Summary
Hier beschreiben wir die Isolierung von CD133 exprimierenden Leber-Stammzellen und Krebsstammzellen aus ganz murinen Leber, ein Prozess, der Gewebe Verdauung, Anreicherung von Zellen und Durchflusszytometrie Isolierung erfordert. Wir gehören Methoden für fortgeschrittene Einzelzellisolierung und klonalen Expansion.
Abstract
Leber-Stammzellen oder ovale Zellen, vermehren sich während der chronischen Leberschädigung, und vorgeschlagen, sowohl in Hepatozyten und Cholangiozyten unterscheiden. Darüber hinaus sind Leber-Stammzellen angenommen, dass sie die Vorläufer für eine Teilmenge von Leberkrebs, Leberzellkarzinom werden. Eines der wichtigsten Herausforderungen für die Zelle Arbeit in einem festen Organ wie die Leber Stammzellen ist die Isolierung von einer seltenen Population von Zellen, für eine detaillierte Analyse. Zum Beispiel sind die überwiegende Mehrheit der Zellen in der Leber Hepatozyten (Parenchym-Fraktion), die deutlich größer ist als Nicht-Parenchymzellen sind. Durch die Anreicherung der spezifischen zellulären Kompartimenten der Leber (zB Parenchym-und Nicht-Parenchym-Fraktionen), und die Auswahl für die CD45-negativen Zellen, können wir an den Start Population von Stammzellen durch bereichern über 600-fold.The proceduresdetailed in diesem Bericht ermöglichen eine relativ seltene Population von Zellen aus einem Organ-effizient sortiert werden. Dieser Prozess kann bis isolateliver Stammzellen aus normalen murinen Leber sowie chronische Leberschäden Modelle, die eine erhöhte Leber Stammzellproliferation demonstrieren genutzt werden. Diese Methode hat klare Vorteile gegenüber Standard-Immunhistochemie von gefrorenen oder Formalin fixiert Leber als funktionelle Studien mit lebenden Zellen nach der ersten Co-Lokalisation Experimente durchgeführt werden können. Um das zu erreichen das Verfahren in diesem Bericht dargelegt wurde, ist eine funktionierende Beziehung mit einem Forschungs-basierte Durchflusszytometrie Kern stark gefördert wie die Details der FACS isoliert in hohem Maße auf spezialisierte Mess-und ausgeprägte Kenntnisse der grundlegenden Durchflusszytometrie Verfahren. Das spezifische Ziel dieses Prozesses ist es, eine Bevölkerung von Leber-Stammzellen, die klonal in vitro erweitert werden kann isolieren.
Protocol
Alle Lösungen, Medien, Instrumente, Filter und Rohre sollten steril und behandelt mit steriler Technik, um das Risiko einer Kontamination zu verringern. Bereiten Sie alle Puffer und Medien 24 Stunden im Voraus und lagern bei 4 ° C.
1. Parenchymale und Nicht-Parenchym Trennung von ganzen Leber
- Bereiten Sie die Enzymlösung für die Verdauung mit einem 15 ccm Rohr mit Schraubverschluss in 10 ml sterilem PBS mit 5 mg Kollagenase, 5 mg Pronase und 1 mg DNAse.
- Euthanize Maus mit Einrichtung genehmigt (Institutional Animal Care und Verwenden Committee)-Methode wie CO 2 Ersticken. Wischen Bauchbereich des eingeschläfert Tiere mit 70% Ethanol-Lösung. Mit sterilen Instrumenten, offene Bauchhöhle und Explantation der Leber en-Block. Entfernen der Gallenblase aus explantierten Leber. Transfer ganze Leber zu Laminarströmungshaube in geschlossenen sterile Schüssel.
- Dieses Verfahren ist in einer Sterilbank abgeschlossen. Mit einem sterilen Rasierklinge, Hackfleisch Leber mit Kombination aus mehreren horizontalen und vertikalen Schnitten für 1 Minute in sterile Schüssel. Legen ¼ Hackfleisch Leberbrei in 15 ccm Rohr mit 10 ccm PBS mit Kollagenase, Pronase und DNAse von Schritt 1.1 oben. Wiederholen Sie mit jedem ¼ Hackfleisch Leber.
- Die Röhrchen mit ¼ Hackfleisch Leberbrei und Enzyme in Wasserbad bei 37 ° C für 45 Minuten, mit Shaker auf 1-2 Zyklen / Sekunde. Wischen Rohre mit 70% Ethanol nach der Entnahme aus Wasserbad, bevor sie zu Laminarströmungshaube übertragen.
- Dieses Verfahren ist in einer Sterilbank abgeschlossen. Der Stamm verdaut Leberbrei bis 70 Mikron-Sieb-Filter, um in eine sterile Schale zu sammeln. Mit jeweils 2 ml sterile DMEM: F12-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, spülen Sie den Filter und die Gummi-Ende eines Spritzenkolbens zu Maische der verdauten Zellstoff durch den Filter. 5 Mal wiederholen bis zu einem Gesamtvolumen von etwa 20 ml Filtrat zu machen. Teilen Sie das Filtrat in 2 gleich 15 ml Tuben.
