活体生物发光细菌成像 In Vivo

摘要

本文介绍了将携带lux标记的细菌给予小鼠，并随后使用IVIS生物发光成像进行活体分析的方法。

摘要

本视频介绍了在活体小鼠中利用全身生物发光成像（BLI）研究细菌迁移的方法，重点阐述了细菌在癌症基因与细胞治疗中的应用。细菌是一类极具吸引力的癌症治疗载体，因其在全身给药后具有天然地在肿瘤组织中优先增殖的特性。经基因工程改造以表达lux基因片段的细菌，可通过BLI技术实现对细菌及其所处肿瘤部位的同步检测。通过该方法，可方便地在二维或三维水平上动态观察细菌在肿瘤内的时间分布与数量变化。该技术适用于多种细菌种类及异种移植肿瘤模型。本文描述了在皮下荷瘤小鼠中分析生物发光细菌的实验方案，同时也介绍了利用BLI可视化胃肠道（GIT）中共生菌群的方法。这一强大且经济的实时成像策略，是癌症研究（特别是基因治疗及感染性疾病）中研究细菌在体（in vivo）行为的理想方法。本视频概述了在活体小鼠中研究携带lux标签的E. coli的操作流程，展示了利用IVIS系统进行BLI所获得的空间与时间分辨结果。

方案

1. 肿瘤诱导

1. 常规肿瘤诱导时，将悬浮于200 μl无血清培养基中的最低成瘤剂量细胞，使用21号注射器针头皮下（s.c.）注射至无感染的6-8周龄雌性Balb/C或裸鼠MF1-nu/nu小鼠（n=6，Harlan，牛津郡，英国）的侧 flank 部位（1 × 10⁶ 4T1细胞）。接种所用细胞的活力经血细胞计数板结合台盼蓝染料排除法（Gibco）目视计数测定，高于95%。
2. 肿瘤成瘤后，允许其生长发育，并每周监测两次。肿瘤体积按公式 V=(ab²) Π/6 计算，其中 a 为肿瘤的最长直径，b 为垂直于直径 a 的最长直径。

2. 细菌制备

1. 本实验所用菌株为大肠杆菌 K-12 MG1655（E. coli K-12 MG1655），该菌株不表达蛋白质毒素，并携带编码luxABCDE的质粒，使其可通过生物发光成像（BLI）进行检测。含有整合型luxABCDE的E. coli MG1655在添加了300 μg/ml 红霉素（Em）的LB培养基（Sigma-Aldrich，爱尔兰）中，于37 °C有氧条件下培养。MG1655的生物发光衍生菌株是通过含有组成型启动子P_HELPluxAB....

讨论

在基因治疗领域，利用生物载体将治疗性基因递送至患者的策略已展现出巨大前景 ^3-5与病毒类似，细菌的天然生物学特性使其能够高效地将DNA递送至细胞或组织，尤其在癌症背景下具有显著潜力。研究表明，当细菌经全身给药后，能够自然趋向于肿瘤组织，并在局部高水平复制，这种复制可发生于肿瘤细胞外部（非侵袭性菌种）或内部（致病菌）。最初认为，细菌在肿瘤部位的特异性复制归因于实体瘤的缺氧微环境（低氧水平）₂ 水平），肿瘤内缺氧/坏死区域的厌氧环境促进了专性厌氧菌和兼性厌氧菌的生长。近年来，研究还提出其他因素可能发挥作用，例如肿瘤中不规则且渗漏的血液供应以及局部免疫抑制。大多数临床前研究采用异种移植肿瘤模型来探究细菌载体在肿瘤中的定植情况。而自发性肿瘤的小鼠模型在血管结构方面（可能影响细菌在肿瘤中定植的变量）更接近临床实际情况，且已有研究表明细菌同样能够定植于此类模型。 ⁶多种细菌菌株在肿瘤内特异性运输和扩增编码前药转化酶、毒素、血管生成抑制剂以及细胞因子等因子基因的能力，已在多项临床前和临床试验中得到证实 ^4,7尽管已证明细菌在肿瘤中的定植与细菌菌株和肿瘤类型无关 <.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4T1细胞系	ATCC	CRL-2539	源自自发性BALB/c小鼠乳腺肿瘤的同源性乳腺癌模型
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco改良型Eagle培养基
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	磷酸盐缓冲液
Xenogen IVIS	Caliper Life Sciences		IVIS 100 用于二维成像；IVIS Spectrum 用于三维成像。
LB 肉汤（Miller 型）	Sigma-Aldrich	L2542	用于培养的培养基 E. coli
红霉素	Sigma-Aldrich	E5389	抗生素
链霉素	Sigma-Aldrich	S9137	抗生素
MF1nu/nu 小鼠	Harlan (英国)	069(nu)/070(nu/+)	Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu
Balb/c 小鼠	Harlan（英国）	066	单倍型：H-2d
灌胃针	Vet-tech Solutions (UK)	DE009	22G × 38 mm 直式灌胃针
用于静脉注射的注射器	BD BioSciences	309309 - 1 毫升	胰岛素注射器，28 G × ½ 英寸超细静脉注射针
用于肿瘤接种的注射器	布劳恩	9161376V	Omnifix 26 G x ½ 英寸针头