Summary
Détermination de la vidange gastrique avec un non-invasive [
Abstract
Gastriques études vidange chez la souris ont été limités par l'incapacité à suivre les changements de vidange gastrique chez le même animal, depuis les techniques les plus couramment utilisées nécessitent l'abattage des animaux et la récupération post-mortem de l'1,2 repas. Cette approche empêche études longitudinales afin de déterminer les modifications de la vidange gastrique avec l'âge et la progression de la maladie. L'couramment utilisés [13 C]-octanoïque test respiratoire à l'acide pour l'homme 3 a été modifié pour une utilisation chez les souris et les rats 06.04 7 et nous avons précédemment montré que ce test est fiable et sensible aux variations de la vidange gastrique en réponse à la drogue et au cours de progression de la maladie diabétique 8. Dans cette vidéo de présentation du principe et de la mise en œuvre pratique de ce test modifié est expliqué. Comme dans l'étude précédente, les souris NOD LTJ sont utilisés, un modèle de diabète de type 1 9. Une partie de ces souris développent les symptômes de la gastroparésie, une complication de diabetes caractérisé par la vidange gastrique retardée, sans obstruction mécanique de l'estomac 10.
Cet article montre comment former les souris pour le test, la façon de préparer le repas test et obtenir 4 h gastriques données vidange et comment analyser les données obtenues. L'analyseur d'isotopes du carbone utilisé dans la présente étude est approprié pour le prélèvement automatique des échantillons d'air à partir de 12 souris en même temps. Cette technique permet au suivi longitudinal de la vidange gastrique des grands groupes de souris atteintes de diabète ou d'autres maladies de longue date.
Introduction
Ce manuscrit décrit les considérations techniques et méthodologiques liées à la mesure non invasive de la vidange gastrique chez la souris. En suivant le protocole décrit ici, les enquêteurs de façon fiable et reproductible suivre l'évolution de la vidange gastrique due au développement de la maladie, d'étudier l'impact des agents pharmacologiques sur la vidange gastrique et le suivi de la réponse de la vidange gastrique pour le traitement de maladies sous-jacentes ou les défauts 6,8, 11,12. Dans les publications antérieures, l'application de 13 C tests d'haleine acide octanoïque a été montré pour être un moyen utile de mesurer la vidange gastrique chez les humains et les animaux 3,8. Ce document décrit en détail les procédures nécessaires pour obtenir des données fiables sur la 8 6 à mois nécessaires pour une étude longitudinale de la vidange gastrique chez des souris atteintes de diabète. Les avantages de suivre ce protocole par rapport aux méthodes déjà publiées sont que l'enquêteur ne peut être assuré le obtaine donnéesd sera fiable et reproductible. En outre, le système automatisé de collecte et d'analyse des échantillons de gaz décrit ici augmente le nombre d'animaux qui peuvent être suivis simultanément dans une étude. Dans l'ensemble, l'objectif de cet article est d'identifier les facteurs clés qui maintiennent l'habituation des souris à l'épreuve et que réduire la variabilité des résultats obtenus.
Pour la mesure in vivo de la vidange gastrique, les souris sont mises à jeun pendant la nuit et placés dans les chambres d'essai en plastique transparent avec débit d'air constant. Après les souris se habitué aux tubes, base 13 CO exhalé 2 niveaux sont déterminés et le débit ajusté en conséquence. Ensuite, on administre un repas d'épreuve composé de jaune d'oeuf mélangé à 13 C marqué par l'acide octanoïque. Parce que les souris sont mises à jeun et formés, ils mangent généralement le repas test à moins de 2 min. L'administration d'acide octanoïque n'est pas absorbé dans l'estomac, mais sera repris dans le duodénum und obtiendrez métabolisé dans le foie en 13 CO 2, qui est libéré et expiré, résultant en un enrichissement de 13 CO 2 dans l'air ambiant. Des échantillons d'air sont prélevés à des intervalles de temps déterminés et analysés par l'analyseur isotopique du carbone. L'étape limitante dans tout ce processus est la vidange gastrique et l'excrétion pulmonaire de 13 CO 2 correspond directement avec la vidange gastrique du repas étiquetés.
Figure 1. Schéma du dispositif de vidage gastrique. Après une nuit de jeûne, les souris sont placées dans des chambres transparentes leur permettant de se déplacer et de tourner librement. Un tube d'entrée d'air permet afflux fraîche et constante et une sortie mène à l'analyseur isotopique pour mesurer la 13 C-à-12Rapport C dans l'air expiré. La chambre dispose également d'un orifice central pour la livraison de denrées alimentaires contenant [13 C]-octanoïque.
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Protocol
1. La formation et l'habituation des souris
- Avant l'analyse, mettre toutes les souris dans les enceintes d'essai pour 2-4 heures avec débit d'air constant afin de les habituer aux conditions d'essai. Cela réduit considérablement le niveau de stress qui pourraient causer de détection aberrante de la vidange gastrique. Traiter les souris de la même manière que si l'expérience de la vidange gastrique était en marche. Préparer le jaune d'œuf (voir plus loin) sans ajouter de l'acide octanoïque et nourrir 0,2 g à chaque souris.
