Summary
Bir optik sistem FITC-etiketli eritrosit ile karaciğer mikro görselleştirmek ve lazer yardımlı phosphorimetry ile kılcal oksijen kısmi basıncı ölçmek için geliştirilmiştir. Bu yöntem, mikrovasküler yapısı, çapı, kan akış hızı, ve oksijen gerilimi analiz ederek fizyolojik ve patolojik mekanizmalar araştırılması için de kullanılabilir.
Abstract
Hepatik oksijen tüketimi nispeten yüksektir ancak hepatik kan akımı yaklaşık% 70 az gastrointestinal sistem ve dalak türetilen portal ven kan oksijenli olduğu için oksijen kaynağı ve karaciğerde talep arasındaki önemli bir fark vardır. Oksijen sinüzoidler üzerinden merkezi bir venül için portal ven bir terminal dalı akan kan ile hepatositler teslim ve bu hepatik lobülleri bir oksijen gradiyenti yapar. Oksijen gradyanı yukan ve aşağı hepatik mikrodolaşım Enzimlerin ifadesi, fakat hepatik mikrodolaşım oksijen tüketimi ölçülmesi için teknikler eksikliği karaciğer içindeki oksijen metabolizması ilgili mekanizmaları aydınlatılması geciktirmiştir içerir önemli fiziksel bir parametredir. Bu nedenle karaciğer mikrosirkülasyonu görselleştirmek için FITC etiketli eritrositleri kullanılmış ve burada kılcal oksijen kısmi basıncı ölçmek için lazer yardımlı phosphorimetry kullanılır. Noncontact ve sürekli optik ölçüm kan akım hızları, damar çapları ve karaciğerde oksijen tüketimi ile ilgili oksijen degradeler ölçmek olabilir. Akut hepatit modeli biz perisentral bölgesinde hepatosit nekrozu oksijen basıncı yukarı kayar ve enzim ifade etkileyebilir belirten, biz portal ve santral venüller hem artmış oksijen basıncı ancak sinüzoidlerdeki azalmış oksijen gradiyenti gözlendi farelere asetaminofen ile sağlandı periportal bölgede. Sonuç olarak, ölçme hepatik hemodinamik ve oksijen tüketimi için optik yöntemlerle karaciğer hastalığı ile ilgili mekanizmaların ortaya çıkarabilir.
Protocol
1. Floresein izotiyosiyanat izomer I (FITC) ile Eritrositler Etiketleme
Kullanılan tüm deneysel protokolleri Keio Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.
- Bir donör fareler uyutmak ve yaptıktan sonra bir Seliotomide kesi heparin az miktarda içeren 1 ml şırınga ile vena kava tam kan çekilme. Fare hemen sodyum pentobarbital enjeksiyon (100 mg / kg ip) tarafından ötenazi edildi.
- Bir sallanma-kova rotor içinde 400 g hızında 5 dakika süreyle santrifüjlenerek PBS (pH 7.4) ile iki kez tam kan yıkanır.
- 100 mM Na 2 HPO 4, 5 ml içinde FITC 10 mg eritilir ve 0.22 um-gözeneklere sahip olan bir zar ile filtre.
- Bir test tüpü 3 mM glukoz 0.15 ml, 180 mM 100 mM NaH 2 PO 4 ve 1.5 ml 2 HPO 4 Na 0.25 ml FITC çözeltinin 1 ml karıştırın. R 0.2 ml ilave edilirM.Ö. pelet ve karıştırma için tüp dokunun.
- 4 ° C'de 2 saat boyunca boru tutmak ve sonra iki defa PBS ile boyanmış kırmızı kan yıkanır.
- Slayt çim eritrosit süspansiyonu küçük bir miktar koyun ve eritrositler sağlıklı bakarsanız bakın (yani, onların şekil ve boyutları normal olduğunu) ve floresan yeterli olduğunu.
- PH 7.4 'te PBS 0.9 ml RBCs 0.1 ml Askıya, ve 4 süspansiyon tutmak ° C enjeksiyona kadar.