- Alle Transfers sollten in Laminarströmungshaube abgeschlossen sein, und verwenden Sie Kühlzentrifuge bei 4 ° C, falls verfügbar. Zentrifuge bei 50 xg für 1 Minute. Speichern Überstand Nr. 1 und entsorgen Parenchym Pellet. Centrifuge Überstand Nr. 1 bei 50 xg für 1 Minute. Speichern Überstand Nr. 2 und entsorgen Pellet. Centrifuge Überstand Nr. 2 bei 50 xg für 1 Minute. Speichern Überstand Nr. 3 und entsorgen Pellet. Centrifuge endgültige Überstand Nr. 3 für 180 xg für 8 Minuten auf nicht-parenchymatösen Fraktion zu erhalten.
2. Red Zelllyse
Work in Laminarströmungshaube, halten Zellen kalt und benutzerfreundliche Lösungen abgekühlt auf 4 ° C.
- In der Nacht vor dem Eingriff vorzubereiten rot Zelllysepuffer indem 10fach Konzentration Lager BD Pharm Lyse-Puffer mit einer 1:10-Verdünnung mit sterilem destilliertem Wasser. 1X solutionshould für 30 Tage bei 4 ° C gelagert werden
- In der Nacht vor dem Eingriff vorzubereiten Miltenyi Puffer mit sterilem PBS, 0,5% Rinderserumalbumin und 2 mM EDTA. Filter-Lösung mit Vakuum-Filter-Einheit mit 0,45-Mikron-Filter. Deckel oben tilter Einheit mit original Kunststoff-Deckel und sichere mit Plastikfolie. Storeentire Filtereinheit bei 4 ° C für 12 Stunden zu entgasen EDTA. Filter kann mit Standard-sterile Kappe nach 12 Stunden ausgewechselt werden.
- Dieses Verfahren ist in einer Sterilbank abgeschlossen. Mit einem 5 ml sterilen Röhrchen, resuspendieren nicht Parenchym Pellet aus Schritt 1.6 oben in 1 ml 1X verdünnt roten Blutkörperchen Lysepuffer von 2,1 vor. Cap das Rohr für die Übertragung aus dem Laminarströmungshaube.
- Vorsichtig vortexen für 5 Sekunden und Inkubation für 15 Minuten bei 4 ° C vor Licht geschützt.
- Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten.
- Dieses Verfahren ist in einer Sterilbank abgeschlossen. Discard lysiert Erythrozyten in Überstand und resuspendieren Pellet in 1 ml Eis-kalt und steril Miltenyi Puffer.
- Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten.
- Dieses Verfahren ist in einer Sterilbank abgeschlossen. Überstand verwerfen und wieder auszusetzen Pellet in 1 ml Eis-kalt und steril Miltenyi Puffer.
- Nehmen Sie 10 ul PBS Zellsuspension und fügen 10 pl Tryan blau. Graf remainingnon-Parenchymzellen mit Zählkammer.
3. CD45 hämatopoetische Zell-Depletion aus Nicht-Parenchym-Fraktion
Work in Laminarströmungshaube, halten Zellen kalt und benutzerfreundliche Lösungen abgekühlt auf 4 ° C.
- Suspend-Zellen in 100 ul Miltenyi Puffer pro 107 Zellen bis zu 108 insgesamt Zellen.
- Übernehmen 20 uL Miltenyi CD45 Mikrobead Antikörper für jedes 107 Zellen und inkubieren Sie bei 4 ° C für 15 Minuten.
- Fügen Sie weitere 2 ml Miltenyi Puffer und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten. Überstand entfernen. Re-suspend Zellpellet (bis zu 108 gesamt-Zellen) in 1 ml Miltenyi Puffer.
- In Laminarströmungshaube mit Filterzellen Miltenyi LD magnetischen Säule. Starten Sie, indem Spalte in Magnethalter (Miltenyi MidiMACS oder QuadroMACS). Legen Sie sterile 5 ml Röhrchen unter Filter Filtrat zu fangen. Bereiten Sie die Spalte durch das Laden 2 ml Miltenyi-Puffer.
- Sobald Vorfilter waschen abgeschlossen ist, Wägezellen auf LD Spalte. Sobald die Zellsuspension wird in der Spalte 1 ml Miltenyi Puffer und wiederholen 1 ml Miltenyi Puffer waschen 2 weitere Male. Verwenden Sie KEINE Stempel mit Spalte zur Verfügung gestellt, um Geschwindigkeit der Filtration zu erhöhen. NUR sammeln Filtrat, wenn der Filter in in den Magnethalter gestellt.
- Centrifuge die gesammelten Filtrat von ca. 5 ml (die Spalte hält die restlichen 1 ml) des CD45-abgereicherten nicht Parenchymzellen bei 200 xg für 5 Minuten. Entsorgen Sie die Spalte mit dem zurückgehaltenen CD45-positiven Zellen.
4. Durchflusszytometrie Isolierung von CD133 positiven Zellen
- Bereiten ovalen Zelle Medien. Verwenden 01.01 DMEM: F12-Medium mit 10% Hitze inaktiviertem fetalem Kälberserum als Basis, und fügen Sie Insulin (1 pg / ml), HEPES (5 mol / L) und Penicillin / Streptomycin (1% Volumen / Volumen). Filter-Lösung mit Vakuum-Filter-Einheit mit 0,45-Mikron-Filter.
