Summary
광학 시스템은 FITC-라벨이 적혈구와 간장 microcirculation을 시각화하고 레이저를 이용한 phosphorimetry으로 microvessels에서 산소의 부분 압력을 측정하기 위하여 개발되었습니다. 이 방법은 microvascular 구조, 직경, 혈류 속도 및 산소 장력을 분석하여 생리 및 병리 학적 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
간장 산소 소비가 상대적으로 높은이지만 간장 혈액 공급의 약 70 %가 저조한 위장관과 비장에서 파생된 포털 정맥 혈액을 산소 때문에 산소 공급과 간장의 수요 사이에 상당한 차이가있다. 산소는 sinusoids 통해 중앙 venule에 포털 정맥의 터미널 지점에서 흐르는 혈액에 의해 hepatocytes에 전달하고, 이것은 간장 lobules의 산소 그라디언트를 만들 수 있습니다. 산소 기울기는 업스트림 및 다운 스트림 간장 microcirculation의 효소 표현하지만, 간장 microcirculation의 산소 소비를 측정하기위한 기술의 부족 간장의 산소 대사에 관련된 메커니즘의 해설을 연기했습니다 관련된 중요한 물리적 매개 변수입니다. 따라서 우리는 간장 microcirculation을 시각화하기 위해 FITC-라벨이 적혈구를 사용하고있다 microvessels에서 산소의 부분 압력을 측정하기 위해 레이저를 이용한 phosphorimetry를 사용했습니다. Nonconta중부 표준시과 지속적인 광학 측정은 혈액 흐름 판매율, 선박 직경 및 간장에서의 산소 소비량에 관한 산소 그라디언트를 정할 수 있습니다. 급성 간염 모델에서 우리는 pericentral 영역에 hepatocyte 괴사가 산소 압력을 최대 이동 및 효소 발현에 영향을 미칠 수있다는 의미, 우리는 포털 및 중앙 venules 모두에서 증가 산소 압력지만 sinusoids의 감소 산소 그라데이션을 관찰 생쥐에 아세트 아미노펜을 투여하여 만든 periportal 영역 인치 결론적으로 측정 간장 혈류 역학 및 산소 소비를위한 광학 방법은 간장 질환에 관련된 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.
Protocol
1. 플루오레신 Isothiocyanate 이성질체 I (FITC)와 적혈구에 레이블
우리가 사용하는 모든 실험 프로토콜은 의학 게이오 대학 학부 동물 보호위원회에 의해 승인되었다.
- 기증자 마우스를 마취하고, 제작 후 celiotomy 절개는 헤파린의 소량이 들어있는 1-ML 주사기와 하부 대정 맥에서 온 혈액을 철회. 마우스가 즉시 나트륨 pentobarbital 사출 (100 밀리그램 / kg IP)에 의해 euthanized되었다.
- 스윙 - 양동이 로터의 400g에서 약 5 분 동안 원심 분리하여 PBS (산도 7.4)로 두 번 전체 피를 씻으십시오.
- 100 MM 나 2 HPO 4 5 ML에 FITC의 10 MG를 해산하고 0.22-μm의 모공을 가진 멤브레인로 필터링합니다.
- 시험관 3 밀리미터 포도당의 0.15 ML, 180 MM 100 mm의 저질 2 PO 4, 1.5 ML 2 HPO 4 나의 0.25 ML로 FITC 솔루션 1 ML을 섞는다. R의 0.2 ML 추가기원전 펠렛과 믹싱을 위해 튜브를 누릅니다.
- 4 ° C에서 2 시간 동안 튜브를 유지하고 두 번 PBS의 스테인드 RBCs 씻는다.
- 슬라이드 잔디에 RBC 현탁액 소량을 넣고 RBCs 건강보고 있는지 (즉, 그들의 모양과 크기가 정상이라는)과 형광 강도가 충분한지.
- 산도 7.4의 PBS의 0.9 ML에서 RBCs의 0.1 ML을 일시 중지 및 4에서 정학을 유지 ° C를 주사까지.
