Summary
تحديد إفراغ المعدة مع الغازية غير [
Abstract
واقتصرت الدراسات المعدة في الفئران عن طريق إفراغ عدم القدرة على تتبع التغيرات إفراغ المعدة في نفس الحيوان منذ أكثر التقنيات استخداما تتطلب قتل الحيوانات والانتعاش بعد الوفاة من 1،2 جبة. يمنع هذا النهج الدراسات الطولية لتحديد التغيرات في إفراغ المعدة مع التقدم في السن وتطور المرض. ويشيع استخدام [13 C]-الأوكتانويك تم تعديل حمض اختبار التنفس للبشر 3 للاستخدام في الفئران الفئران 4-6 و 7 و أظهرنا سابقا أن هذا الاختبار هو موثوق بها وتستجيب للتغيرات في إفراغ المعدة في الاستجابة للأدوية وخلال تطور المرض السكري 8. في هذا الفيديو عرض وشرح المبدأ والتطبيق العملي لهذا الاختبار تم تعديلها. كما هو الحال في الدراسة السابقة، يتم استخدام NOD الفئران LtJ، وهذا نموذج من مرض السكري نوع 1 9. وهناك نسبة من هذه الفئران أعراض تطوير خزل المعدة، ومضاعفات diabetتتميز ES من تأخر إفراغ المعدة دون عرقلة الميكانيكية المعدة 10.
هذه الورقة يوضح كيفية تدريب الفئران لاختبار، وكيفية إعداد وجبة الاختبار والحصول على البيانات المعدة 4 ساعات تفريغ وكيفية تحليل البيانات التي تم الحصول عليها. محلل نظائر الكربون المستخدمة في هذه الدراسة مناسبة لأخذ العينات التلقائي للعينات الهواء من الفئران تصل إلى 12 في نفس الوقت. هذه التقنية تسمح للالطولية متابعة إفراغ المعدة من أكبر مجموعات من الفئران المصابين بداء السكري أو غيره من الأمراض طويلة الأمد.
Introduction
يصف هذا المخطوط الاعتبارات التقنية والمنهجية المشاركة في غير الغازية قياس إفراغ المعدة في الفئران. باتباع بروتوكول الموصوفة هنا، يمكن المحققين موثوق وبتكاثر متابعة التغيرات في المعدة إفراغ بسبب تطور المرض، ودراسة تأثير العوامل الدوائية على إفراغ المعدة واتبع رد إفراغ المعدة لعلاج الأمراض أو العيوب الكامنة 6،8، 11،12. في المنشورات السابقة، وتطبيق 13 C وأظهرت الاختبارات التنفس حمض octanoic ليكون وسيلة مفيدة لقياس إفراغ المعدة في الإنسان والحيوان 3،8. وتصف هذه الورقة بالتفصيل، الإجراءات اللازمة للحصول على بيانات موثوق بها على مدى 8 6 إلى اللازمة لإجراء دراسة طولية من إفراغ المعدة في الفئران المصابين بداء السكري أشهر. مزايا هذا البروتوكول بعد بالمقارنة مع الأساليب التي تم نشرها مسبقا هي التي يمكن أكدت للمحقق obtaine البياناتسوف تكون موثوقة ود استنساخه. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النظام الآلي لجمع وتحليل عينات الغاز الموصوفة هنا يزيد من عدد الحيوانات التي يمكن اتباعها في وقت واحد في الدراسة. وعموما، فإن الهدف من هذه الورقة هو تحديد العوامل الرئيسية التي تحافظ على التعود من الفئران لاختبار والتي تقلل من التباين في النتائج التي تم الحصول عليها.
لفي قياس الجسم الحي من إفراغ المعدة، وصام بين عشية وضحاها الفئران ووضعها في غرف اختبار تدفق الهواء مع بلاستيكية شفافة ثابتة. بعد الحصول على اعتادوا على الفئران إلى أنابيب، خط الأساس الزفير 13 CO يتم تحديد 2 مستويات تدفق الهواء وتعديلها وفقا لذلك. المقبل، ونحن إدارة وجبة تتكون من اختبار صفار البيض مختلطة مع 13 حمض octanoic C-المسمى. لأن الفئران صام وتدريبهم، وأنهم يأكلون وجبة الاختبار عموما داخل 2 دقيقة. لا يمتص في إدارة حمض octanoic في المعدة ولكن سيتم تناولها في الاثني عشر علىسوف تحصل على استقلاب في الكبد د إلى 13 CO 2، الذي صدر والزفير، مما أسفر عن تخصيب من 13 CO 2 في الهواء المحيط. يتم جمع عينات من الهواء في فترات زمنية محددة ويتم تحليلها من قبل محلل الكربون النظير. معدل منظم للخطوة في هذه العملية كلها هو إفراغ المعدة وإفراز الرئوي من 13 CO 2 يتوافق مباشرة مع إفراغ المعدة من وجبة المسمى.
