Summary
Оптическая система была разработана для визуализации печеночной микроциркуляции с FITC-меченных эритроцитов и измерять парциальное давление кислорода в микрососудах с помощью лазера phosphorimetry. Этот метод может быть использован для исследования физиологических и патологических механизмов, с помощью анализа микрососудистых структуры, диаметр, скорость кровотока и напряжения кислорода.
Abstract
Существует значительное расхождение между спросом и предложением кислорода в печень, потому что потребление кислорода печеночной относительно высока, но около 70% кровоснабжения печеночных слабо насыщенной кислородом крови воротной вены, полученные из желудочно-кишечного тракта и селезенки. Кислород поступает в гепатоциты от крови, текущей из терминала ветви воротной вены к центральной венулы через синусоиды, и это делает кислорода градиент в печеночных долек. Градиент кислорода является важным физическим параметром, который включает в себя выражение ферментов вверх и вниз по печеночной микроциркуляции, но отсутствие методов измерения потребления кислорода в печеночной микроциркуляции задержал выяснение механизмов, связанных с кислородного обмена в печени. Поэтому мы использовали FITC-мечеными эритроцитами для визуализации печеночной микроциркуляции и использовать с помощью лазера phosphorimetry измерять парциальное давление кислорода в микрососудах там. NoncontaКТ и непрерывного оптического измерения можно количественно скоростей кровотока, судно диаметров и кислорода градиенты, связанные с потреблением кислорода в печени. В остром гепатите модель мы сделали путем введения парацетамола для мышей мы наблюдали повышенном давлении кислорода в обоих портала и центральной венулы, но снижение кислорода градиент в синусоиды, указывая, что некроз гепатоцитов в зоне перицентральный может измениться давление кислорода и фермента влияет на выражение в зоне перипортальный. В заключение нашего оптических методов измерения печеночной гемодинамики и потребления кислорода может выявить механизмы, связанные с заболеваниями печени.
Protocol
1. Маркировка Эритроциты с флуоресцеина изотиоцианат изомера I (FITC)
Все экспериментальные протоколы мы использовали, были утверждены Комитетом Animal Care в университете Кейо в Школе медицины.
- Обезболить доноров мышей, и, сделав разрез лапаротомия снять цельной крови из нижней полой вены с 1-мл шприц, содержащий небольшое количество гепарина. Мышь была немедленно подвергнута эвтаназии натрия фенобарбитала инъекций (100 мг / кг).
- Вымойте цельной крови в два раза с PBS (рН 7,4) центрифугированием в течение 5 минут при 400 гр в качающийся-ротором.
- Растворите 10 мг FITC в 5 мл 100 мМ Na 2 HPO 4 и фильтровать с мембраной с 0.22-мкм поры.
- В пробирке смешивают 1 мл раствора с FITC 0,15 мл 3 мМ глюкозы, 0,25 мл 180 мМ NaH 2 PO 4 и 1,5 мл 100 мМ Na 2 HPO 4. Добавить 0,2 мл RДо н.э. гранул и нажмите трубки для смешивания.
- Держите трубку в течение 2 часов при температуре 4 ° C, а затем вымыть окрашенных эритроцитов в ФБР в два раза.
- Нанесите небольшое количество суспензии эритроцитов на слайде травы и посмотреть, если эритроциты выглядят здоровыми (то есть, что их форма и размеры нормальные), а также о том, что интенсивность флуоресценции достаточно.
- Приостановить 0,1 мл эритроцитов в 0,9 мл PBS при рН 7,4, и сохранить подвеску на 4 ° C до инъекции.
2. Подготовка чувствительные к кислороду краска
- Растворите 500 мг BSA в 10 мл PBS при рН 7,4.
- Добавить 30 мг Pd (II)-мезо-тетра (4-карбоксифенил) порфина (Pd-TCPP) к решению BSA и перемешать в течение ночи.
- (Опционально) Извлечение BSA связанных Pd-TCPP с помощью гравитационного потока хроматографии или спин колонки, чтобы отделить его от свободных Pd-TCPP.
- Центрифуга решение для удаления нерастворенных Pd-TCPP и фильтрацию супернатанта с мембранным фильтром с 0.22-мкм поры. </ LI>
- Магазин 1-мл порции в трубах при температуре -20 ° C. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.