2. 산소에 민감한 염료의 작성
- 산도 7.4의 PBS의 10 ML에 BSA 500 MG를 해산.
- 경찰에서 30 밀리그램을 추가 (II)-meso-tetra (4 carboxyphenyl) BSA 솔루션에 porphine (경찰에서 TCPP)과 하룻밤 저어.
- (선택 사항) 무료로 경찰에서 TCPP에서 분리하는 중력 흐름 크로마 토그래피 또는 스핀 컬럼을 사용하여 BSA 바인딩된 경찰에서 TCPP 압축을 풉니다.
- 경찰에서 TCPP 소화 되 다만 제거하고 0.22-μm의 모공을 가진 멤브레인 필터 표면에 뜨는를 필터링 솔루션을 원심 분리기. </ 리>
- -20 ° C.에있는 튜브에 저장 1-ML aliquots 반복 냉동 해동 사이클을 피하십시오.
3. 동물 준비
- microcirculation의 현미경 관찰을 위해서 구멍이 넘는 30 - 음 - 네모 커버 유리 구멍 직경 20 mm, 그리고 테이프로 플라스틱 접시를 준비합니다.
- 마우스를 마취, 피부 모피를 제거하고, 준비. heparinized PBS 가득한 10 cm 폴리에틸렌 (PE 10) 카테터에 연결된 30 G 바늘을 사용하여 약물 주입에 대한 헛된 꼬리에 카테터를 놓습니다.
- 정중 절개 후, 플라스틱 접시에 간장의 주요 lobule을 연장하고, 흉골 드러누움에 마우스를 놓습니다.
- 호흡과 함께 간 이동 및 건조로부터 지키는 억제하는 간장 엽의 가장자리 주변의 부엌 랩 (3mm X 8mm)과 기와 함께 작은 전표를 준비합니다.
- 현미경으로 간장 microcirculation을 (전송 라이트 포함) 관찰 및 확인 그 Blood 흐름은 적어도 15 분 동안보기의 분야에서 더 스테이 시스가 없습니다.
- 천천히 혈액 흐름 관찰이나 PO 2 측정을위한 경찰에서 TCPP 솔루션의 0.2 ML에 대한 fluorescently 분류 RBCs의 0.2 ML 투입. FITC-라벨 RBCs의이 금액은 시각 영역의 순환에있는 모든 RBCs의 1 / 50에 설명할 것입니다.
4. 혈액 흐름 시각화
- 대역 통과 필터 (450-490 nm의) 1 통과했다 수은 램프 표시등으로 irradiating하여 FITC를 자극.
- CCD 카메라로 형광 이미지를 기록합니다.
5. PO 2 측정
PD-TCPP phosphorescence는 상대적으로 약한이며, 높은 감도 탐지기로 감지되어야한다. 모든 실험은 어두운 방에서 실시해야합니다.
- 경찰에서 TCPP의 흡수 피크는 410 nm의와 532 nm의에있다, 그래서 두 번째 고조파 파장 532 nm의은 여기 권장합니다. YAG 펄스 레이저 2 :이 파장은 ND에 의해 생성하실 수 있습니다.
- 거꾸로 현미경의 해당 포트에 YAG 레이저, 그리고 초점 평면의 중앙 위치로 빔 스폿을 조정 : ND에서 광선을 먹이. 공간적 해상도는 핀홀을 통해 빔을 전달하여 변경 레이저 스폿 크기에 따라 달라집니다.
- phosphorescence을 감지하기 위해 긴 패스 필터 (> 620 nm의)와 현미경의 다른 포트에 photomultiplier 튜브 (PMT)을 첨부합니다. PMT는 특히 700 nm의 주위에, 빨간색 파장에 민감한 여야합니다.
- phosphorescence 신호 (500 점, 200 kHz에서에서 샘플을) 샘플과 부패에 지수 함수 맞추하여 부패의 지속 시간을 계산합니다.