الشكل 1. التخطيطي لجهاز إفراغ المعدة. بعد الصيام بين عشية وضحاها، وضعت الفئران في غرف شفافة تسمح لهم بالانتقال وتحويل بحرية. مدخل أنبوب يسمح الطازجة ومستمر تدفق الهواء ومنفذا يؤدي إلى محلل لقياس النظائر 13 C-إلى-12الزفير C نسبة في التنفس. الدائرة لديها أيضا ميناء مركزي لتسليم الأغذية التي تحتوي على [13 C]-الأوكتانويك الحمض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التدريب والتعويد من الفئران
- قبل التحليل، ووضع كل الفئران في غرف اختبار لمدة 2-4 ساعة مع تدفق الهواء المستمر من أجل روض لهم الظروف الاختبار. هذا يقلل بشكل ملحوظ من مستويات التوتر التي قد تسبب خلاف ذلك الكشف الشاذة من تأخر إفراغ المعدة. علاج الفئران بنفس الطريقة كما لو أن التجربة تم تشغيل إفراغ المعدة. إعداد صفار البيض (انظر كذلك) دون إضافة حمض الأوكتانويك وإطعام 0.2 جم لكل الماوس.
- كرر هذه العملية حتى يتم تدريب الفئران على نحو كاف (عادة 2-3 مرات). الفئران عادة ما اعتادوا بسهولة طالما يتم الاحتفاظ الظروف البيئية نفسها.
ملاحظة: غير متعود الفئران مواصلة التحرك في جميع أنحاء لحوالي 1 ساعة بعد نقل إلى غرفة، والتبرز والتبول بشكل متكرر، في حين اعتادوا تسوية الفئران بسرعة في بيئتهم الجديدة وبقية بهدوء.
لاالشركة المصرية للاتصالات: خلال التجربة: الحيوانات مراقبة لدلائل على فقدان التعود مثل كثرة التبول، التبرز، وعدم الاهتمام في تناول البيض. إذا كانت هذه هي الحالة إعادة النظر في التعود في غرفة فارغة 1-2 مرات قبل الحصول على البيانات المعدة إفراغ. الاتساق هو في غاية الأهمية أثناء القيام بهذه التجربة. فعل الأشياء بنفس الطريقة تماما في كل مرة هو السبيل الوحيد للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. وهذا يشمل إعطاء العلاج (مثل الأنسولين) كل يوم في نفس الوقت، لا يفصل بين الفئران من الاصحاب قفص الا للضرورة القصوى، صيام الفئران والبدء في اختبار إفراغ المعدة في نفس الوقت، والتعامل مع الفئران بنفس الطريقة.
2. إعداد وجبة تحتوي على النظير اختبار
- تبدأ وزنها إلى 5 غ من صفار البيض في أنبوب 50 مل الصقر. كرر هذه الخطوات كل يوم التجريبية لإعداد وجبة اختبار جديدة.
- إضافة 10 ميكرولتر من حمض octanoic مع concentrأوجه من 2 ميكرولتر / ز إلى أنبوب 50 مل الصقر تحتوي على البيض ويخلط بقوة لمدة 1 دقيقة مع ملعقة في أنبوب الصقر.
- ثم يتم نقل البويضة إلى كأس زجاجي وتسخن أكثر من ناسخ بنسن حتى يتخثر واتساقه هو مناسبة لجعل كرات صغيرة. هذا عادة ما يستغرق حوالي 30 ثانية.
ملاحظة: كرات من صفار البيض يجب أن تزن 0.2 غرام في الماوس. هذا مهم للحفاظ على جرعة تراكمية مستمرة في جميع الفئران.