2. Oksijen-duyarlı Dye hazırlanması
- PBS pH 7.4 'te 10 ml BSA, 500 mg eritilir.
- Pd 30 mg ekleme (II)-mezo-tetra (4-karboksifenil) BSA çözeltisi ile porphine (Pd-TCPP) ve gece boyunca karıştırılır.
- (İsteğe bağlı) ücretsiz Pd-TCPP ayırmak için yerçekimi akışı kromatografisi veya bir spin kolon kullanarak BSA bağlı Pd-TCPP ayıklayın.
- Pd-TCPP çözünmemiş kaldırmak ve 0.22-mikron gözeneklere sahip bir membran filtre ile süpernatant filtrelemek için çözüm santrifüjleyin. </ Li>
- -20 ° C'de tüpler Mağaza 1 ml hacimde Tekrarlanan donma-erime döngüleri kaçının.
3. Hayvan Hazırlık
- Mikrodolaşım mikroskobik gözlem için delik üzerinde 30 mm kare kare cam kapak bir delik 20 mm çapında ve bant ile plastik bir tabak hazırlayın.
- Bir fare uyuştur, deri kürk kaldırmak ve hazırlık. Heparinize PBS ile doldurulmuş bir 10 cm'lik bir polietilen (PE 10) bağlı bir kateter 30 G iğne kullanılarak madde enjeksiyon için boşa kuyruk bir kateter yerleştirin.
- Median insizyon sonra, plastik plaka üzerinde bir karaciğer ana lobülü genişletmek ve sternal pozisyonda bulunan fare yerleştirin.
- Solunum ile karaciğerin hareketli ve kurumasını tutarak inhibe hepatik lobun kenarında mutfak wrap (3 mm x 8 mm) ve çini onlarla küçük fişleri hazırlayın.
- Mikroskop altında hepatik mikrosirkülasyonu (iletilen ışık ile) dikkat edin, onaylayın ki blood akışı, en azından 15 dakika süreyle görüş alanını herhangi bir durağanlığın sahiptir.
- Yavaş yavaş kan akımı gözlem veya pO 2 ölçümü için Pd-TCPP çözüm 0.2 ml floresan ile işaretlenmiş eritrositler 0.2 ml enjekte edilir. FITC-etiketli eritrositler Bu miktar görüntülenmiştir bölgede dolaşımda bulunan tüm eritrositler 1/50 sorumlu olacaktır.
4. Kan Akış Görselleştirme
- Bandpass (450-490 nm) 1 geçti civa lambası ile irradyasyonu ile FITC heyecanlandırıyor.
- Bir CCD kamera ile floresan görüntüyü kaydedin.
5.. pO 2 Ölçme
Pd-TCPP fosforesans oldukça zayıf olup, yüksek hassasiyetli dedektör ile tespit edilmelidir. Bütün deneyler bir karanlık odaya yapılması gerekir.
- Pd-TCPP emilimi pikleri 410 nm ve 532 nm, bu nedenle ikinci harmonik dalga boyu 532 nm eksitasyon için tavsiye edilir. YAG lazer pulse 2: Bu dalga boyu Nd tarafından oluşturulabilir.
- Inverted mikroskop uygun portuna YAG lazer ve odak düzlemi merkezi bir konuma ışın spot ayarlayın: Nd ışın besleyin. Uzaysal çözünürlüğü, bir iğne deliğinden ışını geçirilerek değiştirildiğinde lazer spot büyüklüğü, bağlıdır.
- Fosforesans saptamak için, uzun bir geçiş filtresi (> 620 nm) ve mikroskop diğer portuna bir photomultiplier tüpü (PMT) takabilirsiniz. PMT özellikle 700 nm çapında, kırmızı dalga boyları karşı duyarlı olmalıdır.
- Fosforesans sinyali (500 puan 200 KHz) tadın ve çürüme bir üstel fonksiyonu takarak çürüme zaman sabitini hesaplayabilirsiniz.