- 교정 PO 2 150 mmHg과 0 mmHg로 경찰에서 TCPP 솔루션의 샘플의 두 세트를 준비합니다. 산소 부재를 생산하는 맛보고 dithionite 나트륨에게 볼륨의 1 %를 추가합니다. 7.4에서 시료의 산도와 온도 유지교정하는 동안 37 ° C에서 진짜야.
- 스턴 Volmer 상수 k는 Q와 산소가없는 발광의 감쇠 시간이에게 방정식의 τ 0 (1) 3 수정합니다. 37 ° C와 7.4의 산도에 경찰에서 TCPP 솔루션과 우리의 케이스에서, k는 Q가 374 mmHg -1들 -1이며, τ 0 0.74 MS입니다. 이러한 측정 파라미터는 장비 (예 : 레이저, 검출기, 기타 광학 기기) 및 신호 처리 방법에 의존하므로 교정은 각 측정 시스템 4 필요합니다.
τ 0 / τ = 1 + K Q • τ 0 • PO 2 (1) - 현미경 스테이지에있는 접시에 마우스를 설정 간장 microcirculation을 관찰하고, 레이저 스폿의 포인트로 대상 microvessel의 위치를 조정합니다.
6. 간염 모델
- 하룻밤 물에 무료로 이용할 수있는 빠른 생쥐.
- 준비20 DMSO의 아세트 아미노펜 (APAP)의 ML 솔루션 당 밀리그램.
- 한 ml/100 g BW (예, 200 밀리그램 / kg BW)에 intraperitonealy 그것을 주사. 주사 후, 마우스는 음식과 물을 5 ~ 무료로 액세스할 수있는 권한을 부여하실 수 있습니다.
- 24시간 주입 후에 마우스를 마취하고 중앙 분리대를 절개하여 간장을 폭로. 간염이 달성되면 pericentral 지역의 괴사가 육안으로 쉽게 볼 수 있습니다.
7. 대표 결과
간장 microcirculation의 예제 이미지는 () 전송 - 밝은 이미지 그리고 (b) 형광 이미지입니다 그림 1에 표시됩니다. 개인 FITC-라벨 적혈구는 비디오 영화에서 관찰되며, 포털 venules, sinusoids, 그리고 중앙 venules은 혈액 흐름 방향으로 인정받고 있습니다.
그림 2에 표시된 바와 같이, x100 목표 렌즈를 통해 중앙 venule을 irradiating 레이저 스폿은 approxim였다직경 10 μm의 ately. 간장 microcirculation의 Intravascular PO 2 수컷 C57BL / 6 마우스로 측정하고, 그림 3 (가) PO 2와 포털 및 중앙 venules의 혈관 직경 사이의 관계를 보여줍니다. sinusoids 통과하면서 중앙 venules으로 포털에서 PO 2 그라디언트 효율적으로 해당 RBCs 릴리스 산소를 나타냅니다. 그림 3 (B)와 같이 평균 PO 2는 포털 혈관, sinusoids에서 48.2 mmHg, 그리고 중앙 venules에서 38.9 mmHg에서 59.8 mmHg였다.
우리가 APAP intraperitonealy을 주입하여 급성 간염을 생산하면, intravascular PO 2가 현저히 간장 microcirculation의 각 부분에서 상승했습니다 : P sinusoids 및 중앙 정맥 (그림 3 (C))에 포털 정맥, P <0.01에서 <0.05.
그림 1. 낮은 배율 전mages는 (a) 전송 가벼운 및 (b) 형광과 간장 microcirculation을 보여주고 있습니다.
그림 2. PO 2 측정을위한 타겟이 중앙 venule을 irradiating 레이저 스폿의 이미지.