3. بدء التجربة
- مرة واحدة مدربة وجاهزة للإفراغ المعدة، سرعة الفئران بين عشية وضحاها (12 ساعة) على رف معدني "شبكة القاع" الصيام لمنع أكل البراز. تأكد لديهم حرية الوصول إلى المياه الصالحة للشرب. منذ تستخدم الفئران من السكري في التجربة الحالية، لا ينبغي أن صام لأكثر من 16 ساعة.
- تبدأ من خلال إنشاء دوائر المعدة إفراغ. استخدام غرف نظيفة وأغطية التي كانت المجفف في الهواء. أيضا، أييجب أنابيب يربط بين الدوائر إلى محلل أو توريد الهواء 2 CO تكون خالية الرطوبة والمياه يمكن أن تتداخل مع إشارة قراءة من قبل محلل
- توصيل الدوائر إلى مدخل أنابيب التي توفر تدفق الهواء المستمر. ثم قم بتوصيل منفذ أنابيب من غرف إلى الجهاز. إغلاق أنابيب وتشغيل تدفق الهواء.
ملاحظة: ضع كمية صغيرة جدا من الفازلين في نهاية الجفن غطاء حتى إغلاق بسهولة ومغلقة بإحكام. هذا الختم هو ضيق اللازمة لجمع كل ثاني أكسيد الكربون التي تنتجها الفئران.
4. إجراءات تجريبية
- تبدأ بها كل وزنها الماوس. وزن الجسم هو مقياس لصحتهم جيدة مستمرة. ثم ضع الماوس في كل غرفة المناسبة. ومن المهم بطبيعة الحال أن الهواء المتدفقة إلى غرف في هذا الوقت.
- لبدء القياس، والسماح للفئران حتى يتأقلم إلى غرف قبل ضبطجي مستويات الهواء.
- وبمجرد أن الفئران تظهر الهدوء، والتي قد يستغرق بضع دقائق، وضبط معدل تدفق الهواء لكل غرفة الماوس. وهذا قد يكون مختلفا عن كل الماوس. عادة، يتم ضبط تدفق الهواء في بداية التجربة للتأكد من أن الزفير CO 2 إلى مستويات يمكن كشفها بأي المعدات المستخدمة، والتأكد من أن مستوى يبقى منخفضة بما فيه الكفاية لضمان دوران الهواء صحية. نستخدم الأولية مستويات CO 2 بين 1،000 و 1،500 جزء في المليون.
- إذا كان وجود صعوبة مع تعديلات، والتحقق من وجود تسرب الهواء. ثم كرر العملية لكل دائرة من الدوائر ومشاهدة لجولة أخرى من قياسات لمعرفة ما إذا التعديلات التي أدخلت على تدفق الهواء وتصحيح مستوى CO 2. من المهم للحصول على خط الأساس ثابت القراءة قبل إطعام الفئران. نستخدم جهاز مع ميزة معايرة الذاتي. يجب إذا لم يكن ذلك يتم فحص المعايرة القضية.
- عندما يتحقق هذا، وجبة البيض إدارةلأول مرة الماوس وسجل كل الماوس يتلقى الطعام.
- نحن تشغيل الإجراء لمدة 4 ساعة للحصول على ما يكفي من القيم لتركب ال 13 منحنى CO 2 لكل تخصيب الماوس. اطمئنان على الفئران كل دقيقة 30-60 للتأكد من أن مستويات CO 2 لا تزال آمنة للالفئران.
- إعداد صناديق جديدة تحتوي على المواد الغذائية قبل نهاية الاختبار لذلك يمكن البدء في تناول الفئران مباشرة بعد الاختبار قد انتهت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد ممثل تعيين البيانات من ثلاثة الفئران مختلفة في الشكل 2. الرسم البياني الأسود يمثل نقطة البيانات من الماوس العادي مع إفراغ المعدة. ويعرض جزء من 13 C التي يتم استردادها في الهواء الزفير معبرا عنها كنسبة مئوية من الجرعة المعطاة للساعة الواحدة أعرب بوصفها وظيفة من الزمن. منحنى الأزرق هو من الماوس مع تسارع إفراغ المعدة بقيمة 1/2 T من 40 دقيقة ومنحنى الأحمر هو من الماوس مع تأخر إفراغ المعدة بقيمة 1/2 T من 168 دقيقة. على النحو المنصوص عليه في دراسة سابقة في المختبر 7، النصف المعدة العادية تفريغ الوقت لعصر NOD الماوس غير المصابين بالبول السكري 9-15 أسابيع يتراوح 62 حتي 131 دقيقة ممثلا في مربع رمادي. ثم يتم تجهيز نقاط البيانات من منحنى الانحدار غير الخطية مع المعادلة التالية (8):
ذ = ب ه في CT-
حيث y هو النسبة المئوية لل
ويحسب من إجراء التكامل العددي باستخدام وظيفة جاما عكسية. لقد حصلنا على نتائج دراسات عدة آلاف من مع تقلب داخل الماوس البيولوجية من حوالي 10٪.