- Re-suspend-Zellen in Miltenyi-Puffer bei 100 ul pro 10 7 Zellen. Add 2 ul der CD133-PE konjugierte Antikörper. Mit einer zweiten Gruppe von Zellen, die mit IgG-PE konjugierte Antikörper als Kontrolle inkubiert. Bewahren Sie eine dritte Gruppe von Zellen ohne Färbung als ungefärbte Kontrolle für FACS.
- Inkubation bei 4 ° C für 15 Minuten im Dunkeln. In 2 ml Färbepuffer Re-suspendieren. Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten. Überstand verwerfen und wieder auszusetzen Pellet in 1 ml Miltenyi Puffer.
- Dieser Schritt ist unter Verwendung der Standard-Durchflusszytometrie cell sorting Verfahren, die Institution spezifische sein können. Mit ungefärbten Zellen und IgG PE gefärbten Zellen, passen Sortierung Parameter für eine optimierte Gating von CD133 + Zellpopulation. PE (R-Phytoerythrin) können in der Regel mit einem Durchflusszytometer, dass ein Laser, der bei 488 nm emittiert hat verwendet werden. Die Peak-Emission für PE ist 575 nm und ist in der FL-2 Kanal erkannt.
Hinweis: Die Verwendung eines BD FACS Calibur oder BD FACS Vantage Maschinen, mit der Cell Quest Programm für die Datenerfassung, verwenden wir Forward Scatter und Side Scatter Blick in die Log-Skala Zellpopulationen, mit seitlicher Streuung auf 250 zu identifizieren. FL1 und FL2 sind beide in Log-Skala und auf 550. Diese Parameter geben einen ersten Ausgangspunkt, um Leber nicht Parenchymzellen Ansicht, und sind bei Bedarf angepasst auf Färbeintensität von positiven und negativen Populationen. - Isolieren Sie die CD133 + Zellpopulation mit CD133 + Tor und sammeln Sie die Zellen in sterilfiltriert Zelle Medien.
5. Zellkultur-Methoden
- Centrifuge FACS gesammelten Zellen bei 200 xg für 5 Minuten. Re-suspend Zellpellet in ovaler Zellen Medien mit ungefähr 5000 Zellen pro ml. Mai mit höheren Konzentrationen zu starten, bis zu 50.000 Zellen / ml für erste Experimente, und reduzieren so Technik verbessert und insgesamt die Lebensfähigkeit der Zellen und die Ausbeute verbessert.
- Platte Zellen auf BD Biocoat Laminin beschichtete 96-Well-Platten mit 1000 Zellen / cm 2. Legen Sie in befeuchtet Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C, mit 5% CO 2. Nach 24 Stunden, fügen Hepatozyten-Wachstumsfaktor (50 ng / nl) und Epidermal Growth Factor (20 ng / ml).
- Für einzelne Zellen isolieren Zellen direkt in 50 ul ovalen Zelle Medien in jede Vertiefung einer 96-Well-Laminin beschichtete Platte. Verwenden Sie einzelne Zelle FACS-Einstellungen für eine strenge Auswahl eines positiven Zelle nur. Nach 24 Stunden werden 50 ul der ovalen Zelle Medien mit HGF und EGF wie oben in Schritt 5.2. Ändern Medien vollständig nach 5-7 Tagen.
- Sobald die Erweiterung Kolonien größer als 50% konfluent, die in der Regel tritt nach 2 Wochen, je nach Anzahl der Zellen ausplattiert und die Lebensfähigkeit der Zellen sind, können die Zellen im Verhältnis 1:3 sein als unten.
- Split-Zellen mit Trypsin 0,05%-EDTA. Wenden Sie gerade genug zur Deckung gut unten, 50-100 ul / well auf 96-Well-Platte. Legen Sie in Brutschrank bei 37 ° C für 3-5 Minuten.
- Geben Sie 100 ul von Medien in jede Vertiefung und Transfer alle flüssigen bis 5 ml-Tube. 1 ml Medium in jedes Röhrchen und zentrifugieren bei 200 xg für 5 Minuten.
- Re-suspend Zellen in Medien Platte in Laminin beschichteten Schale, unter Verwendung von Zellen aus 1 gut zu Platte in 3 neuen Brunnen (1:3 Verhältnis).
6. Bestätigung der bi-Potential-Status mittels RT-PCR
Dieses Verfahren ist in der RNeasy Protokoll Handbuch, das mit dem RNeasy Kit geliefert wird detailliert.
- Verwenden Sie RNeasy Micro Spalten für 96-Well-Platte Kolonien. Saugen Sie Kulturmedien aus jeder Vertiefung. Add 75 ul Puffer RLT (von RNeasy Kit) direkt in jede Vertiefung. Scrape Plattenboden mit sterilen Gummi Polizist. Pipettelysate in Mikro-Zentrifugenröhrchen und Vortex-Mischung für 1 Minute. Fügen Sie 70% Ethanol zu Lysaten und durch Pipettieren gründlich mischen.
