Methoden voor intraveneuze toediening Zelf in een muismodel

Summary

De intraveneuze zelftoediening (IVSA) paradigma wordt beschouwd als de gouden standaard bij de behandeling van de versterkende eigenschappen van drugs bij knaagdieren zijn. Dit manuscript beschrijft de experimentele procedures en chirurgische technieken die nodig zijn om betrouwbare IVSA gegevens te verkrijgen. Met name zorgvuldige catheter implantatie en onderhoud gemarkeerd.

Abstract

Diermodellen zijn ontwikkeld om de versterkende effecten van geneesmiddelen, waaronder intraveneuze zelftoediening (IVSA) paradigma bestuderen. De voordelen van een IVSA paradigma de versterkende eigenschappen van drugs zoals cocaïne onderzoeken omvatten het feit dat het geneesmiddel in plaats van zelf toegediend experimentator toegediend, het schema van de wapening kan worden gewijzigd en nauwkeurige meting van de hoeveelheden geneesmiddel en verbruikt de timing en het patroon van IV injectie kan worden verkregen. Bovendien is de intraveneuze toedieningsweg vermijdt potentiële verwart met betrekking tot first-pass metabolisme of smaak, en produceert een snelle stijging in het bloed en de hersenen drug niveaus. Zoals uiteengezet in deze video, kan intraveneuze zelftoediening worden verkregen zonder voorafgaande voedsel beperking of voorafgaande drug opleiding na zorgvuldige plaatsing van de katheter tijdens de operatie en zorgvuldige dagelijkse katheter spoelen en onderhoud. Experimentele procedures die in dezepapier voorzien van een beschrijving van de stallen en acclimatisatie methoden, operante training met behulp van gezoete melk-oplossingen, en katheter implantatie chirurgie.

Protocol

1. Stallen en Acclimatisatie Procedures

1. Mannelijke en vrouwelijke CD-1 muizen zijn ondergebracht met hetzelfde geslacht nestgenoten, tot 5 dieren per kooi, in standaard kunststof kooien met beta-chip beddengoed en nestlet pads, met draadrooster deksels voor flessen water en voedsel tegemoet te komen. Standaard muis chow en water zijn ad libitum beschikbaar in de woning kooien gedurende het experiment.
2. Muizen worden bijgehouden op een omgekeerde licht-donker schema (lampjes op 22:00 tot 10:00).
3. Muizen mogen de IVSA testen kamers acclimatiseren een week voor de start van experimentele procedures.

2. Operante Training

1. Alle gedrags-procedures, waaronder gezoete melk training en intraveneus druggebruik zelftoediening sessies worden uitgevoerd met behulp van operante kamers meet 15,9 x 14 x 12,7 cm, uitgerust met 2 ultra-gevoelige muis hendels, lepel kopjes, stimulus verlichting en microliter spuit pompen (Med Associates Inc, St. Albans, VT, USA). Chambers zijn aangesloten op een computer met behulp van Med Associates Smart CR-interface en Med-PC-software voor het schema van de wapening te programmeren en gegevens te verzamelen.
2. Naïeve muizen zijn gewend aan de operante kamers en getraind om hefboom pers met een gezoete melk beloning (0,1 ml), die in dipper beker. Operante melk training wordt gegeven in 1-uur sessies gedurende 5-7 dagen. Voltooiing van een vaste verhouding (FR) schema op de actieve hendel resulteerde in de presentatie van de dipper beker en de verlichting van een stimulus licht. De gezoete melk oplossing bestond uit sucrose (10 mg / ml, ACS Reagent, Sigma-Aldrich Inc St-Louis MO, USA) toegevoegd volle melk (3,25% vet). Operante training met een gezoete melk oplossing of een vloeibaar voedingsmiddel bekrachtiger is een veel voorkomende techniek die wordt gebruikt om te vergemakkelijken operante reageren in muizen ^1,2.

3. Voorbereiding van de apparatuur te worden gebruikt tijdens de operatie

RequIRED apparatuur - 20, 23 en 26 gauge naalden, slijpmachine, 1 cc spuiten, Tygon tubing, soldeerbout, heparine, antibiotica en pijnstillende.