الشكل 2. ممثل المعدة إفراغ البيانات من ثلاثة الفئران العادية مع مختلف (المنحنى الأسود)، وتأخر (منحنى الحمراء) و (منحنى الأزرق) تسارع إفراغ المعدة. مربع رمادي يبرز القيم العادية. يظهر معادلة الانحدار منحنيات غير الخطية في المربع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه التقنية تسمح صفها هنا للالمتكررة وغير الغازية في قياس الجسم الحي من إفراغ المعدة الصلبة في الفئران. هذا النظام له ميزة أنه لا تقييد الحيوانات في غرفة القياس، والسماح لهم للتحرك وتحويل بحرية. حيث أن هذه هي بيئة غير مألوفة، والفئران لا تزال بحاجة إلى تدريب وتعود على اختبار الدوائر لمنع آثار الإجهاد على إفراغ المعدة. بشكل عام، ونحن نفترض البيانات إفراغ المعدة يمكن الاعتماد عليها إذا كان التباين داخل الماوس بين الاختبارات المعدة على التوالي إفراغ أقل من 10٪.
هذا التقرير هو وصف أكثر تفصيلا لتقاريرنا السابقة على قياسات إفراغ المعدة في الفئران 8،11،12، وتتضمن معلومات إضافية عن حل المشاكل مشاكل مع النظام. التعديل الرئيسي هو استخدام النظائر المحلل LGR لقياس مستويات الغاز. محلل كنا في هذه الدراسة تدابير 12 CO
الأخطاء الرئيسة لهذه التقنية تحدث عندما تفشل في الفئران تأكل وجبة ضمن الوقت المخصص له، عندما تفقد الفئران التعود على الغرفة وعندما تنشأ مشاكل تقنية مع الكشف SYSتيم. عدم تناول وجبة وفقدان التعود وعادة ما تكون نتيجة لعدم اتباع خطوة حاسمة من وجود جدول منتظم للاختبار. بعد 3 اختبارات متتالية مفصولة 7 أيام أو أقل، تصبح لدينا اعتادوا الفئران لاختبار وأكل وجبة. اعتادوا مرة واحدة، ويتم الحصول على بيانات موثوقة إذا يتم اختبار الفئران على الأقل مرة كل أسبوعين 2 للفترة المتبقية من التجربة. إذا كان لسبب لم يتم اختبارها على الفئران لمدة 3 أسابيع أو أكثر ثم سوف دورتين تدريبيتين خلال أسبوع عادة التعود ضمان. إذا كان أفراد التعامل مع الحيوانات ثم تغيير ينصح إعادة تدريب الفئران وأنه من المهم بشكل خاص للحد من استخدام الصابون المعطر بقوة و / أو العطور من قبل الشعب التعامل مع الفئران. صعوبات مع نظام الكشف وغالبا ما تكون نتيجة لمستويات منخفضة من 13 CO 2 التي تم إنشاؤها بواسطة حيوان صغيرة مثل فأرة الحاسوب. يجب معايرة الكاشف وبالنسبة لبعض أجهزة الكشف عن مثل الأشعة تحت الحمراء النظم القائمة، من عفريت جداortant للحد من محتوى الماء من العينة إلى أدنى حد ممكن قبل القياسات.
هناك قيود قليلة على هذه التقنية إلا إذا كان يرغب في دراسة الباحث إفراغ المعدة بشكل متكرر أكثر من مرة واحدة كل 3 أيام في الماوس نفسه. لا ينصح الماوس سريع في كثير من الأحيان وتقييد الغذائية مثل على أساس منتظم يمكن أن يغير وظيفة المعدة. ويمكن إجراء تعديلات على أسلوب لقياس إفراغ المعدة والسائل الذي هو تطبيق مفيد المحتملة لهذه الطريقة.
