Summary
Vi har udviklet nye laboratorie-værktøjer og protokoller for intravital billeddannelse erhvervelse af brissel. Vores teknik skal hjælpe med identifikationen af "nicher" i thymus, hvor T-celle udvikling sker.
Abstract
To-foton mikroskopi (TPM) giver billedet opkøb i dybe områder inde i væv og organer. I kombination med udviklingen af nye stereotaktisk værktøjer og kirurgiske procedurer, bliver TPM en kraftfuld teknik til at identificere "nicher" inde organer og til at dokumentere cellulære "adfærd" i levende dyr. Mens intravital billedbehandling giver oplysninger, der bedst ligner den virkelige cellulære adfærd inde i orglet, er det både mere omstændelig og teknisk krævende med hensyn til nødvendigt udstyr / procedurer end alternative ex vivo imaging erhvervelse. Således beskriver vi en kirurgisk procedure, og romanen "stereotaktisk" orgel holder, der gør det muligt for os at følge bevægelserne af Foxp3 +-celler i thymus.
Foxp3 er master regulator til generering af regulatoriske T-celler (Tregs). Desuden kan disse celler skal klassificeres efter deres oprindelse: dvs. brissel-opdelte Tregs kaldes "naturligt forekommende Tregs" (nTregs), som opposed til perifert-konverterede Tregs (pTregs). Selvom betydelig mængde forskning har været rapporteret i litteraturen om fænotype og fysiologi af disse T-celler, meget lidt er kendt om deres in vivo interaktioner med andre celler. Denne mangel kan skyldes mangel af teknikker, der ville tillade sådanne observationer. Protokollen er beskrevet i dette dokument indeholder et middel mod denne situation.
Vores protokol består i at bruge nøgne mus, der mangler et endogent thymus, da de har en punktlig mutation i DNA-sekvensen, at kompromiser differentieringen af nogle epitelceller, herunder thymus epitelceller. Nude mus blev gamma-bestrålet og rekonstitueres med knogle græskar (BM) fra Foxp3-KI GFP / GFP mus. Efter BM opsving (6 uger) modtog hvert dyr embryonale brissel transplantation inde i nyrerne kapsel. Efter thymus accept (6 uger) blev dyrene bedøvede, nyrene, der indeholdertransplanteret thymus blev afsløret, fast i vores orgel holderen, og holdes under fysiologiske betingelser for in vivo imaging af TPM. Vi har brugt denne fremgangsmåde for at undersøge indflydelse af narkotika i den generation af regulatoriske T-celler.
Protocol
1. Animal forberedelse
Vigtigt: BM cellesuspensioner og tymisk transplantationer blev udført i aseptiske forhold. BM suspensioner blev forberedt inde i hætter af vores cellekultur værelse, mens tymisk transplantation blev udført i den kirurgiske rummet ligger inden for vores dyr facilitet. For at bevare og sikre disse aseptiske forhold, fik vi ikke lov til at optage vores video på disse steder. Imidlertid blev alle de kirurgiske materialer autoklaveres og kirurgiske bænken var tidligere rengøres med Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc.) og 70% ethanol. Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), og de blev efter aftale med Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) direktiver. Godkendelsen ID-nummer er AO10/2010. Alle billedet forsøgene var terminalen procedurer og dyrene blev aflivet umiddelbart efter afslutningen af billedeterhvervelse.
Fremgangsmåden er som følger:
- Bestråle (med en γ-irradiator) 8 uger gamle Nude mus med 900 rad til at ødelægge den endogene hæmatopoietisk prækursorer inde i knoglen courgetter (BM). Efter bestråling, tilbagesende dyrene til deres bure, indtil du forberede donor BM celler til intravenøs injektion og yderligere BM rekonstitution. Dette BM overførsel blev udført 1 time efter bestråling.
- Adskil BM donor dyr. Skinneben og lårben på bagbenene af et dyr er generelt nok til at genskabe op til 3 modtager dyr. Efter at eutanasi med CO 2, fjern bagbenene og derefter fjerne hud og muskel fra knoglerne.
- Skær den lukkede ende af hver knogle og skyl det med PBS (eller RPMI) eller knuse dem alle i en morter, ved hjælp af pistil, med 2 ml PBS (eller RPMI) for at fjerne BM.