- Kalibrasyon için pO 2 150 mmHg ve 0 mmHg Pd-TCPP çözüm örneklerinin iki set hazırlayın. Oksijen yokluğunda üretmek için örneklemek üzere sodyum ditionit hacim olarak% 1 ekleyin. 7,4 azından örnekleri arasında pH ve sıcaklık tutmakKalibrasyon sırasında 37 ° C 'de Ture.
- Stern-Volmer sabiti k q ve oksijensiz lüminesans yıkım zamanı denklemde τ 0 (1) 3 Fix. 37 ° C ve 7.4 pH Pd-TCPP çözümleri ile bizim durumda, k q 374 mmHg -1 s -1 ve τ 0 0.74 ms. Bu ölçüm parametreleri ekipmanı (yani lazer, dedektör, diğer optik cihazlar) ve sinyal işleme yöntemine bağlıdır, bu yüzden her kalibrasyon ölçüm sistemi 4 gereklidir.
τ 0 / τ = 1 + q k 0 • • τ pO 2 (1) - Mikroskop sahnede plaka üzerinde fare ayarlayın, hepatik mikrosirkülasyonu gözlemlemek ve lazer nokta nokta hedef mikrodamar pozisyonunu ayarlayın.
6. Hepatit modeli
- Gecede suya ücretsiz erişim ile hızlı fare.
- Bir hazırlayın20 DMSO asetaminofen (APAP) ml çözelti başına mg.
- 1 ml/100 gr bw (yani, 200 mg / kg) intraperitoneal olarak enjekte. Enjeksiyonundan sonra, fare yiyecek ve su 5 serbest erişim verilebilir.
- Enjeksiyondan 24 saat sonra, fare uyutmak ve median insizyon yaparak karaciğer maruz bırakmaktadır. Hepatit elde edilirse, perisentral bölgede nekroz çıplak gözle kolayca görülebilir.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Hepatik mikrodolaşım Örneği görüntü (a) iletilen bir ışıklı görüntü ve (b), flöresanlı bir resimdir Şekil 1 'de gösterilmektedir. Bireysel FITC etiketli eritrosit video film gözlenir ve portal venlerde, sinüzoidler ve santral venlerde kan akış yönü ile tanınır.
Şekil 2 de gösterildiği gibi, bir x100 objektif lens ile merkezi bir venül irradyasyonu laser ışınının approxim idiçapı 10 um rilmesi gerekir. Hepatik mikrosirkülasyonda İntravasküler pO 2 erkek C57BL / 6 farelerde ölçülebilir ve Şekil 3 (a) pO 2 ve portal ve santral venlerde damar çapı arasındaki ilişkileri gösterir edildi. Sinüzoidler geçerken merkezi venüller portal gelen pO 2 degrade etkili olduğunu eritrositlerde serbest oksijen gösterir. Şekil 3 (b) 'de gösterildiği gibi, ortalama pO2 portal damarlar, sinüzoidlerdeki 48.2 mmHg ve santral venlerde 38.9 mmHg 59.8 mmHg idi.
Biz APAP intraperitoneal enjekte edilerek akut hepatit üretilen zaman, intravasküler pO 2 önemli ölçüde hepatik mikrodolaşım her kesiminde artmıştı: p sinüzoidler ve santral venlerin (Şekil 3 (c)), portal ven ve p <0.01 <0.05.
Şekil 1. Düşük büyütme images (a) geçen ışık ve (b) flüoresan ile hepatik mikrodolaşım gösteren.
Şekil 2. PO 2 ölçüm için hedeflenen merkezi venül irradyasyonu lazer nokta görüntüsü.