الاحتفاظ أساليب أخرى لقياس إفراغ المعدة، بما في ذلك المحتوى أو قياس مضان بعد وقت محدد على قيود أكثر بكثير بما في ذلك القضايا مع الإجهاد من العملية أو بسبب الحاجة لقتل الحيوانات في نهاية كل اختبار. وتشمل الضغوطات بالتزقيم من وجبة أو اختبار ضبط النفس من الحيوان أثناء القياس. مزايا اختبار التنفس هي أن الماوس تتحرك بحرية وتخدير لاأو مخدرا بأي شكل من الأشكال.
وخلاصة القول، حمض ال 13 نفسا C-الأوكتانويك الاختبار يسمح ثم يمكن دراسة تطور المرض مع تقدم العمر والعلاج والبيانات تكون مرتبطة مع هذه التغيرات في القياسات الفسيولوجية الأخرى والتقييم النسيجي في نفس الحيوان. بين التطبيقات الأخرى، كما يسمح الاختبار دراسة كيفية المخدرات يمكن أن يغير مباشرة إفراغ المعدة وكذلك التحقيق في الاستجابة للعلاج في الحيوانات التي تضع التغيرات في إفراغ المعدة بسبب مرض أو تدخلات أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.
Acknowledgments
وجاء هذا المنشور الفيديو ممكن عن طريق تمويل من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (جوائز كبيرة) ل"البيولوجيا المرضية للنظام المعوية" مشروع برنامج منح DK 68055. وأيد كريستوفر T. Creedon من برنامج روشستر العامة توجيهي المدارس.
نشكر السيد غاري ستولتز للمساعدة التقنية، والسيدة كريستي Zodrow للمساعدة السكرتارية والدكتور دوغلاس من باير لوس قطط البحوث، وشركة (ماونتن فيو، كاليفورنيا).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A source of constant air-supply, flow as well as composition | central air supply in the research facility | ||
| 130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply |
In-house built | ||
| Octanoic acid | Cambridge isotope laboratories (Andover, MA) | CLM-293-1 | |
To prepare the egg meal:
|
Any supplier | Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal | |
| Carbon dioxide isotope analyzer | Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA) |
References
- Yeung, C. K., McCurrie, J. R. A simple method to investigate the inhibitory effects of drugs on gastric emptying in the mouse in vivo. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 45, 235-240 (2001).
- Osinski, M. A., Seifert, T. R., Cox, B. F., Gintant, G. A. An improved method of evaluation of drug-evoked changes in gastric emptying in mice. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 47, 115-120 (2002).
- Ghoos, Y. F., et al. Measurement of gastric emptying rate of solids by means of a carbon-labeled octanoic acid breath test. Gastroenterology. 104, 1640-1647 (1993).
- Symonds, E., Butler, R., Omari, T. Noninvasive breath tests can detect alterations in gastric emptying in the mouse. Eur. J. Clin. Invest. 32, 341-344 (2002).
- Symonds, E. L., Butler, R. N., Omari, T. I. Assessment of gastric emptying in the mouse using the [13C]-octanoic acid breath test. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 27, 671-675 (2000).
- Verhulst, P. J. Role of ghrelin in the relationship between hyperphagia and accelerated gastric emptying in diabetic mice. Gastroenterology. 135, 1267-1276 (2008).
- Schoonjans, R., et al. The 13C-octanoic acid breath test: validation of a new noninvasive method of measuring gastric emptying in rats. Neurogastroenterol. Motil. 14, 287-293 (2002).
- Choi, K. M., et al. Determination of gastric emptying in nonobese diabetic mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 1039-1045 (2007).
- Atkinson, M. A., Leiter, E. H. The NOD mouse model of type 1 diabetes: as good as it gets? Nat. Med. 5, 601-604 (1999).
- Camilleri, M.
- Choi, K. M., et al. Heme oxygenase-1 protects interstitial cells of Cajal from oxidative stress and reverses diabetic gastroparesis. Gastroenterology. 135, 2055-2064 (2008).
- Kashyap, P. C., et al. Carbon monoxide reverses diabetic gastroparesis in NOD mice. Am. J. Physiol. GI. G298, G1013-G1019 (2010).
![تقييم إفراغ المعدة في الفئران من السكري غير البدناء باستخدام [<sup> 13</sup> C]-الأوكتانويك اختبار التنفس حمض](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/50301.jpg)