3. Подготовка животных
- Для микроскопического наблюдения микроциркуляцию подготовить пластмассовую пластинку с отверстием диаметром 20 мм, а ленты 30 мм, квадрат квадратные стеклянные крышки с отверстием.
- Анестезию мыши, удалить шерсть, и подготовительные кожи. Поместите катетер в хвост напрасно инъекционных наркотиков с помощью иглы 30 G связано с 10-см полиэтилена (ПЭ 10) катетер заполнены гепаринизированной PBS.
- После того, как средний разрез, расширить основной дольки печени на пластиковой пластиной, и поместите курсор в лежачее положение грудины.
- Подготовить небольшие промахи с кухней упаковка (3 мм х 8 мм) и плитку их по краю доли печени препятствовать перемещению печени с дыханием и сохранить его от высыхания.
- Соблюдайте печеночной микроциркуляции под микроскопом (в проходящем свете), и убедитесь, что бlood поток не имеет застой в поле зрения, по крайней мере 15 мин.
- Медленно вводят 0,2 мл флуоресцентно меченных эритроцитов в крови наблюдения потока или 0,2 мл Pd-TCPP решение для измерения рО 2. Это количество FITC-меченных эритроцитов составит 1/50 всех эритроцитов в обращении визуализировать региона.
4. Визуализация кровотока
- Возбуждает FITC путем облучения его светом ртутных ламп, которая прошла через полосовой фильтр (450-490 нм) 1.
- Запишите флуоресцентные изображения с ПЗС-камерой.
5. рО 2 измерения
Pd-TCPP фосфоресценции относительно слаба и должна быть определена с высокой чувствительности детектора. Все эксперименты должны быть выполнены в темной комнате.
- Полосы поглощения Pd-TCPP это при 410 нм и 532 нм, так что второй гармоники волны 532 нм рекомендуется для возбуждения. Эта длина волны может быть порожден Nd: YAG лазерного импульса 2.
- Поток пучка из Nd: YAG лазера в соответствующий порт на инвертированного микроскопа и отрегулируйте световое пятно на центральное место в фокальной плоскости. Пространственное разрешение зависит от размера лазерного пятна, которые изменились, передавая пучка через отверстия.
- Чтобы обнаружить свечение, приложите длинный фильтр (> 620 нм) и фотоумножителя (ФЭУ) на другой порт микроскопа. PMT должны быть чувствительны к красному длин волн, особенно около 700 нм.
- Попробуйте фосфоресценции сигнала (500 точек дискретизации 200 кГц) и вычислить постоянную времени распада путем установки экспоненциальной функции к распаду.
- Для калибровки подготовить два набора образцов Pd-TCPP решение с рО 2 150 мм рт.ст., 0 мм рт. Добавить дитионита натрия 1% по объему образца для получения отсутствие кислорода. Хранить рН образцов при 7.4 и температурытуры при 37 ° C во время калибровки.
- Закрепите Штерна-Фольмера постоянной K Q и кислород свободного времени затухания люминесценции τ 0 в уравнении (1) 3. В нашем случае, с Pd-TCPP решений при 37 ° С и рН 7,4, к д 374 мм рт.ст. -1 с -1 и τ 0 0,74 мс. Эти измерения параметров зависят от оборудования (лазерные, детектор, другие оптические устройства) и метод обработки сигнала, поэтому калибровка необходима в каждом измерении система 4.
τ 0 / τ = 1 + K Q • τ 0 • рО 2 (1) - Установите мышь на тарелке на столике микроскопа, наблюдать печеночной микроциркуляции, и отрегулировать положение целевой микрососудов до точки лазерного пятна.
6. Гепатит модели
- Быстрый мышей со свободным доступом к воде на ночь.
- Подготовьте20 мг на мл раствора ацетаминофен (APAP) в ДМСО.
- Вводите его intraperitonealy на 1 мл на 100 г массы тела (например, 200 мг / кг массы тела). После инъекции мыши может быть предоставлен свободный доступ к пище и воде 5.
- 24 часов после инъекции, анестезия мыши и подвергать печень, сделав разрез средней. Если гепатит достигается, некрозы в перицентральный регионе будет легко видна невооруженным глазом.
7. Представитель Результаты
Пример изображения печеночной микроциркуляции показано на рисунке 1, где (а) проходящего света изображение и (б) флуоресценции изображение. Индивидуальные FITC-меченных эритроцитов наблюдаются в видео фильм, и портала венул, синусоидов и центральных венул признаны направления кровотока.