Sağlıklı kontrol farelerin ve asetaminofen bağlı karaciğer hasarı ile farelerde karaciğer mikrosirkülasyonda Şekil 3. PO 2 degrade. (A) pO 2 karşılık portal venüller (FV) ve merkezi venüller (KV) için damar çapı gösterir, ve (b) sinüsoidlerinden (S) vasıtasıyla PV CV oksijen gradyanı gösterir. PV ve CV arasındaki pO 2 farkı hepatositler veya diğer parankimal hücrelerin oksijen tüketimi yansıtır. (C) APAP alımının yol açtığı hepatit durumunda, pO 2 önemli ölçüde PV, S ve CV ve pO 2 yükselebilir olduğunu gösterirdegrade hepatik oksijen tüketimi tatlıya belirten azalmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dokularına oksijen taşınmasına mikrodolaşımında önemli bir rolü olduğunu ve bir çok gazete mikrodamar anatomi ve reoloji 6 ile ilgili hastalıklar açıklar. Karaciğer kan akımı arteriyel ve venöz kan bir kombinasyonudur. Karaciğer kan akımının yaklaşık% 30 portal ven tarafından sağlanan hepatik arter ve diğer% 70, sağladığı iyi oksijenli kan ise, dalak ve gastrointestinal kanal 7 den az oksijenli kan venöz çıkış olduğunu. Bu tür yağlı karaciğer, şok, veya tümör değişiklik hepatik mikrosirkülasyonda kan akımı gibi karaciğer hastalıkları. Oksijenleneceği belirlemek için, bir mikrodolaşım içinde kan akışı ve her iki oksijen konsantrasyonu ölçmek için gereklidir. Hepatik mikrosirkülasyonda bu ölçümler yapmak için ticari araçların olmaması, onu bu alanda fizyolojik verilerini elde etmek için yaptı.
Hayvan hazırlık adımda önemli bir nokta fiksasyonu olanPlastik bir plaka üzerinde karaciğer. Karaciğer hareketi gevşek fiksasyon sonuç mikroskobik gözlem müdahale ve analiz zorlaştırıyor solunum ile senkronize. Sıkı fiksasyon, bununla birlikte, kan akışı durağanlık neden olur. Kan akış koşulları operatif işlem sırasında düşük güçlü bir mikroskop olsa dikkate alınmalıdır. Yüksek güçlü lazerler kolayca mikrodamarlar yaralama, radyasyonun frekansı minimize edilmelidir böylece. 1 Hz temporal ölçümü 8 için yeterlidir. Ancak, pO 2, tek bir ölçüm tekrarlama frekansı gerektiğinde, hızlı pO 2 değişiklik için 1 kHz artış anlamına gelir az 1 ms alır. Ayrıca, Pd-TCPP fotokimyasal reaksiyon tekli oksijen zarar veren kılcal oluşturur ve trombosit agregasyonunu 9 indükler. Floresans görüntüleme ve pO 2 ölçüm kombinasyonu hep birlikte kan akış dinamikleri ve oksijen konsantrasyonu ölçebilirsiniz. Cıva lambası ışınlamaheyecan verici FITC de böylece çok daha tekli oksijen üreten ve kan akışını staz yol, ancak, Pd-TCPP heyecanlandırıyor. Pd-TCPP tatbik edilmeden önce kan akışı ve oksijen basıncı her ikisi de aynı hayvanda ölçüldüğü zaman, FITC görüntüleme yapılmalıdır. Buna ek olarak, oksijen, sistemik seviyesi dokuda oksijen tüketimi göstergesidir. Bu deneyler sırasında solunum yönetimi gerçekleştirmek veya deney sonrası kan gazları analiz etmek için tercih edilir.
APAP gibi yüksek bir dozda perisentral bölgesi 10, hücre nekrozu sebep olduğu bilinmektedir, çünkü kısmen, akut hepatit indüklemek için APAP kullanılır. Parsiyel oksijen basıncı ölçümü pO 2 hepatik mikrosirkülasyonu boyunca yüksek olduğunu kontrol farelerde portalı venüller ve merkezi venüller 20.9-mmHg pO 2 farkı APAP ile tedavi edilen farelerde 16.9 mmHg azalma gösterdi. Hepatik mikrosirkülasyonda oksijen gradiyenti esas olarak oksijen suppl sonucudurhepatositlerde tüketilmektedir portalı venüllerden ied. APAP ve yüksek doz perisentral bölgede 11, 12 nekroz neden olur, ve Şekil 3c de gösterildiği gibi aşağı oksijen tüketimini azaltmak verebilecek. Karaciğer hepatit, doku nekrozu ve oksijen düzeyi arasındaki ilişki, özellikle, nekroz ölçüde ölçümü, ve bilirubin, ALT, AST, ve inflamatuar sitokinlerin serum düzeyleri altta yatan ayrıntılı mekanizmaları belirlemek için ölçülen gerekir. Karaciğer hastalıkları bir çok karaciğer dokusunda kan akımı dağılımı, oksijen taşınmasını ve oksijen tüketimi, diğer bir deyişle, hepatik mikrosirkülasyon ilişkilidir. Kronik alkol alımı durumlarda, alkol yaklaşık% 10-15 mikrozomal etanol-oksitleyici sistem tarafından metabolize ve alkole bağlı molekül P450IIE1 NAPQI 13, perisentral hepatosit nekrozu 14 neden olduğu toksik bir metabolit üretir.