- Forstyrre BM strukturen i en enkelt-celle suspension af gentagelser af kraftig aspiration USIng en P1000 pipette. Alternativt kan du også videregive BM hele en 21G kanylen flere gange. Centrifuge (400g, 5 min, RT), re-suspendere celler i PBS, og injiceres intravenøst ind i din nude-bestrålede modtagere. I vores forsøg brugte vi BM fra Foxp3-KI GFP / GFP mus, hvor alle regulatoriske T-celler (Tregs) vil udtrykke GFP 1.
- Accept af donoren BM opstår i de første dage efter overdragelsen, da ikke-BM-rekonstituerede dyr ikke kan overleve mere end 14 dage. Dog skal man vente i 4 til 6 uger til at tillade fuld dækning for alle BM rum. Bactrim (Roche) blev føjet til vand (2 mg / ml) i den første uge efter bestråling for at mindske risikoen for bakterielle infektioner.
- Embryonale brisler transplantation blev allerede beskrevet 2. Kort fortalt, start ynglende par af isogene mus og kontrollere for at tilslutte (bevis for samleje) hver dag. Separat sat hunner og CO 2-aflive dem på dag 15 af pregnANCY (observation af stikket er dag 1 af graviditeten). Fjern embryoner og thymuses. Placer embryonale thymuses i koldt PBS indtil overførsel.
- For at udføre thymuses transplantation, bedøver BM-modtageren Nude mus med ketamin (120 mg / g mus vægt) / xylazin (16 mg / g mus vægt) og holde dem på toppen af en varmepude ved 37 ° C, indtil de får bevidstløs.
- Kirurgisk udsætte nyrerne til at udføre transplantation af thymuses. Første krat huden med ChloraPrep (CareFusion Inc.) og 70% ethanol. Så gør en 1 cm snit på huden af back-lateral kropsdel af dyret, 2 mm nedenstående for sidste thorax ribben.
- Skær bughulen og træk nyre af dette hulrum. Lav en lille overfladisk snit i nyrerne kapsel med en skalpel kniv. Brug pincet med en meget tynd spids gør en pose under nyre kapsel modtageren musen og tilføje op til 4 tymisk lapper ind i denne pose.
- Sæt nyre b ack til sin plads, sutur bughulen med en eller to sting, og luk derefter musen huden ved hjælp af den samme sutur metode. Alternativt kan suturmateriale gøres ved hjælp af kirurgisk lim.
- Injicér analgetikum (Butorphanol ved 5 mg / kg) subkutant lige efter endt operation for at undgå at påføre dyr smerte og holde dyrene i en varmepude, indtil de begynder at komme sig efter anæstesi. Mus er i bur individuelt for de første 3 dage efter transplantation for at forhindre bur kammerater i at fjerne stingene. Fjern sting efter 1 uge.
- Nude mus ikke har T-celler. Derfor kan du vurdere brissel graft accept ved at overvåge den procentdel af CD4 + eller CD8 + T-celler i blodet. En gang om ugen, 2 uger efter thymus transplantation, bløder dyrene og pletten blodet med anti-CD4 og anti-CD8 monoklonale antistoffer (MAB). Når CD4: CD8 ratio er ca 2:1, der er transplanteret thymus er fuldt funktionsdygtig (Figur 1).
Forbered alle de materialer du skal bruge på forhånd, og læg dem til side.
- Bedøver dyr med ketamin / xylazin (samme doser som beskrevet under punkt 1,5) og placere dem på toppen af en varmepude ved 37 ° C. Indsprøjtes 100 μl af Rhodamine B isothiocyanat-Dextran (20 mg / ml i PBS) intravenøst for at tillade fremtidig visualisering af blodgennemstrømningen.
- Expose nyren indeholder de transplanterede brissel i henhold til protokollen tidligere beskrevet i punkt 1.6.
- For at forhindre nyrerne i at vende tilbage til dets oprindelige position, skal du lukke den laterale sider af incision i huden med sting.
- Læg et stykke PBS-lægges i blød bomuld på toppen af orglet for at holde den fugtig.
- Sæt varmepude på toppen af dyret indehaveren fase (Figur 2A).
- Sæt dyret på toppen af varmepude i dyret holderen, orgel op (Figur 2B).
- Knib orglet i begge sider med en klemme made af tynd aluminiumsfolie (Figur 2C).
- Luk dyret indehaveren og læg det øverste varmelegeme sonden så tæt som muligt på dit væv (Figur 2D). Apparatet sonde hele tiden måler orgel temperaturen og sender disse oplysninger til varmeren til at justere den elektriske strøm, holde det ved 37 ° C.
- Fjern PBS-gennemblødt bomuld og tilføje lavtsmeltende agarose (2% i PBS) ved 30 ° C på toppen af din forberedelse.
