本文介绍了将携带lux标记的细菌给予小鼠，并随后使用IVIS生物发光成像进行活体分析的方法。
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本文内容
摘要
摘要
本视频介绍了在活体小鼠中利用全身生物发光成像（BLI）研究细菌迁移的方法，重点阐述了细菌在癌症基因与细胞治疗中的应用。细菌是一类极具吸引力的癌症治疗载体，因其在全身给药后具有天然地在肿瘤组织中优先增殖的特性。经基因工程改造以表达lux基因片段的细菌，可通过BLI技术实现对细菌及其所处肿瘤部位的同步检测。通过该方法，可方便地在二维或三维水平上动态观察细菌在肿瘤内的时间分布与数量变化。该技术适用于多种细菌种类及异种移植肿瘤模型。本文描述了在皮下荷瘤小鼠中分析生物发光细菌的实验方案，同时也介绍了利用BLI可视化胃肠道（GIT）中共生菌群的方法。这一强大且经济的实时成像策略，是癌症研究（特别是基因治疗及感染性疾病）中研究细菌在体（in vivo）行为的理想方法。本视频概述了在活体小鼠中研究携带lux标签的E. coli的操作流程，展示了利用IVIS系统进行BLI所获得的空间与时间分辨结果。
方案
1. 肿瘤诱导
- 常规肿瘤诱导时，将悬浮于200 μl无血清培养基中的最低成瘤剂量细胞，使用21号注射器针头皮下（s.c.）注射至无感染的6-8周龄雌性Balb/C或裸鼠MF1-nu/nu小鼠（n=6，Harlan，牛津郡，英国）的侧 flank 部位（1 × 106 4T1细胞）。接种所用细胞的活力经血细胞计数板结合台盼蓝染料排除法（Gibco）目视计数测定，高于95%。
- 肿瘤成瘤后，允许其生长发育，并每周监测两次。肿瘤体积按公式 V=(ab2) Π/6 计算，其中 a 为肿瘤的最长直径，b 为垂直于直径 a 的最长直径。
2. 细菌制备
- 本实验所用菌株为大肠杆菌 K-12 MG1655（E. coli K-12 MG1655），该菌株不表达蛋白质毒素，并携带编码luxABCDE的质粒，使其可通过生物发光成像（BLI）进行检测。含有整合型luxABCDE的E. coli MG1655在添加了300 μg/ml 红霉素（Em）的LB培养基（Sigma-Aldrich，爱尔兰）中，于37 °C有氧条件下培养。MG1655的生物发光衍生菌株是通过含有组成型启动子PHELPluxABCDE操纵子的质粒p16Slux构建而成1。
- 为准备对小鼠给药，将菌液在LB培养基（Sigma）中于37 °C、200 rpm振荡培养至对数中期（600 nm处的光密度值）。细菌经离心（6,000 × g，5分钟）收集，用PBS（Sigma）洗涤后，重悬于PBS中，静脉注射时调整浓度为1 × 107菌落形成单位（cfu）/ml，灌胃时为1 × 1010 cfu/ml。
3. 细菌给药
- 当肿瘤体积达到约 100 mm3 时，将小鼠随机分配至实验组。进行静脉注射时，将小鼠固定后，每只通过 28G 注射器针头向尾静脉直接注射 100 μl 含 106 个细胞的悬液。每次接种物的活菌数通过回溯性平板计数法确定。
- 对于胃肠道定植研究，通过灌胃法每天向每只小鼠口服 100 μl 含 109 个细菌细胞的悬液，连续给药三天。在开始口服灌胃前，通过在小鼠饮用水中添加 5 mg/ml 链霉素持续 7 天，以降低原有的共生菌水平1。
4. 生物发光成像
- 使用 IVIS100（Caliper）进行二维 体内 生物发光成像（BLI）。在细菌给药后的指定时间点，采用 Caliper 的 XGI-8 气体麻醉系统（3% 异氟烷）对小鼠进行麻醉，并在 IVIS 100 系统中以高灵敏度模式进行全身图像采集，持续 2–5 分钟。
- 对于三维成像，将麻醉后的小鼠置于光学成像系统内的小鼠成像转运舱中，进行背部成像（IVIS Spectrum，Caliper）。为获取用于三维光学重建的细菌荧光素酶信号，采用 500–580 nm 范围内的发射滤光片，每个滤光片的 bin 16 采集时间为 3–4 分钟，以最大化信噪比。在此图像采集过程中，同步获取结构光图像以生成高度图。该高度图被输入至扩散光成像断层扫描（DLIT）重建算法中，通过非负最小二乘优化方法生成三维光学图像2。
- 图像分析：使用 Living Image 软件（Caliper）识别并定量分析感兴趣区域。
5. 代表性结果
本研究中，将表达 luxABCDE 操纵子的非致病性共生细菌 E.coli K-12 MG1655 经静脉注射至皮下接种 4T1 异种移植瘤的小鼠体内。细菌的 lux 信号在静脉注射后仅在小鼠肿瘤部位被特异性检测到（图 2）。从小鼠样本中培养回收细菌的结果证实，活菌数量与检测到的光信号强度之间存在线性关系（图 3）。此外，利用三维生物发光成像（3D BLI）也可实现对口服给予的共生菌在胃肠道内分布的体内成像。
图 1. 实验方案时间线。在小鼠体内诱导皮下肿瘤，并在肿瘤发育至 100 mm3 时给予细菌治疗。在细菌给药后的不同时间点对活体小鼠进行生物发光成像（BLI）（箭头表示典型成像时间点）。