- Répétez ce processus jusqu'à ce que les souris sont suffisamment formés (en général 2-3 fois). Les souris sont généralement s'habituent facilement aussi longtemps que les conditions environnementales sont restés les mêmes.
Remarque: non habitués souris continuent à se déplacer pendant environ 1 heure après le transfert à la chambre, et de déféquer et d'uriner fréquemment, tandis que les souris habitués rapidement s'installer dans leur nouvel environnement et se reposer tranquillement.
Aucunte: Pendant l'expérience: animaux Surveiller les signes de perte d'accoutumance comme une miction excessive, la défécation, le manque d'intérêt à manger l'œuf. Si c'est le cas, pensez à réutiliser habituer dans une chambre vide 1-2 fois avant d'obtenir des données gastriques vidange. La cohérence est très importante lors de cette expérience. Faire les choses exactement de la même façon à chaque fois que c'est la seule façon d'obtenir des résultats fiables et reproductibles. Cela inclut accorder un traitement (par exemple l'insuline) tous les jours dans le même temps, ne pas séparer les souris de leurs compagnons de cage sauf si c'est absolument nécessaire, le jeûne, les souris et de lancer le test de la vidange gastrique, en même temps, et la manipulation des souris de la même manière.
2. Préparation du repas test contenant des isotopes
- Commencez par peser 5 g de jaune d'oeuf dans un tube Falcon de 50 ml. Répétez ces étapes chaque jour expérimental pour préparer un repas d'épreuve frais.
- Ajouter 10 ul d'acide octanoïque avec un concentrtion de 2 pl / g dans le tube Falcon de 50 ml contenant de l'œuf et mélanger vigoureusement pendant 1 min avec une spatule dans le tube falcon.
- L'œuf est ensuite transféré dans un bécher en verre et chauffé au-dessus d'un bec Bunsen jusqu'à ce qu'il se coagule et sa consistance est apte à faire des petites boules. Cela prend habituellement environ 30 secondes.
Remarque: Les boules de jaune d'œuf doit peser 0,2 g par souris. Il est important de garder la dose cumulée constante chez toutes les souris.
3. Démarrage de l'expérience
- Une fois formés et prêts pour la vidange gastrique, rapide chez les souris pendant la nuit (12 h) sur un métal "mesh-bas" rack jeûne pour empêcher la coprophagie. Assurez-vous qu'ils aient libre accès à l'eau potable. Depuis souris diabétiques sont utilisés dans l'expérience actuelle, ils ne devraient pas être à jeun depuis plus de 16 heures.
- Commencez par la mise en place des chambres de vidange gastrique. Utilisez chambres propres et des couvertures qui ont été séchés à l'air. En outre, toutetubes reliant les chambres à l'analyseur ou le CO 2 de l'air d'alimentation doit être exempt d'humidité, l'eau peut interférer avec le signal lu par l'analyseur
- Relier les chambres de tubes d'entrée qui fournissent un flux d'air constant. Puis connecter les tubes de sortie des chambres de la machine. Fermer les tubes et allumez le flux d'air.
Remarque: Appliquer une très petite quantité de vaseline à la fin des couvercles de couverture afin qu'ils ferment facilement et sont bien scellés. Cette étanchéité est nécessaire de collecter tout le dioxyde de carbone produit par les souris.
4. Procédures expérimentales
- Commencez par peser chaque souris. Le poids corporel est une mesure de leur bonne santé continue. Ensuite, placez chaque souris dans la chambre appropriée. Il est bien sûr important d'avoir l'air circulant dans les chambres à l'heure actuelle.
- Pour démarrer la mesure, permettre aux souris de s'acclimater à la chambre avant de réglertion des niveaux d'air.
- Une fois que les souris semblent calmes, ce qui peut prendre quelques minutes, régler le débit d'air pour chaque chambre de la souris. Cela peut être différent pour chaque souris. Typiquement, le débit d'air est ajusté au début de l'expérience afin de s'assurer que CO 2 expiré atteint des niveaux détectables par tout l'équipement est utilisé, et de faire en sorte que le niveau reste assez faible pour assurer une rotation de l'air en bonne santé. Nous utilisons premiers niveaux de CO 2 entre 1000 et 1500 parties par million.
- Si des difficultés avec les ajustements, vérifier les fuites d'air. Ensuite, répétez le processus pour chacune des chambres et regarder une autre série de mesures pour voir si les ajustements apportés au flux d'air ont corrigé le niveau de CO 2. Il est important d'obtenir une ligne de base stable à lire avant de nourrir les souris. Nous utilisons une machine avec une fonction de calibrage automatique. Si ce n'est pas le cas, l'étalonnage doit être vérifié.
- Lorsque ceci est réalisé, administrer le repas oeufà la première de la souris et enregistrer le temps de chaque souris reçoit la nourriture.