- Dække hele præparatet med det øverste varmelegeme (Figur 2E). I blænde på dette varmelegeme er der et dækglas isolere agarose fra målet (Figur 2F). Overvåg musen anæstesi og indsprøjte en halv dosis boost hver 40 min. Efter billedet købet, aflive dyret med CO 2.
Bemærk: billeder af aluminiumsfolie klip, og den øverste varmelegeme er præsenteret i Figur 3.
3. To-foton billedbehandling erhvervelse
Vi brugte en opretstående "Prairie Ultima XY" to-foton mikroskop. Vores system er udstyret med en Ti: Sapphire laser, fire top PMTs for samtidig op til 4 kanaler opkøb og en 20x nedsænkning i vand mål.
- Tænd for TI: Sapphire laser og hele mikroskop system.
- Tilføj dichroic spejle og filter sætter henhold til den ønskede bølgelængder. I vores tilfælde har vi brugt et Olympus-BX2 Chroma indehaveren, der indeholder en 565 nm dichroic spejl, en 525/50 nm filter (for Foxp3-GFP signal), og én 595/50 nm filter (for Dextran-Rhodamine-B signal inde i blodkarrene ). Laseren bølgelængde anvendte områder var mellem 880 til 900 nm.
- Tilføj dyret holderen til mikroskopet, tilslutte og tænde alle de varmeapparater, tilsæt vand på toppen varmer blænde, forsigtigt sænke målet i vandet, og fokusere på et skib eller nogle GFP-Tregs.
- Med mikroskop x, hurtigt y, z ekstern kontrol, undersøgelse vævet til at finde en region af interesse.
- Juster gevinst på PMTs at optimere farveseparation og minimere mængden af laser der kræves for at opnå tilstrækkelig signal over baggrund. Prøv at bruge minimal mængde af laser for at undgå foto-beskadigelse af dit væv.
- Når regionen interesser befinder sig, begynder time-lapse billeddannelse. I vores tilfælde, en typisk 5D (x, y, z, t, og farve) erhvervelse protokol består af erhverve sekventielle billeder af en 50 μm dybdegående væv volumen, fordelt på 4,0 μm z-trin, x og y længde på 140 μm hver. Hvert bind tager omkring 30 sekunder at blive opkøbt. Derfor vil 60 opkøb udføre omkring 30 min af billedet erhvervelse.
- Overføre data til den institutionelle server og bruge ImageJ, Imaris eller Volocity software til at udføre multi-dimensional rendering og celle tracking.
4. Repræsentative resultater
g1.jpg "/>
Figur 1. . Embryonale brissel accept og funktion efter BM komme sig, var embryonale thymuses transplanteret til BM rekonstitueret dyr to uger efter thymus transplantation, blev disse mus blødte en gang om ugen til at overvåge de procentsatser af T-celle undertyper af farvning med anti-CD4 eller anti-CD8 MAB. Vi overvejede brissel lykkedes accepteret hos dyr med et CD4: CD8 forhold omkring 1.5-2.0:1 (A). For at bekræfte sin funktionalitet, vi ofrede nogle thymus-transplanterede dyr og sammenlignet den procentvise andel af forskellige thymocyt delpopulationer med WT mus (B). Procentdelen af dobbelt-negative (DN; CD4 - CD8 - thymocytter) delpopulationer (ved farvning med anti-CD25 og anti-CD44 MAB), dobbelt-positive (DP; CD4 + CD8 + thymocytter) og enkelt-positive (SP) CD4 + eller CD8 + thymocytter var ens mellem disse dyr.
ig2.jpg "/>
Figur 2. Animal holder samling. Efter dybt bedøvede, er det dyr, der anbringes oven på en varmepude, der tidligere blev monteret på toppen af dyret indehaveren fase (A). Nyren indeholder de transplanterede brissel vender opad (B). En aluminiumsfolie klemme forsigtigt klemmer hele nyren (C) for at holde den på plads. Fig. 1C indsætte viser i detaljer klemme. Den øverste del af dyret indehaveren er sat på plads (D). Det PBS-gennemblødt bomuld er fjernet fra toppen af orglet, erstattet af varme lavtsmeltende agarose, og den øverste varmelegeme er tilføjet (E). Endelig er hele forsamlingen overført til mikroskopet, her repræsenteret ved mål (F).