- Die Lösung wird in RNeasy Säule in ein 2 ml Sammel-Tube gestellt (wie in RNeasy Kit im Lieferumfang enthalten) und Zentrifuge in der Mikro-Zentrifuge für 15 Sekunden bei 10.000 Umdrehungen pro Minute. Discard eluiert Filtrat.
- Re-use das Sammelrohr. Geben Sie 350 ul Puffer RW1 (RNeasy Kit) auf die RNeasy Säule und zentrifugieren Sie für 15 Sekunden bei 10.000 rpm, um die Spalte zu waschenMembran. Discard eluiert waschen.
- Add 10 l DNase I-Stammlösung zu 70 ul Puffer RDD (beide in RNeasy Kit im Lieferumfang enthalten). Fügen Sie die 80 ul DNase I Buffer RDD Inkubation mischen, um die RNeasy Säule Membran und Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Geben Sie 350 ul Puffer RW1 (RNeasy-Kit) auf die RNeasy Säule und zentrifugieren Sie für 15 Sekunden bei 10.000 Umdrehungen pro Minute um die Membran zu waschen. Discard eluiert waschen und Sammel-Tube.
- Platzieren Sie die RNeasy Säule in ein neues 2 ml Sammel-Tube (im Lieferumfang enthalten in RNeasy-Kit). Add 500 ul Puffer RPE (RNeasy Kit) auf die RNeasy Säule und zentrifugieren Sie für 15 Sekunden bei 10.000 Umdrehungen pro Minute um die Membran zu waschen. Discard eluiert waschen.
- Bereiten Sie 80% Ethanol mit RNase-freiem Wasser (RNeasy Kit). Fügen Sie 500 mL 80% Ethanol auf die RNeasy columnand Zentrifuge für 2 Minuten bei 10.000 Umdrehungen pro Minute. Discard eluiert waschen.
- Platzieren Sie die RNeasy Säule in ein neues 2 ml Sammel-Tube (RNeasy Kit) und Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit für 5 Minuten. Entsorgen Sie alle eluiert waschen und Sammel-Tube.
- Platzieren Sie die RNeasy Säule in ein neues 1,5 ml-Collection-Tube (RNeasy-Kit). Add 14 ul RNase-freies Wasser (RNeasy Kit) in die Mitte der Säule Membran und Zentrifuge für 1 Minute bei voller Geschwindigkeit. Sammeln Filtrat mit gereinigten RNA und Transfer zum Eis, wenn die Schaffung cDNA sofort oder lagern bei minus 80 ° C für eine spätere Verwendung.
- Reverse Transkription mit Omniscript.Dilute RNase-Inhibitor in einer Endkonzentration von 10 Einheiten / ul in eiskaltem 1x Buffer RT. Vortex für 5 Sekunden, und Puls-Zentrifuge für 5 Sekunden. Bereiten Sie eine neue Master-Mix auf Eis nach Seite 13 Omniscript Protokoll. Vortex für 5 Sekunden, und Puls-Zentrifuge für 5 Sekunden. Empfehlen Sie auf ein Volumen von Mastermix 10% größer als die für die Summe aller Reaktionen erforderlich erforderlich vorzubereiten.
- Add Template-RNA zu den einzelnen Röhrchen mit Master-Mix. Vortex für 5 Sekunden, und Puls-Zentrifuge für 5 Sekunden. Inkubieren für 60 min bei 37 ° C.
- PCR-Amplifikation von Hepatozyten (Albumin) und cholangiocyte spezifischer Gene mit HotStarTaq DNA-Polymerase. Bereiten Reaktionsgemisch pro Seite 15 von HotStarTaq Protokoll zu buchen. Empfehlen Verdünnen Lager Primer-Konzentration von 20 pm / ul, und mit 1 ul / Reaktionsrohres für Vorwärts-und Rückwärts-Primer verwendet. Je nach Anzahl der Zellen zunächst für die RNA-Extraktion verwendet werden, empfehlen wir teilen letzten cDNA unter 3 Reaktionsgefäße (β-Aktin für Ladekontrolle, Albumin und KRT19) zu starten.
- PCR-Primer-Design ist in Tabelle 1 aufgeführt.
- Legen Sie Reaktionsgefäße in Thermocycler. Empfehlen Sie folgendes Programm für erste Versuche: 95 ° Cfor 15 Minuten x 1 Zyklus von 95 ° C für 30 Sekunden, 55 ° C für 30 Sekunden, 72 ° C für 30 Sekunden x 35 Zyklen von 72 ° C für 10 Minuten.
- PCR-Produkte werden mittels Ethidiumbromid imprägniert Agarosegel.
7. Bestätigung des Tumors Potenzial der CD133 + Stammzellen
- Dieser Vorgang kann mit frisch isolierten Zellen aus Schritt 4, oder unter Verwendung von Zellen, die aus Schritt 5 kultiviert wurden durchgeführt werden. Wir empfehlen, den ersten Experimenten mit kultivierten Zellen, wird als frisch isolierten Zellen Lebensfähigkeit und reduzierte Ausbeute reduziert haben.