1. Bereid een naald om het inbrengen van de katheter geleiden in de halsader van scheren in een 20 gauge naald. De schacht van de naald wordt geschoren beneden met behulp van een slijpmachine om een ​​kanaal binnen de naald om de katheter slang te begeleiden in de ader te vormen. De naald kanaal moeten zorgvuldig worden gecontroleerd op metalen deeltjes die kunnen zijn gedeponeerd. Eventuele obstructies om het kanaal moet worden geschraapt met behulp van fijne getipt tang.
2. Aan twee 1-cc injectiespuiten te gebruiken voor het spoelen en controleren van de catheter. Bereid twee spuiten door middel van 12 cm stukken Tygon-buis en vastzetten aan een uiteinde 26 gauge naalden bevestigd aan 1 cc injectiespuiten en strekken van de andere uiteinden van de slangen over 23 gauge naalden. Een injector worden gevuld met 0,9% steriele zoutoplossing en de andere met een gehepariniseerde ticarcilline oplossing (33 mg ticarcillineen 0,3 mg heparine per 10 ml steriele zoutoplossing).
3. Bereid katheter canule caps. Tygon-buis is gespannen over een 23 gauge naald en 1 cm gesneden uit de afschuining. Smelt het open uiteinde van de buis een dikke afdichting. De buis moet worden gesmolten zodat de gehele canule cap lang genoeg om over de katheter canule, met het afgedichte uiteinde dat strak over het uiteinde van de canule. Merk op dat als de dop te lang is, bestaat het risico dat het zal worden gebogen en vervolgens doorboord tijdens het proces van de schroef-on catheter omvat. Aldus zorgvuldige voorbereiding van de catheter caps wordt aanbevolen om een ​​goede fit aan de canule voorzien.
4. Bereid vereiste oplossingen. Alle reagentia zijn aangeschaft bij Sigma-Aldrich Inc (St-Louis MO, USA).
   1. Gehepariniseerde ticarcilline oplossing catheter spoelen - Los 0,33 g ticarcilline (dinatriumzout) en 0,003 g heparine in 10 ml steriele zoutoplossing. 0,03 ml van de oplossing wordt gespoeld thrdoorgedreven de katheter dagelijks. De antibiotische oplossing wordt toegediend om bloedstolsels en infecties te voorkomen uit ontwikkelingslanden.
   2. Amikicin (antibioticum) voor subcutane injectie - een enkelvoudige subcutane injectie wordt na een operatie in een dosis van 10 mg / kg om postoperatieve infecties.
   3. Ketoprofen (analgeticum) voor subcutane injectie - een enkelvoudige subcutane injectie wordt na een operatie bij een dosis van 5 mg / kg aan een postoperatieve pijn te beheersen.

4. Catheter Implantatie chirurgie

Vereiste apparatuur en reagentia: Isofluraan, steriele zoutoplossing, alcohol (70%), 1 en 3 cc spuiten gevuld met een steriele zoutoplossing, 1-cc aangepaste spuiten, antibiotica en pijnstillende oplossingen bereid in paragraaf 3 hierboven, muis katheters (CamCaths, Cambridgeshire, UK ), katheter deksels (crystal doppen van HRS Scientific, Montreal, Quebec), oog glijmiddel, 4 cm plastic balk naar de ader verheffen (ditkan worden geconstrueerd uit een plastic Q-tip), polysporin, steriele swabs en gaas gebogen en rechte forceps, slagader klemmen, fijne schaar.