图2. 向荷瘤小鼠给予E. coli MG1655 luxABCDE。 在MF1 nu/nu小鼠中建立皮下4T1肿瘤，并在肿瘤形成后给予E. coli MG1655 luxABCDE。每只动物通过尾静脉侧支直接注射106个细胞。在实验期间于四个时间点对小鼠进行成像（黑色圆点表示Z轴及图像），随后从安乐死小鼠的肿瘤组织中回收存活细菌（菌落形成单位，cfu）并绘制柱状图。随时间推移，观察到肿瘤内细菌数量增加以及质粒基因特异性表达（每个时间点展示一只代表性小鼠）。 点击此处查看高清大图。
图3. 肿瘤内细菌数量与生物发光之间的关系 通过菌落计数法对肿瘤中可存活细菌进行定量 离体 不同时间点静脉注射后通过生物发光成像（BLI）检测肿瘤中细菌培养的菌落形成单位（cfu）对数值 体内 将生物发光单位作图。观察到细菌计数与细菌生物发光信号之间存在显著相关性 R2=0.97171.
图4. 小鼠胃肠道定植的3D IVIS图像 E. coli MG1655 通过口服灌胃使小鼠胃肠道定植 109 菌落形成单位（cfu）的 E. coli 连续三天。图中显示了定植小鼠三维断层成像的单个分离图像。三维图像展示了骨骼的数字小鼠图谱，以提供解剖学定位参考。 E. coli MG1655 的生物发光在较低水平时呈绿色，高水平时呈紫色。
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讨论
在基因治疗领域，利用生物载体将治疗性基因递送至患者的策略已展现出巨大前景 3-5与病毒类似，细菌的天然生物学特性使其能够高效地将DNA递送至细胞或组织，尤其在癌症背景下具有显著潜力。研究表明，当细菌经全身给药后，能够自然趋向于肿瘤组织，并在局部高水平复制，这种复制可发生于肿瘤细胞外部（非侵袭性菌种）或内部（致病菌）。最初认为，细菌在肿瘤部位的特异性复制归因于实体瘤的缺氧微环境（低氧水平）2 水平），肿瘤内缺氧/坏死区域的厌氧环境促进了专性厌氧菌和兼性厌氧菌的生长。近年来，研究还提出其他因素可能发挥作用，例如肿瘤中不规则且渗漏的血液供应以及局部免疫抑制。大多数临床前研究采用异种移植肿瘤模型来探究细菌载体在肿瘤中的定植情况。而自发性肿瘤的小鼠模型在血管结构方面（可能影响细菌在肿瘤中定植的变量）更接近临床实际情况，且已有研究表明细菌同样能够定植于此类模型。 6多种细菌菌株在肿瘤内特异性运输和扩增编码前药转化酶、毒素、血管生成抑制剂以及细胞因子等因子基因的能力，已在多项临床前和临床试验中得到证实 4,7尽管已证明细菌在肿瘤中的定植与细菌菌株和肿瘤类型无关 <...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者希望感谢欧洲委员会第七框架计划（PIOF-GA-2009-255466）和爱尔兰健康研究委员会（HRA_POR/2010/138）对本论文提供的资助支持。Lux标记的E. coli菌株由科马克·加汉博士（Dr. Cormac Gahan）惠赠，来源为科克大学学院。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4T1细胞系 | ATCC | CRL-2539 | 源自自发性BALB/c小鼠乳腺肿瘤的同源性乳腺癌模型 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco改良型Eagle培养基 |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | 磷酸盐缓冲液 |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 用于二维成像；IVIS Spectrum 用于三维成像。 | |
| LB 肉汤（Miller 型） | Sigma-Aldrich | L2542 | 用于培养的培养基 E. coli |
| 红霉素 | Sigma-Aldrich | E5389 | 抗生素 |
| 链霉素 | Sigma-Aldrich | S9137 | 抗生素 |
| MF1nu/nu 小鼠 | Harlan (英国) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c 小鼠 | Harlan（英国） | 066 | 单倍型：H-2d |
| 灌胃针 | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G × 38 mm 直式灌胃针 |
| 用于静脉注射的注射器 | BD BioSciences | 309309 - 1 毫升 | 胰岛素注射器，28 G × ½ 英寸超细静脉注射针 |
| 用于肿瘤接种的注射器 | 布劳恩 | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ 英寸针头 |
参考文献
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