건강한 제어 생쥐와 아세트 아미노펜 유발 간장 손상과 생쥐의 간장 microcirculation의 그림 3. PO 2 구배. () PO 2 대 포털 venules (PV)와 중앙 venules (CV)에 대한 혈관 직경을 보여줍니다, 그리고 (b) sinusoids (S)를 통해 PV에서 이력서에 산소 그라데이션을 보여줍니다. PV와 CV 사이 포이 차이는 hepatocytes 또는 기타 parenchymal 세포의 산소 소비를 반영합니다. (C) APAP 행정부에 의해 유도된 간염 조건, PO 2는 상당히 PV, S, 그리고 CV 및 PO 2 상승되었음을 보여줍니다기울기는 간장 산소 소비가 손상되었음을 나타냅니다 감소.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
조직에 산소를 전달하는 것은 microcirculation의 필수적인 역할이며, 논문의 많은 microvessel 해부학 및 레올로지 6에 관련된 질병을 설명합니다. 간 혈액 흐름이 동맥과 정맥 혈액의 조합입니다. 간장에 혈액 흐름의 약 30 %가 포털 정맥에 의해 제공 간장 동맥 및 기타 70 %에 의해 제공된 잘 산소를 혈액이며, 비장과 위장관 7 저조한 산소를 혈액 정맥 유출입니다. 이러한 지방간, 충격, 또는 종양 변화 간장 microcirculation의 혈액 흐름과 같은 간 질환. 조직 산소를 확인하려면, 하나 microcirculation의 혈류와 산소 농도를 모두 측정해야합니다. 간장 microcirculation에서 이러한 측정을 만들기위한 상용 악기의 부족은 어려운이 분야에서 생리 데이터를 얻기 위해 만들었습니다.
동물의 준비 단계에서 중요한 부분의 고정은플라스틱 접시에 간장. 간장의 움직임에 루스 고정 결과는 미세한 관찰을 방해하고 분석을 어렵게 만드는 호흡,와 동기화. 꽉 고정 그러나, 혈액 흐름이 정지된를 일으 킵니다. 혈액 흐름 조건 수술 절차를 수행하는 동안 저전력 현미경 불구하고 관찰해야한다. 하이 파워 레이저 쉽게 microvessels을 해치다, 방사선의 빈도를 최소화해야하므로. 1 Hz에서는 일반적으로 시간적 측정 8에 대한 충분하다. 그러나, PO 2의 단일 측정 반복 주파수는 필요에 따라 신속한 PO 2 변화 1 kHz에서로 증가 할 수있다는 것을 의미합니다 미만 일 MS를 걸립니다. 또한, PD-TCPP의 광화학 반응 일중 산소 그 피해 microvessels를 생성하고 혈소판 응집 9 유도합니다. 형광 이미징과 PO 2 측정의 조합은 모두 함께 혈류 역학 및 산소 농도를 측정할 수 있습니다. 수은 램프 조사흥미로운 FITC 또한함으로써 많은 일중 산소를 생성하고 혈액 흐름이 정지된로 이어지는 그러나, PD-TCPP 흥분. 경찰에서 TCPP가 투여되기 전에 혈류와 산소 장력 모두 동일한 동물로 측정하는 경우 FITC 이미징 다해야합니다. 또한, 조직의 산소 수준은 조직의 산소 소비량을 나타내는 것입니다. 그것은 실험을하는 동안 호흡 관리를 수행하거나 실험 후에 혈액 가스 수치를 분석하는 것이 바람직합니다.
APAP 높은 복용량이 pericentral 지역 10 세포 괴사를 가져올 것으로 알려져 있기 때문에 우리는 부분적으로 급성 간염을 유발하는 APAP를 사용했습니다. 부분 산소 압력 측정 PO 2 간장 microcirculation에 걸쳐 높은 것을 제어 마우스의 포털 venules 및 중앙 venules 사이 20.9-mmHg PO 2 차이 APAP-대우 생쥐에서 16.9 mmHg로 감소했다합니다. 간장 microcirculation의 산소 기울기는 주로 산소 suppl의 결과입니다hepatocytes에서 소비되는 포털 venules에서 지휘. APAP의 높은 복용량은 pericentral 지역 11, 12에 괴사를 유도하고, 그림 3C와 같이 하류 산소 소비량을 줄일 수 있습니다. 간 간염, 조직 괴사와 산소 수준 사이의 관계, 특히, 괴사의 범위에 부량, 그리고 빌리루빈, ALT, 대서양 표준시, 그리고 염증 크린 시토킨의 혈청 수준을 근본 상세한 메커니즘을 파악하기 위해서는 측정해야합니다. 간 질환의 많은 간 조직의 혈액 흐름 분포, 산소 공급, 산소 소비, 즉 간장 microcirculation 관련이 있습니다. 만성 알코올 섭취의 경우에는 알코올의 10-15 % 정도는 microsomal 에탄올 산화 시스템에 의해 대사, 그리고 알코올 유발 분자 P450IIE1는 NAPQI 13 pericentral hepatocyte 괴사 14 이끌고 그 독성 신진 대사를 생성합니다.