1. Gebruik aseptische standaardtechnieken de chirurgische bank, de chirurgische instrumenten en de katheters worden gesteriliseerd operatie. Goede sterilisatie technieken omvatten stoomautoclaaf voor de chirurgische instrumenten en katheters gekocht CamCaths. Glaskraal sterilisatie kan ook gebruikt worden op de uiteinden van de chirurgische instrumenten. Ethyleenoxide sterilisatie kan worden ingezet op meer delicate katheters of materialen die risico smelten. Een meer gedetailleerde beschrijving van knaagdier chirurgische aseptische technieken zijn te vinden in de bijgevoegde referenties ^1,2. Opzet van de bank, is instrumenten en neuskegel voor handhaving van de anesthesie geïllustreerd in de foto.
2. Muizen zijn verdoofd met isofluraan gas, en gehandhaafd onder verdoving met behulp van een beademingsbuis onder een opvangsysteem. Eye smeermiddel (Tears Naturale PM) wordt toegepast op beide ogen om ze niet uitdrogen tijdens de procedure. Een geschikte chirurgische marge op geschoren rug van het dier en de hals. Voordat er incisies worden gemaakt, zijn de chirurgische velden beperkt met steriele lakens.
3. Om de katheter voor het inbrengen bereiden in het rechter atrium van het hart, wordt de overmaat katheterbuis afgesneden 1,2 cm van de lamp van de katheter. Dit is de optimale lengte die voor volwassenen CD-1 muizen, ongeveer 8 weken oud, 20-25 gram lichaamsgewicht. De lengte van katheterbuis enigszins aan te passen (proefondervindelijk), gebaseerd op de stam, grootte en leeftijd van de muizen. Voorafgaand aan inbrengen wordt de spuit met een steriele zoutoplossing (sectie 3.2) aan de katheter canule, en de katheter wordt gespoeld en gecontroleerd op lekken. Houdendeze spuit bevestigd aan de katheter gedurende de chirurgische procedure. Het zal worden gebruikt om de katheter te spoelen, en zuig bloed in stap 4.7.
4. Na de sterilisatie met 70% alcohol, is een 2 cm lange midscapular incisie gemaakt uitgaande midden op de rug en eindigt net onder de nek om de basis van de catheter tegemoet. Bindweefsel dient te worden gedwongen elkaar met een tang om ruimte te maken voor de katheter basis onder de huid.
5. Plaatsen van het dier op zijn rug een tweede ondiepe 1 - 2 cm diagonaal incisie wordt gemaakt van het rechter sleutelbeen gaat omhoog om de dieren kaak, nadat het gebied is gereinigd met 70% alcohol. De halsader wordt oppervlakkig te vinden onder de huid van de nek. Ter voorbereiding van het inbrengen van de catheter, wordt buis van de basis van de katheter getrokken door de incisie op de rug en bracht dichtbij de halsader door het passeren van de buis onder de huid net over de rechterschouder. Het einde van de katheterbuis isvervolgens gekoppeld aan een arterieklem en geplaatst aan de zijde van het dier te houden in plaats.
6. De juiste halsader ligt door voorzichtig af te stappen oppervlakkige bind-en vetweefsel van de incisie in de nek van het dier. Bindweefsel rond de ader is gebroken met elkaar gebogen forceps en de ader wordt vervolgens verhoogd met een steriele plastic bar. Losse geopend hechtdraad knopen zijn gemaakt rond elk uiteinde van de ader en de katheter slang is voorzien van schroefdraad door de bovenste knoop en lus over de hechtdraad te rusten ongeklemde over de rechter schouder.
7. Voorafgaand aan het inbrengen, natte zowel de 20 gauge inbrengnaald en ader met steriele zoutoplossing om wrijving te verminderen. De naald evenwijdig aan de ader en voorzichtig ingebracht nabij de bodem van de verhoogde ader (Opmerking: ongeveer 0,5 cm van de naald dient om in de ader). Met behulp van een tang, schuif de katheter buis in de schacht van de naald in de ader. Weerstand zou erop wijzen dat de slang is binnen bindweefsel en niet binnen de ader. Duw 0,03 cc van een zoutoplossing door de ader om ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn. Lekken zou erop wijzen dat de ader kan worden doorboord of dat de katheter buis plaatsing moet worden aangepast.
   Opmerking: Om te controleren of de slang in de ader, proberen op te stellen wat bloed met behulp van de bijgevoegde zoutoplossingspuit. Als er bloed niet onmiddellijk kan worden vastgesteld, kan de ader of hartwand worden het afsluiten van de catheter tip, of de ader niet is doorboord; zet het slangetje en probeer het opnieuw. Naald reïntegratie kan nodig zijn als het bloed nog steeds niet kan worden opgesteld.
   