- Trypsinize Zellen mit Trypsin 0,05%-EDTA von Schritt oben 5.5. Nach 3-5 Minuten Inkubation bei 37 ° C, 100 l von Medien in jede Vertiefung und übertragen alle Flüssigkeit aus jeder Vertiefung einzelner 5 ml Röhrchen (1 gut = 1 Tube). 1 ml Medium in jedes Röhrchen und zentrifugieren bei 200 xg für 5 Minuten.
- Re-suspend-Zellen in 1 ml eiskaltem PBS. Nehmen Sie 10 ul PBS Zellsuspension und fügen 10 pl Trypanblau. Mit Trypanblau-Ausschluss, bestimmen Anzahl von lebenden Zellen. Bei Verwendung von FACS isolierten Zellen wird Zellzahl durch FACS isoliert count bestimmt werden.
- Centrifuge Zellen bei 200 xg für 5 Minuten und erneut suspendiert in PBS in einer Konzentration von 1 x 10 6 Live Zellen/100 ul. 100 l Matrigel. Sechs Wochen alte immundefizienten Nacktmäusen wurden subkutan injiziert mit 28 gague Nadel. Inject 1 x 10 6 Zellen in 200 ul pro Standort.
- Mäuse sind für das Tumorwachstum täglich überwacht. Sobald Tumore bilden, in der Regel nach 3-4 Wochen Inkubation wird das Tumorvolumen gemessen Bremssättel (Höhe x Länge x Breite).
8. Repräsentative Ergebnisse:
Von normalen, gesunden murine Leber, ist der erwartete Ertrag von zellulären CD133 + Leber-Stammzellen 1.000 bis 5.000 pro Leber. Diese Zellen sind relativ selten in Ruhe Leber und wird nicht gut erweitern in der Kultur. Wir raten davon ab, einzelne Zelle Analyse auf normale Leber und die Ausbeute an lebenden Zellen, die erweitert ist extrem niedrig.
Für Lebern mit erheblichen chronischen Verletzungen, wie die DDC 0,1% Ernährung für 6 Wochen 1 oder genetische Veränderung, die zu chronischen Verletzungen, wie die MAT1A - / - oder Leber spezifische PTEN - / - Mäuse, 2-4 die erwartete Anzahl von cells isoliert erhöht, mit bis zu 100.000 Zellen isoliert / Leber (Abbildung 2). Bei der Verwendung von genetischen Modellen, Wissen spontaner Tumor-Rate ist von entscheidender Bedeutung, da diese Verfahren für Leber-Stammzellen isoliert sollte in tumorfrei Tieren durchgeführt werden. Zum Beispiel, wenn die MAT1A - / - Modell spontanen Tumoren bildet mit 18 Monaten, empfehlen wir die Verwendung von Tieren spätestens 15-16 Monate vor jeder berichtet spontanen Tumoren.
Isolierung einzelner Zellen aus chronischen Verletzungen Modelle liefern mehrere (3-9 colonies/96 Well-Platte) Kolonien, die aus einzelnen Zellen zu erweitern, sobald das Verfahren beherrscht wird, und die Lebensfähigkeit der Zellen gewährleistet ist. Abbildung 3 präsentieren Vertreter Phasenkontrast Bilder von Kolonien aus einzelnen CD133 +-Zellen nach 7 Tagen erweitert abgeleitet.
Bestätigung der bi-Potential-Status wird unter Verwendung Albumin und Krt19 RT-PCR. Kolonien aus expandiertem Einzelzellen demonstrieren sowohl Ausdruck für Marker der Hepatozyten (Albumin) und Cholangiozyten (Krt19). Abbildung 4 zeigt, bi-Potential Ausdruck von drei isolierten Kolonien mit etwa 25 Zellen / Kolonie nach 7 Tagen.
CD133 + Stammzellen aus normalen Leber-und chemisch induzierte Leberschäden (zB DDC 0,1% Ernährung für 6 Wochen) nicht bilden Tumoren in Nacktmäusen. CD133 + Stammzellen aus spezifischen genetischen Modelle (MAT1A - / - oder Leber spezifische PTEN - / - Mäuse) werden Tumoren in Nacktmäusen bilden, wenn isoliert spät in späten präklinischen Tumor chronischen Verletzungen Phase. Dieser Tumor bildet Phänotyp ist derzeit als Krebsstammzellen identifiziert 2-4 für zB die MAT1A -. / - Mäuse bilden spontan Lebertumoren bei 18 Wochen alt sind. CD133 + Leber-Stammzellen bei 15-16 Wochen isoliert, während eines späten chronischen Verletzungen Phase der Lebererkrankung, wird Tumoren in Nacktmäusen zu bilden. Abbildung 5 zeigt repräsentative Tumoren bilaterale Injektion von 1 x 10 6 Zellen in vitro aus einzelnen CD133 + Leber-Stammzellen erweitert.
| Gen | Vorwärts-Primer | Reverse-Primer |
| β-Aktin | 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' | 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ' |
| Albumin | 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' | 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 ' |
| Keratin 19 | 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' | 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 ' |
Tabelle 1: Primer-Design für RT-PCR
Abbildung 1: schematische Darstellung der Methoden.