Figur 3. Nærmere oplysninger om indehaverens dele. Disse billeder viser den aluminiumsfolie klemmen (A) holder nyrerne (B). Bemærk også den region, hvor det transplanterede brissel er placeret. Denne ca angiver regionenat skære brissel kapsel og gøre lomme til at sætte embryonale brissel. Den øverste varmelegeme dækglas (C) var fastgjort med silikone lim til sin nederste del (D).
Movie 1. Intravital billeddannelse af Foxp3-GFP + thymocytter inde i brissel, hvor de fysiologiske niveauer af ilt og temperatur (37 ° C) blev holdt under hele processen. Bemærk blodgennemstrømningen og bevægelse Tregs. Disse hastigheder kan måles og sammenlignes med offentliggjorte data. Klik her for at se filmen.
Movie 2. Intravital billeddannelse af Tregs inde i et brissel, hvor billederne blev erhvervet ved 30 ° C. Bemærk den manglende bevægelighed og den runde form af cellerne på trods af vedligeholdelse af blodgennemstrømningen. Klik her for at se filmen.
Discussion
I dette papir har vi demonstreret procedurerne for to-foton scanning af thymocytter inde i et levende dyr. Vi har også beskrevet nogle parametre, man skal nøje kontrol, såsom en fortsættelse af blodgennemstrømningen og vedligeholdelse af orglet temperatur under de billeddiagnostiske procedurer. Ikke desto mindre, på trods af omhyggelig indsats at holde orglet stabil, kan bevægelsesfejl som "orgel glide" forekomme. Posterior billedet korrektion kan udføres ved udvikling af algoritmer specielt designet til dette formål. Yderligere billede analyse kunne også være kilden til nye protokoller udvikling, som søger at minimere fejl.
Brissel er det organ, hvor alle T-celler er produceret, og derfor er det organ, hvor immunologer interesseret i at forstå den generation af γδ, vil CD4 eller CD8 T-celler fokuserer deres opmærksomhed. De fleste undersøgelser om T-cellerne er baseret på forskelle i antal og / eller stabilitet af disse calen efter forskellige in vitro / in vivo manipulationer. Men først efter in vivo-visualiseringen kunne vi iagttage samspillet mellem celler i immunsystemet, der er involveret i at opretholde homøostase 3-7. Derfor er in vivo observation af thymocytter er sandsynligvis en af de vigtigste manglende oplysninger til bedre at forstå T-celle-biologi. Intravital TPM giver et detaljeret billede af T-celle bevægelser og interaktioner, og vi viser her, hvordan det kan anvendes til detaljerede thymocyt studier. Men hver teknik har sine begrænsninger. Mens intravital imaging Overtagelsestidspunktet er det mest præcise system til reflekterende celler adfærd inde i kroppen, er det også sandt, at eksplanterede billede erhvervelse af organer er mindre omstændelig og har været anvendt til at indsamle vigtige oplysninger om immunsystemet 8,9. Desuden kan man ikke benægte intravital billeddiagnostiske metoder kræver operation for at eksponere væv og blodkar i bedøvede dyr,som i sig selv kan forårsage en ændring i hele orglet fysiologi 10. Alligevel er der non-invasivt metoder, der afskaffe artefakter som følge af den kirurgiske procedure 11 og nye metoder er blevet udviklet, at bedre at forberede på forhånd de dyr, der skal bruges 12. Derfor vil nye kirurgiske indgreb og vejafgifter minimere eller bypass faktiske begrænsninger af intravital billedbehandling erhvervelse og blive mere og mere tilgængelig for det videnskabelige samfund.
Vi har vist, at den metode, vi har beskrevet er mulig, og den rapporterer alle in vivo systemisk manipulationer, såsom Drug Administration, som vi har brugt. Derfor foreslår vi, at brugen af denne metode sammen med ex vivo-teknikker allerede er til rådighed med henblik på at supplere og styrke yderligere undersøgelser vedrørende thymocytter udvikling.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. David Olivieri til kritisk revision af dette manuskript, Dr. Nuno Moreno for den logistiske bidrage til at opbygge vores dyre-indehaver og varmepuder og Dr. Vijay K. Kuchroo for den type donation af Foxp3-KI GFP / GFP mus. Dette arbejde er støttet af "Fundação para Ciencia e Tecnologia" (FCT, Portugal), give # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
- Bettelli, E. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, 235-238 (2006).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2006).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Hugues, S. Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity. 5, 1235-1242 (2004).
- Tang, Q. Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice. Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).
- Le Borgne, M. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature immunology. 10, 823-830 (2009).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).
- Barretto, R. P. J. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17, 223-228 (2011).