8. Met het oog op de katheter op zijn plaats, druk op de katheter lamp om het invoegpunt en verwijder de naald. Bind de bodem knoop en vervolgens de katheter gelijk te trekken tegen de bar voordat u de koppeling van de tweede knoop recht boven de lamp. Test om te kijken of het bloed kan worden opgesteld en de knopen licht indien nodig los te maken. Stop de katheter buis onder de huid en hechtingde ventrale incisie rond de nek van het dier. Toepassing Polysporin Heal Fast met een steriel wattenstaafje applicator of andere antibiotische zalf die bij voorkeur een analgetische de gesloten incisie.
9. Met het dier op de buik, plaatst de katheter base onder de huid van de rug in de bereide incisie. Zorg ervoor dat het teveel aan slangen minimaal een lus en goed verborgen onder de katheter uitvalsbasis om de kansen van het dier kauwen en piercing te minimaliseren. Hechten de insnijding aan beide zijden van de katheter base en pas Polysporin Heal Fast met een steriel wattenstaafje applicator.
10. Spoel de katheter met 0,03 cc van de gehepariniseerde ticarcilline oplossing met behulp van de spuit met de slang is geplakt (paragraaf 3.2). Cap de canule met de plastic canule dop en schroef op de witte katheter deksel. In sommige muizen die vers van een operatie, kan het bloed lekken uit de katheter vóór de canule wordt afgedekt. Het is belangrijk om opnieuw te spoelen het dier en rapidly vervang de canule los voordat het bloed de kans te laten stromen. De dieren moeten worden gespoeld op een dagelijkse basis te katheter doorgankelijkheid te behouden.
11. Na afwrijven van het injectiegebied tussen de dieren achterpoten met 70% ethanol, subcutaan injecteren de analgetische ketoprofen in een dosis van 5 mg / kg enerzijds en het antibioticum amikicin bij een dosis van 10 mg / kg aan de andere zijde.
12. Na verdoving wordt stopgezet, worden dieren toegestaan ​​om in een schone kooi te herstellen met gemakkelijke toegang tot voedsel en water gedurende 5 tot 7 dagen. Muizen moeten worden geplaatst in een verwarmde kast 's nachts aan post-operatieve hypothermie te voorkomen.

5. Behavioural testen - Intraveneuze Self-administratie

1. Voorafgaand aan gedrags-testen katheters worden gespoeld met 0,9% steriele zoutoplossing. Muizen worden daarna plaatsend in de operant kamers en met de infusie lijnen en infusiepompen. Active hefboompersen resulteren in een 3,2 sec 18 ul infusieperiode combinatie met de belichting van een stimulus licht. Elke hefboom pers wordt gevolgd door een 8 sec time-out periode waarin de stimulus blijft branden.
2. Naar aanleiding van de operante sessie, worden muizen katheters gespoeld met de gehepariniseerde ticarcilline oplossing voordat ze terug naar hun kooi.
3. Muizen mogen zelf toedienen gedurende 3 opeenvolgende 2-uur sessies bij elke dosis. Doses werden in willekeurige volgorde voor elke muis, zoals in het volgende hoofdstuk.
4. Patency katheter wordt dagelijks vastgesteld door zowel de zoutoplossing en antibioticumoplossing kan worden gespoeld door de katheter. Bovendien kan een ketamine / midazolam proef uitgevoerd zoals beschreven in de bijgevoegde referentie ^5. Kortom, tekenen van anesthesie zoals immobiliteit binnen 5 sec van een infuus van 0,02-0,03 ml ketamine (15 mg / ml),of midazolam (0,75 mg / ml) midazolam is het bewijs van een octrooi katheter ^5.

