. Cualquier filtrado colectado mientras que el filtro no está en el soporte magnético contendrá las células CD45 +.
Bajo número de células:
Para el hígado lesionado, el número total de CD133 + no parenquimatosas aisladas puede ser inferior a 10.000. Estas células son poco frecuentes en el hígado en reposo. Para un modelo de lesión crónica, como la dieta DDC 0,1%, el número se incrementará en gran medida a 100.000 células. Si el número total de células es muy por debajo de estos números, una cuestión a considerar es la tinción FACS Ab. Compruebe que el Ab CD133 no ha expirado, como la tinción de los pobres se traducirá en un rendimiento pobre. Además, se recomienda realizar un análisis de FACS de hígado de células no parenquimatosas para determinar la población relativa antes de intentar el aislamiento FACS.
La viabilidad celular de baja después de FACS:
Uno de los problemas de viabilidad puede estar relacionado con cómo las células se procesan y durante cuánto tiempo. Idealmente, el procedimiento de celda de aislamiento total, los pasos 1-4, debe llevarse a cabo sin ningún tipo de retrasos entre los pasos y se terminó en el mismo día. Cualquier demora significativa entre los pasos 1-4 reducirá en gran medida la viabilidad de las células. Una segunda cuestión relacionada con la viabilidad celular puede estar relacionado con la presión de funda para el aislamiento FACS. Se recomienda utilizar una presión de funda inferior. Por último, una vez que las células son aisladas, deben ser inmediatamente plateado, como cualquier sistema de almacenamiento significativo en el hielo después de la clasificación también se reducirá la viabilidad.
CD133 + no parenquimatosas heterogeneidad:
Informes recientes indican que las células estrelladas hepáticas también pueden tener CD133 expresión y tienen cierta plasticidad. 25 Por lo tanto, además de verificar la potencia bi-genes con albúmina y Krt19, de verificación adicionales pueden incluir genes asociados con las células estrelladas, como la proteína glial fibrilar ácida de las células pasivas, estrelladas y alfa-actina de músculo liso y desmina en las células estrelladas activadas. 3,4,26 Además, la población CD133 + representa una población de progenitores en general. La adición de un segundo marcador, como EpCAM, puede ayudar a perfeccionar aún más la población, y la heterogeneidad límite.
Disclosures
Dr. Rountree cuenta con el apoyo de investigación de Bayer Farmacia. Los Dres. Ding y Maleantes y la Sra. Dang y VanKirk señora no tiene revelaciones que informar.
Acknowledgments
Dr. Rountree reconoce el apoyo actual de la red del milagro de la Infancia, Instituto Nacional de Salud, K08DK080928 y R03DK088013, y la Sociedad Americana del Cáncer Premio Académico de Investigación, MGO-11651. Dr. Rountree reconoce que este procedimiento fue desarrollado inicialmente y refinado al mismo tiempo financiado por el Programa de Desarrollo Científico Pediátrico (NICHD concesión de una subvención K12-HD00850).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 10565-018 | With phenol red |
| CD45 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma-Aldrich | H1404 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN25 | 1 gram |
| Collagenase D | Roche Group | 1088874 | |
| Pronase | Roche Group | 0165921 | |
| 70 micron mesh strainer | Fisher Scientific | 352350 | |
| Omniscript RT | Qiagen | 205111 | 50 reactions |
| HotStarTaq | Qiagen | 203203 | |
| Miltenyi LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| CD133-PE FACS Ab | eBioscience | 12-1331-82 | |
| Laminin coated plates | BD Biosciences | 354410 | 96 well |
| Trypsin 0.05% EDTA | Invitrogen | 25300-354 | 100 mL |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | 50 columns for 5x105 cells or less |
| Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | 10X concentration |
References
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