Как показано на рисунке 2, лазерного пятна облучения центральной венулы через объектив x100 был approximately 10 мкм в диаметре. Внутрисосудистое рО 2 в печеночной микроциркуляции определяли в мужской C57BL / 6, а на рисунке 3 (а) показывает отношения между рО 2 и диаметр сосуда в портале и центральной венул. РО 2 градиент от портала центральной венулы показывает, что эритроциты выделения кислорода эффективно при прохождении через синусоиды. Как показано на рисунке 3 (б), средняя рО 2 была 59,8 мм рт.ст. в портале суда, 48,2 мм в синусоиды, и 38,9 мм в центральной венулы.
Когда мы произвели острого гепатита, вводя APAP intraperitonealy, внутрисосудистого рО 2 был значительно повышен в каждой части печеночной микроциркуляции: р <0,05 в воротной вены и р <0,01 в синусоиды и центральные вены (рис. 3 (с)).
Рисунок 1. Низким увеличением яМаги показывает печеночной микроциркуляции с (а) проходящего света и (б) флуоресценции.
Рисунок 2. Изображение лазерного пятна облучения целевых центральной венулы для измерения рО 2.
Рисунок 3. РО 2 градиент в печеночной микроциркуляции здоровых контрольных мышей и мышей с ацетаминофен вызванных печеночной травмы. () Показывает, рО 2 по сравнению с диаметром сосудов портальных венул (PV) и центральной венулы (CV), и (б) показывает, кислорода градиент от PV к резюме через синусоиды (S). РО 2 разница между PV и CV отражает потребления кислорода гепатоцитами или других паренхиматозных клеток. (С) показывает, что в условиях гепатит индуцированных APAP администрации, рО 2 был значительно повышен в PV, S, и резюме и рО 2градиент уменьшился, указывая, что потребление кислорода печеночной был скомпрометирован.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Доставка кислорода к тканям является важной роли микроциркуляцию, и многие документы описывают заболеваний, связанных с микрососудов анатомии и реология 6. Печень поток крови представляет собой сочетание артериальной и венозной крови. Около 30% притока крови к печени хорошо кислородом крови осуществляется печеночной артерии, а другой 70%, предусмотренных воротной вены, это плохо кислородом отток венозной крови из селезенки и желудочно-кишечного тракта 7. Заболевания печени, таких как ожирение печени, шок, или опухоль изменения кровотока в печеночной микроциркуляции. Для определения оксигенации тканей, нужно измерить и поток крови и кислорода в микроциркуляции. Отсутствие коммерчески доступных инструментов для создания этих измерений в печеночной микроциркуляции сделал это трудно получить физиологических данных в этой области.
Важным шагом животных препарат фиксацииПечень на пластиковой тарелке. Свободная фиксация результатов в печени движение синхронизировано с дыханием, которые мешают микроскопических наблюдений и делает анализ трудным. Жесткая фиксация, однако, вызывает приток крови застой. Условия кровотока следует соблюдать хотя маломощные микроскопом во время оперативных процедур. Мощные лазеры легко повредить микрососудов, так что частота излучения должны быть минимизированы. 1 Гц, как правило, достаточно для временных измерений 8. Тем не менее, одного измерения рО 2 занимает менее 1 мс, что означает, что частота повторения может быть увеличена до 1 кГц для быстрой рО 2 изменения, по мере необходимости. Кроме того, фотохимические реакции Pd-TCPP генерирует синглетный кислород, что повреждения микрососудов и стимулирует агрегацию тромбоцитов 9. Комбинация флуоресценции и рО 2 измерений можно измерить кровоток динамики и концентрации кислорода все вместе. При облучении ртутной лампызахватывающий FITC также возбуждает Pd-TCPP, однако, генерируя тем самым значительно синглетного кислорода и приводит к застою кровообращения. Когда оба потока крови и напряжение кислорода измеряется в тех же животных, изображениями FITC должно быть сделано до Pd-TCPP вводится. Кроме того, системный уровень кислорода свидетельствует о потреблении кислорода в ткани. Желательно выполнять дыхательные управления в ходе экспериментов или анализа газов крови после эксперимента.