Abbildung 2: CD133 + Leber-Stammzellen in hoch angereichertes CD45 erschöpft Nicht-Parenchym-Fraktion identifiziert Steuerung unverletzt Leber von Wildtyp-Mäusen demonstriert 0,4% CD133 + Zellen innerhalb des hoch angereicherten CD45 erschöpft Nicht-Parenchym-Fraktion.. In der genetischen Knock-out MAT1A - / -, die ein Modell der chronischen Leberschäden ist, dehnt sich die CD133 Bevölkerung 10-fache oder mehr in der gleichen hoch angereicherten Fraktion.
Abbildung 3: Erweiterung Kolonien aus einzelnen CD133 +-Klone Phasenkontrast-Bilder von vier Kolonien aus einzelnen CD133 + Zellen auf Laminin beschichteten 96-Well-Platten ausgebaut abgeleitet..
Abbildung 4:. Bi-Potenzial Genexpression von CD133 + Leber Stammzellen klonal expandierten Kolonien Am Tag 7 werden die Kolonien rund 25 Zellen. Die Genexpression zeigt Expression von Hepatozyten-Marker Albumin und cholangiocyte Marker Krt19, bestätigt bi-Potenzial Status der CD133 +-Zellen.
Abbildung 5: CD133 + Leber-Stammzellen bilden Tumoren in Nacktmäusen Die Pfeile zeigen die Tumoren wachsen 4 Wochen nach 1x10 6 CD133 + Zellen aus MAT1A injiziert - / --Modell.. CD133 + Zellen, die aus Toxin induzierten chronischen Leberschädigung, wie CCl 4 oder 0,1% DDC Ernährung, bilden keine Tumoren. Tumorbildung wird verwendet, um maligne Potential oder Krebsstammzellen Phänotyp in der Stammzell-Population zu identifizieren.
Discussion
Anders als das blutbildende System, in dem hämatopoetischen Stammzellen sind verantwortlich für die Aufrechterhaltung einer zellulären Differenzierung, das replacesnormal physiologischen turn-over von Leukozyten, rote Blutkörperchen und Blutplättchen, Leber Stammzellen oder erwachsenen Leber Vorläuferzellen, nicht in normalen Leber zu beteiligen Homöostase. 5,6 Nach einer akuten Schädigung der Leber oder teilweisen Hepatektomie, Hepatozyten, wie differenziert Leber Epithel, durchlaufen mehrere Runden der Proliferation, um die verlorenen Leber Masse zu ersetzen. 5,6 Nur bei chronischen Verletzungen sind Leber-Stammzellen beobachtet zu vermehren. 1,5 -11 Diese Erwachsenen, organspezifische Stammzellen werden vorgeschlagen, um sowohl in Hepatozyten und Cholangiozyten unterscheiden. 1,5-8 Interessanterweise ist die überwiegende Mehrheit von Leberkrebs auf dem Hintergrund der chronischen Verletzung entwickelt, und damit Leber-Stammzellen sind auch die Hypothese zu sein Vorläufer für eine Teilmenge von Leberkrebs. 2-4,12-17
Eine der wichtigsten Herausforderungen für die Zelle Arbeit in der Leber Stammzellen ist die Isolierung von seltenen Populationen von Zellen für die funktionelle Analyse. Zum Beispiel sind die überwiegende Mehrheit der Zellen in der Leber Hepatozyten, die deutlich größer als Cholangiozyten und andere kleinere nicht-Parenchymzellen sind. Durch das Brechen der ganzen Leber in Zellkompartimenten (große Hepatozyten - Parenchym-Fraktion und kleinere Zellen - nicht-parenchymatösen Fraktion) und weitere Auswahl für CD45 negativen Zellen (nicht-hämatopoetischen Zellen), können wir an den Start Population von Stammzellen durch bereichern über 600-fache. 1,18-21 Zu beachten ist, sind wir keineswegs darauf hinweist, dass die CD133 + Population ein 100% reines Stammzellen Bevölkerung ist, sondern ganz klar eine heterogene Population von Zellen mit unterschiedlichen Herkunft und Wiederbesiedlung Potenzial. Eine der wichtigsten Einschränkungen des Feldes Definitionen von Stammzellen und Vorläuferzellen. Wir verwenden den Begriff "Stammzelle" im weiteren Sinne in dieser Arbeit, aber in strengen Definition stellen CD133 + Nicht-Parenchymzellen ein bi-Linie Vorläufer-Population. Angesichts des Stands der aktuellen Stamm-und Vorläuferzellen Forschung in der Leber, gibt dieser Bericht einen Startplatz für die Ermittler, die in diesem Bereich interessiert sind. Als neuer Marker, entstehen wie EpCAM, 22,23 oder Transkriptionsfaktoren, wie Sox9, 24 sie eingebaut werden kann. Zum Beispiel haben wir eine ziemlich hohe Überlappung zwischen EpCAM + Zellen und CD133 + Zellen gefunden.