Representative Results

Figuur 1. Het patroon reageren voor intraveneuze drug zelftoediening variëren per geneesmiddel doseringsgebied en muizenstam toegepast. De gepresenteerde figuur toont cocaine zelftoediening data na succesvolle operaties catheterisatie volgens de procedure beschreven in de video. De figuur toont de gemiddelde (± SEM) cocaïne infusies verdiend en de gemiddelde (± SEM) cocaïnegebruik (mg / kg lichaamsgewicht) in een heel scala van 4 cocaïne doses geleverd in een willekeurige volgorde op een FR1 schema van de wapening. Abscis: dosis eigen beheer geneesmiddel per infusie. Links Ordinate: totaal aantal infusies verdiend tijdens de 2-uur operante sessie. Rechts Ordinate: totale cocaïne-inname in mg / kg tijdens de 2-uur testsessie. Alle 13 katheters bleef patent voor de duur van de studie (4 weken). Een one-way ANOVA uitgevoerd op de dosis bleek dat mice werden toedienen cocaïne in een dosis-afhankelijke wijze [F (1,12) = 42,8, p <0,05]. Er is een toename in cocaïnegebruik de dosis-response curve [F (3,36) = 29,6, p <0,05] ondanks een daling hefboom op bij de hogere doses. Elk datapunt representeert het gemiddelde van 3 testsessies bij elke dosis cocaïne (± SEM) verzameld in CD-1 muizen (n = 13 / dosis, mannetjes en vrouwtjes gecombineerd). Vergelijkingen van actieve (drug-versterkte) vs inactieve hendel reageert in de dosis-respons curve werd gemaakt van tweeweg ANOVA opdat muizen onderscheid tussen de twee hendels. Voor de CD1-muizen, de analyse toonde een voorkeur voor de actieve hendel [F (1,12) = 10,255, p <0,05] over de gehele dosis-response curve (gegevens niet getoond).

Discussion

Diermodellen van drugsmisbruik zijn bijzonder bruikbaar bij het begrijpen van de genetische basis van geneesmiddel-gerelateerd gedrag. Bijvoorbeeld, muizen met verschillende genetische profielen tonen erfelijke verschillen in hun gevoeligheid voor cocaïne ^6-8 en helpen identificeren van potentiële gen kandidaten bemiddelen van de fenotypische variabiliteit waargenomen ^9. De intraveneuze katheterisatie procedures beschreven in dit document zijn gebruikt met aanzienlijk succes drug IVSA onderzoeken verschillende stammen van muizen en muizen met verschillende genetische achtergrond ^10.

De procedures die in deze video te markeren belangrijke factoren om op focussen tijdens en na de catheterisatie operatie om betrouwbare intraveneuze zelftoediening gegevens te verkrijgen. Eerste, de plaatsing van de katheterbuis binnen de rechter atrium is essentieel, om catheter niet voorkomen blot stolsels. Tijdens de operatie is het belangrijk ervoor te zorgen dat de cathetereinde is onbelemmerd, en niet afgesloten door ofwel het hart of de ader weefsel. Ten tweede wordt dagelijks katheter doorspoelen nodig zowel voor als na operante sessies om verstoppingen te voorkomen. Tenslotte moet de katheter canule constant bedekt met zowel de canule caps en kristal bedekt wanneer de dieren in hun kooien, de toegang van puin. Kleine verstopping van de katheter canule kan worden verdreven met behulp van een fijne 26 gauge naald, echter dagelijkse spoelen met de gehepariniseerde antibiotische oplossing is vereist, met name op dagen dat de dieren niet worden getest op IVSA.

Voor het uitvoeren van dier overleven een operatie, een goede kennis van aseptische technieken, analgesie en anesthesie nodig is. Hoewel deze video vervangt niet juiste chirurgische training kan worden gebruikt als richtlijn voor onderzoekers die de technieken die noodzakelijk zijn voor dit paradigma verkrijgen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ticarcillin Disodium Salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	1 gram bottle
Tears Naturale P.M (Eye lubricant)	Alcon	N/A	3.5 gram tube This eye lubricant can be found in most pharmacies. Any ophthalmic eye lubricant can be used.
Cocaine	Medisca Pharmaceutique	0723-06	1 gram bottle
Ketamine	Medisca Pharmaceutique	1754-04	25 gram bottle
Midazolam	Medisca Pharmaceutique	2519-06	1 gram bottle
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	250 gram bottle
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	1 gram bottle
Amikicin Sulphate salt	Sigma-Aldrich	A2324-5G	5 gram bottle
Sucrose ACS Reagent	Sigma-Aldrich	S5016-500G	500 gram bottle
Standard mouse catheters with soft mesh	CamCaths	MIVSA/20/26/BC-1S	Tubing specifications: 26SWG;0.451;0.254
Crystal cap applicator	HRS Scientific	313CAC	This is the white catheter cap.
Tygon Micro Bore Tubing	Thomas Scientific	9561S41	Tubing specifications (bore x o.d. x wall thickness in inches): .01 x .03 x .01