Мы использовали APAP, чтобы вызвать острый гепатит, отчасти потому, что высокие дозы APAP, как известно, приводит к некрозу клетки в перицентральный области 10. Частичное измерения давления кислорода показал 20,9-мм рО 2 разница между портал венул и центральной венулы в контрольных мышей снизилась до 16,9 мм в APAP обработанных мышей и рО 2 был выше всей печеночной микроциркуляции. Градиент кислорода в печеночной микроциркуляции является в основном результатом кислорода полняющемуСВУ от портала венул потребляется в гепатоциты. Чем выше доза APAP вызывает некроз перицентральный области 11, 12, и которая может привести к снижению потребления кислорода ниже по течению, как показано на рисунке 3в. Чтобы определить детальные механизмы, лежащие в основе печени гепатит, особенно в отношениях между некроз ткани и уровень кислорода, количественная оценка степени некроза и сывороточных уровней билирубина, АЛТ, АСТ, воспалительных цитокинов и должны быть измерены. Многие заболевания печени связанные с печеночной микроциркуляции, другими словами, к распределению кровотока, доставки кислорода и потребление кислорода в ткани печени. В случае хронического потребления алкоголя, около 10-15% спирта метаболизируется в микросомальной этанол-окислительной системы и вызванные алкоголем молекулы P450IIE1 генерирует NAPQI 13 токсичных метаболитов, что приводит к некрозу гепатоцитов перицентральный 14.
В заключение нашего оптических измеренийизмерении метод может быть использован для исследования физиологических и патологических механизмов, с помощью анализа микрососудистых структуры, диаметр, скорость кровотока и напряжения кислорода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят г-жа Риза Otsuka для оказания технической помощи и помощи экспериментов. Это исследование было частично при поддержке Министерства образования, науки, спорта и культуры, субсидия для молодых ученых (B), 2010, 22700476, и Suzuken Мемориального фонда 2010 года для KT И эта работа была поддержана исследований и развития Следующее поколение комплексного моделирования живого вещества, часть разработки и использования нового поколения суперкомпьютерного проекта МПКСНТ, и частично JST ERATO Suematsu проекта биологии газа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine | Frontier Scientific, Inc. | PdT790 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich Co. | F7250 | |
| Acetaminophen | Sigma-Aldrich Co. | A7085 | |
| Equipment | |||
| photomultiplier tube | hamamatsu photonics k.k | H10722-20 | |
References
- Ishikawa, M., Sekizuka, E., Shimizu, K., Yamaguchi, N., Kawase, T. Measurement of RBC velocities in the rat pial arteries with an image-intensified high-speed video camera system. Microvasc. Res. 56, 166-172 (1998).
- Tsukada, K., Sekizuka, E., Oshio, C., Tsujioka, K., Minamitani, H. Red blood cell velocity and oxygen tension measurement in cerebral microvessels by double-wavelength photoexcitation. J. Appl. Physiol. 96, 1561-1568 (2004).
- Stern, O., Volmer, M. Über die Abklingzeit der Fluoreszenz. Physik. Zeitschr. 20, 183-188 (1919).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: a novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Soga, T. Differential metabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione consumption. J. Biol. Chem. 281, 16768-16776 (2006).
- Goda, N. Distribution of heme oxygenase isoforms in rat liver. Topographic basis for carbon monoxide-mediated microvascular relaxation. J. Clin. Invest. 101, 604-612 (1998).
- Grote, J. Physiologie der Menschen. , 20th edn, Springer-Verlag. New York. 560 (1980).
- Suganuma, K. Erythrocytes with T-state-stabilized hemoglobin as a therapeutic tool for postischemic liver dysfunction. Antioxid Redox Signal. 8, 1847-1855 (2006).
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based upon quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Bernal, W., Auzinger, G., Dhawan, A., Wendon, J.
- Hinson, J. A., Roberts, D. W., James, L. P.
- Hinson, J. A., Reid, A. B., McCullough, S. S., James, L. P. Acetaminophen-induced hepatotoxicity: role of metabolic activation, reactive oxygen/nitrogen species, and mitochondrial permeability transition. Drug Metab. Rev. 36, 805-822 (2004).
- Lieber, C. S. Medical disorders of alcoholism. N. Engl. J. Med. 333, 1058-1065 (1995).
- Zimmerman, H. J., Maddrey, W. C. Acetaminophen (paracetamol) hepatotoxicity with regular intake of alcohol: analysis of instances of therapeutic misadventure. Hepatology. 22, 767-773 (1995).