In diesem Bericht detailliert ein Verfahren zur Stammzellen isoliert von normalen murinen Leber sowie chronische Leberschäden Modelle, die zeigen, erhöhte Leberwerte Stammzellproliferation. Diese Methode hat klare Vorteile gegenüber Standard-Immunhistochemie von gefrorenen oder Formalin fixiert Leber als funktionelle Studien mit lebenden Zellen nach der Isolierung durchgeführt werden kann. 1,3,4 Die spezifische Ziel dieses Prozesses ist es, eine relativ reine Population von Leber-Stammzellen, die isolieren können klonal in vitro erweitert werden.
Die wichtigste Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass die Mehrzahl der Zellen isoliert werden nicht nach Durchflusszytometrie lebensfähig (siehe Abschnitt Fehlersuche). Dies ist das Ergebnis der Stunden benötigt, um die Zellen herzustellen, und die zahlreichen Verfahren erforderlich, um die Bevölkerung vor der Isolierung zu verfeinern. Wenn die Leber in einzelne Zell-Suspension für die sofortige FACS-Analyse verdaut ist, wird der Größenunterschied zwischen Hepatozyten und anderen Nicht-Parenchymzellen effektiv FACS Tor Schöpfung unmöglich. Wenn die Leber nicht Parenchymzellen verwendet werden, ohne Abspaltung von hämatopoetischen Zellen, besteht die Gefahr, dass eine erhebliche Anzahl von CD133 + Zellen hämatopoetischen Ursprungs sein kann der Anteil verunreinigen. Weiterhin wird durch die Bearbeitung der Zellen durch die Miltenyi Filter sind nur einzelne Zellen und sehr kleine Gruppen von Zellen gesammelt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Probe nicht verstopfen die FACS Einnahme Nadel.
Alternativen für dieses Verfahren sind Änderungen für jede alternative Zelloberflächenmarker, wie CD49f, EpCAM, oder eine Kombination von Markern, wie CD133 + EpCAM + Ein zweiter Bericht veröffentlicht, nutzt einen Dichtegradienten zu Leber-Stammzellen, die aus einem Nicht-Parenchym-Fraktion zu isolieren. Dieses Verfahren erfordert eine Ultra-Zentrifuge (8000 xg), fügt viel Zeit, um das Verfahren, und in unserer Erfahrung, deutlich vor FACS zellulären Ertrag und post-FACS Lebensfähigkeit reduziert. 8
Zukünftige Experimente sind ein breiteres Spektrum von Genexpressionsanalyse, einschließlich fetale Leber Gene, wie HNF3, HNF4α und αfp.In Zusätzlich können Western-Blot-Analyse und Immunzytochemie von exprimierten Proteinen genutzt werden, um RT-PCR-Ergebnisse von Zellen in Kultur zu bestätigen.
Ein Thema, zu beachten ist, neuere Arbeiten, die CD133-Expression auf Lebersternzellen identifiziert. 25 Wir haben jetzt routinemäßig Bildschirm unsere Proben für die Marker der Sternzellen (siehe Abschnitt Fehlersuche), und nicht identified signifikante Kontamination in unseren Fraktionen. Dies kann zu unterschiedlichen Techniken der Leber Verdauung und Zellisolation bezogen werden. 2,3,26
Basierend auf der Tatsache, dass die Mehrzahl der Zellen nicht sofort nach FACS isoliert lebensfähig, empfehlen wir, dass die Zellen ausplattiert werden, entweder als Bulk-CD133 + Zellen oder einzelne Zellen, vor Tieren zu verwenden. 5-7 Tage in vitro signifikant verbessert werden Ergebnisse der Tumor-Analyse. Darüber hinaus angesichts der Strapazen des Einzelzellisolierung, sollte diese nur durchgeführt, wenn Kolonien von Bulk-CD133 + isolierten Zellen erweitert werden kann. Eine genauere Diskussion der verschiedenen Kulturbedingungen und Gerüst Proteine, die zur Kultur Leber Stamm-und Vorläuferzellen verwendet werden kann, wurde auch von Lola Reid aus. Diese Arbeit bietet alternative Bedingungen und Modifikationen, die Ermittler in ihrem Forschungsprogramm integrieren kann einmal Basisisolierung Techniken beherrscht werden. 27,28 Dr. Reid Werk bietet auch eine detailliertere Analyse der Linie Biologie und Reifung von Leber-Stammzellen und Vorläuferzellen verpflichtet.
In Bezug auf die in vivo Tumor-Analyse hatten wir Erfolg mit frisch isolierten Zellen und Zellen von klonal expandierten CD133 +-Zellen in vitro, in erster Linie mit 1x10 6 Zellen. / - - Und in der Leber bestimmte PTEN - / - Wir haben ontwo genetische Stämme von chronischen Leberschädigung, die MAT1A konzentriert Mäuse, und wir haben beide Nacktmäusen und Wildtyp-Mäusen als Gastgeber für das Tumorwachstum eingesetzt. Nach unserer Erfahrung wird CD133 + Leber-Stammzellen nur Tumoren bilden, wenn sie aus signifikante Schädigung der Leber Modelle, die prä-maligne sind isoliert. Beachten Sie, dass die Tumoren aus CD133 + Zellen gebildet haben sowohl hepatozellulären Karzinoms und Gallengangskarzinom Funktionen, was auf eine Stammzell-oder Progenitorzellen Entstehung der Tumoren. 2-4,29
Follow-up-Arbeit nach Tumoren dokumentiert umfasst Standard-pathologischen Analyse von Tumorgewebe (H & E-Färbung) und immunhistochemische Färbung. Darüber hinaus können Tumoren zerkleinert und für die FACS-Analyse oder re-Kultur verdaut werden. 2-4,30
Zusammenfassend haben wir ein Verfahren zur Isolierung, Expansion und die grundlegende Charakterisierung von CD133 + Leber-Stammzellen und CD133 + Krebsstammzellen detailliert.