Sonuç olarak, optik meayaptığımız ölçümler yöntemi mikrovasküler yapısı, çapı, kan akım hızı ve oksijen gerilimi analiz ederek fizyolojik ve patolojik mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar teknik destek ve yardım deneyler için Bayan Risa Otsuka teşekkür ederim. Bu araştırma kısmen Eğitim Bakanlığı, Bilim, Spor ve Kültür, tarafından desteklenmiştir Grant-Aid Genç Bilim Adamları (B), 2010, 22.700.476, ve KT Suzuken Memorial Foundation 2010 Ve bu çalışmanın Araştırma ve Geliştirme tarafından desteklenen için Yaşayan Madde, MEXT ve Nesil Süper Bilgisayar Projesi Geliştirme ve Kullanım bir parçası ve JST ERATO Suematsu Gaz Biyoloji Projesi tarafından kısmen ve Nesil Entegre Simülasyon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine | Frontier Scientific, Inc. | PdT790 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich Co. | F7250 | |
| Acetaminophen | Sigma-Aldrich Co. | A7085 | |
| Equipment | |||
| photomultiplier tube | hamamatsu photonics k.k | H10722-20 | |
References
- Ishikawa, M., Sekizuka, E., Shimizu, K., Yamaguchi, N., Kawase, T. Measurement of RBC velocities in the rat pial arteries with an image-intensified high-speed video camera system. Microvasc. Res. 56, 166-172 (1998).
- Tsukada, K., Sekizuka, E., Oshio, C., Tsujioka, K., Minamitani, H. Red blood cell velocity and oxygen tension measurement in cerebral microvessels by double-wavelength photoexcitation. J. Appl. Physiol. 96, 1561-1568 (2004).
- Stern, O., Volmer, M. Über die Abklingzeit der Fluoreszenz. Physik. Zeitschr. 20, 183-188 (1919).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: a novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Soga, T. Differential metabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione consumption. J. Biol. Chem. 281, 16768-16776 (2006).
- Goda, N. Distribution of heme oxygenase isoforms in rat liver. Topographic basis for carbon monoxide-mediated microvascular relaxation. J. Clin. Invest. 101, 604-612 (1998).
- Grote, J. Physiologie der Menschen. , 20th edn, Springer-Verlag. New York. 560 (1980).
- Suganuma, K. Erythrocytes with T-state-stabilized hemoglobin as a therapeutic tool for postischemic liver dysfunction. Antioxid Redox Signal. 8, 1847-1855 (2006).
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based upon quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Bernal, W., Auzinger, G., Dhawan, A., Wendon, J.
- Hinson, J. A., Roberts, D. W., James, L. P.
- Hinson, J. A., Reid, A. B., McCullough, S. S., James, L. P. Acetaminophen-induced hepatotoxicity: role of metabolic activation, reactive oxygen/nitrogen species, and mitochondrial permeability transition. Drug Metab. Rev. 36, 805-822 (2004).
- Lieber, C. S. Medical disorders of alcoholism. N. Engl. J. Med. 333, 1058-1065 (1995).
- Zimmerman, H. J., Maddrey, W. C. Acetaminophen (paracetamol) hepatotoxicity with regular intake of alcohol: analysis of instances of therapeutic misadventure. Hepatology. 22, 767-773 (1995).