결론적으로, 우리의 광학 내 잘못surement 방법은 microvascular 구조, 직경, 혈류 속도 및 산소 장력을 분석하여 생리 및 병리 학적 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원 및 도움을 실험 양 리사 오츠카 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 교육부, 과학, 스포츠와 문화에 의해 지원되었다 부여 - 에이드의 젊은 과학자 (B), 2010, 22700476, 그리고 KT에 대한 Suzuken 기념 재단은 2010 년이 연구가의 연구 개발에 의해 지원되었다위한 생활 물질, MEXT의 차세대 슈퍼 컴퓨터 프로젝트의 개발 및 사용의 일부, 그리고 일본 표준시 ERATO Suematsu 가스 생물학 프로젝트에 의해 일부의 차세대 통합 시뮬레이션.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine | Frontier Scientific, Inc. | PdT790 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich Co. | F7250 | |
| Acetaminophen | Sigma-Aldrich Co. | A7085 | |
| Equipment | |||
| photomultiplier tube | hamamatsu photonics k.k | H10722-20 | |
References
- Ishikawa, M., Sekizuka, E., Shimizu, K., Yamaguchi, N., Kawase, T. Measurement of RBC velocities in the rat pial arteries with an image-intensified high-speed video camera system. Microvasc. Res. 56, 166-172 (1998).
- Tsukada, K., Sekizuka, E., Oshio, C., Tsujioka, K., Minamitani, H. Red blood cell velocity and oxygen tension measurement in cerebral microvessels by double-wavelength photoexcitation. J. Appl. Physiol. 96, 1561-1568 (2004).
- Stern, O., Volmer, M. Über die Abklingzeit der Fluoreszenz. Physik. Zeitschr. 20, 183-188 (1919).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: a novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Soga, T. Differential metabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione consumption. J. Biol. Chem. 281, 16768-16776 (2006).
- Goda, N. Distribution of heme oxygenase isoforms in rat liver. Topographic basis for carbon monoxide-mediated microvascular relaxation. J. Clin. Invest. 101, 604-612 (1998).
- Grote, J. Physiologie der Menschen. , 20th edn, Springer-Verlag. New York. 560 (1980).
- Suganuma, K. Erythrocytes with T-state-stabilized hemoglobin as a therapeutic tool for postischemic liver dysfunction. Antioxid Redox Signal. 8, 1847-1855 (2006).
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based upon quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Bernal, W., Auzinger, G., Dhawan, A., Wendon, J.
- Hinson, J. A., Roberts, D. W., James, L. P.
- Hinson, J. A., Reid, A. B., McCullough, S. S., James, L. P. Acetaminophen-induced hepatotoxicity: role of metabolic activation, reactive oxygen/nitrogen species, and mitochondrial permeability transition. Drug Metab. Rev. 36, 805-822 (2004).
- Lieber, C. S. Medical disorders of alcoholism. N. Engl. J. Med. 333, 1058-1065 (1995).
- Zimmerman, H. J., Maddrey, W. C. Acetaminophen (paracetamol) hepatotoxicity with regular intake of alcohol: analysis of instances of therapeutic misadventure. Hepatology. 22, 767-773 (1995).