Trouble Shooting:
CD45 Kontamination:
Für Schritt 3, wenn es Kontamination von CD45 +-Zellen, die durch Zugabe eines CD45-FITC Ab vor FACS-Analyse und isoliert betrachtet werden können, um sicherzustellen, dass der CD45 Mikrobead Antikörper nicht abgelaufen ist und dass das Filtrat nur während sammelten die Filter wurde in den Magnethalter. Jede Filtrat gesammelt, während der Filter nicht in der magnetischen Halterung wird CD45 +-Zellen enthalten.
Niedrige Zellzahl:
Für die unverletzten Leber, die Gesamtzahl der CD133 + Nicht-Parenchym isoliert werden können weniger als 10.000. Diese Zellen sind selten in den ruhenden Leber. Für eine chronische Verletzung Modell, wie die DDC 0,1% Ernährung, wird die Zahl deutlich erhöhen zu 100.000 Zellen. Wenn die gesamte Zellzahl liegt deutlich unter diesen Zahlen ist die eine Sache zu prüfen, FACS Ab Färbung. Stellen Sie sicher, dass die CD133 Ab nicht abgelaufen ist, wie arm Färbung in eine schlechte Ausbeute führt. Darüber hinaus empfehlen wir die Durchführung einer FACS-Analyse der Leber nicht Parenchymzellen, um die relative Bevölkerung vor dem Versuch FACS isoliert zu bestimmen.
Low Lebensfähigkeit der Zellen nach FACS:
Eine der Fragen der Lebensfähigkeit können, wie die Zellen verarbeitet werden und über welchen Zeitraum bezogen werden. Im Idealfall sollte die gesamte Zelle Isolierung, die Schritte 1-4, ohne Verzögerungen zwischen den einzelnen Schritten durchgeführt und abgeschlossen werden am selben Tag. Jede wesentliche Verzögerung zwischen den Schritten 1-4 wird erheblich reduziert die Lebensfähigkeit der Zellen. Ein zweites Problem im Zusammenhang mit Lebensfähigkeit der Zellen kann zum Mantel Druck für FACS Isolierung verwendet bezogen werden. Wir empfehlen die Verwendung einer geringeren Mantel Druck. Schließlich, nachdem die Zellen isoliert werden, sollten sie sofort vergoldet, als nennenswerte Lagerung auf Eis nach dem Sortieren reduzieren auch die Rentabilität.
CD133 + Nicht-Parenchym-Heterogenität:
Aktuelle Berichte zeigen, dass Lebersternzellen können auch CD133 Expression und haben einige Plastizität. 25 Darum, zusätzlich zur Überprüfung bi-Potenz Gene mit Albumin und Krt19, zusätzliche Überprüfung können Gene mit sternförmigen Zellen, wie saures Gliafaserprotein in assoziiert sind, zählen Ruhestrom Sternzellen und alpha-smooth muscle Aktin und Desmin in aktivierten Sternzellen. 3,4,26 Darüber hinaus stellt die CD133 + Population eine breitere Vorläufer-Population. Die Zugabe eines zweiten Marker, wie zB EpCAM, kann dazu beitragen, die Bevölkerung weiter zu verfeinern und zu begrenzen Heterogenität.
Disclosures
Dr. Rountree erhält Forschungsförderung von Bayer Pharma. Drs. Ding und Crooks und Frau Dang und Frau VanKirk haben keine Angaben zu melden.
Acknowledgments
Dr. Rountree erkennt aktuelle Unterstützung der Kinder-Miracle Network, National Institute of Health, K08DK080928 und R03DK088013, und die American Cancer Society Research Scholar Award, MGO-11651. Dr. Rountree erkennt an, dass dieses Verfahren ursprünglich entwickelt und verfeinert, während die Kinder Scientist Development Program (NICHD Grant Award K12-HD00850) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 10565-018 | With phenol red |
| CD45 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma-Aldrich | H1404 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN25 | 1 gram |
| Collagenase D | Roche Group | 1088874 | |
| Pronase | Roche Group | 0165921 | |
| 70 micron mesh strainer | Fisher Scientific | 352350 | |
| Omniscript RT | Qiagen | 205111 | 50 reactions |
| HotStarTaq | Qiagen | 203203 | |
| Miltenyi LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| CD133-PE FACS Ab | eBioscience | 12-1331-82 | |
| Laminin coated plates | BD Biosciences | 354410 | 96 well |
| Trypsin 0.05% EDTA | Invitrogen | 25300-354 | 100 mL |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | 50 columns for 5x105 cells or less |
| Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | 10X concentration |
References
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