- Nous exécuter la procédure pendant 4 heures pour obtenir des valeurs suffisamment pour ajuster la courbe 13 CO 2 pour chaque enrichissement de la souris. Arrivée sur les souris toutes les 30-60 min pour s'assurer que les niveaux de CO 2 sont encore sécuritaires pour les souris.
- Préparer de nouvelles boîtes contenant de la nourriture avant la fin de l'essai, les souris peuvent commencer à manger immédiatement après l'essai est terminé.
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Representative Results
A données représentatives établies à partir de trois différentes souris est illustré à la figure 2. Le graphique noir représente les points de données provenant d'une souris avec la vidange gastrique normale. Elle montre la fraction de 13 C qui est récupérée dans l'air expiré, exprimée en pourcentage de la dose administrée par heure, exprimée en fonction du temps. La courbe bleue est d'une souris avec une accélération de la vidange gastrique avec une valeur moitié de T 40 min et la courbe rouge est d'une souris avec un retard de la vidange gastrique avec une valeur moitié de T 168 min. Comme l'a établi dans une étude précédente dans notre laboratoire 7, le temps de vider gastrique normale moitié pour un âge non diabétiques NOD souris 9-15 semaines gammes de 62 à 131 min, représentée par le rectangle gris. Les points de données sont ensuite munis d'une courbe de régression non linéaire à l'équation suivante 8:
y = b à e-ct
Où y est le pourcentage de la
est calculé à partir d'une procédure d'intégration numérique en utilisant une fonction de gamma inverse. Nous avons obtenu des résultats de plusieurs milliers d'études ayant un lien biologique intra-souris variabilité d'environ 10%.
Figure 2. Représentant gastriques données de vidange provenant de trois différentes souris avec la normale (courbe noire), retardées (courbe rouge) et l'accélération (courbe bleue) la vidange gastrique. La boîte grise met en évidence des valeurs normales. L'équation des courbes de régression non linéaire est indiqué dans la case.
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Discussion
La technique décrite ici permet d'répétées et non invasive la mesure in vivo de la vidange gastrique solide chez la souris. Ce système présente l'avantage que les animaux ne sont pas retenus dans la chambre de mesure, ce qui leur permet de se déplacer et de tourner librement. Comme il s'agit d'un environnement peu familier, les souris ont encore besoin d'être formés et habitués aux chambres d'essais pour prévenir les effets du stress sur la vidange gastrique. En général, nous supposons que les données sont fiables vidange gastrique si la variabilité intra-gastrique de la souris entre consécutifs tests de vidange est inférieure à 10%.
Ce rapport est une description plus détaillée de nos précédents rapports sur les mesures de vidange gastrique chez les souris 8,11,12 et comprend des renseignements supplémentaires sur le dépannage des problèmes avec le système. La principale modification est l'utilisation de l'analyseur LGR isotopique pour mesurer les niveaux de gaz. L'analyseur nous avons utilisé dans la présente étude mesure 12 CO
Les principaux écueils à cette technique se produire lorsque les souris ne parviennent pas à manger le repas dans le délai imparti, lorsque les souris perdent leur accoutumance à la chambre et lorsque des problèmes techniques se posent à la détection système. Le défaut de manger le repas et la perte d'accoutumance sont généralement la conséquence de ne pas suivre l'étape cruciale d'avoir un horaire régulier pour les tests. Après 3 essais consécutifs séparés par 7 jours ou moins, nos souris se sont habitués à l'épreuve et prend son repas. Une fois habitués, des données fiables sont obtenus lorsque les souris sont testés au moins une fois toutes les 2 semaines pour le reste de l'expérience. Si, pour une raison quelconque, les souris n'ont pas été testés pendant 3 semaines ou plus, puis deux sessions de formation dans une semaine vous procurera l'accoutumance. Si le personnel manipulant les animaux modifier, puis re-formation des souris est conseillé et il est particulièrement important de décourager l'utilisation de savons liquides fortement aromatisées et / ou parfums par les personnes qui manipulent les souris. Difficultés avec le système de détection sont souvent dues à des faibles niveaux de CO 2 de 13 générés par un petit animal comme une souris. Le détecteur doit être étalonné et pour certains détecteurs tels que les infra-rouges systèmes basés, il est très important pour réduire la teneur en eau de l'échantillon à au moins avant les mesures.
Il ya quelques limitations de cette technique moins que le chercheur souhaite étudier la vidange gastrique plus souvent qu'une fois tous les 3 jours à la même souris. Il est déconseillé de jeûner la souris si souvent et telle restriction alimentaire sur une base régulière peut altérer la fonction gastrique. Modifications de la technique peuvent être réalisés sur mesure liquide vidange gastrique et qui est une application utile potentiel de la méthode.
D'autres méthodes de mesure de la vidange gastrique, y compris la scintigraphie ou la mesure de conserver le contenu après un délai fixe des limites beaucoup plus de questions, y compris avec le stress du processus ou en raison de la nécessité de tuer l'animal à la fin de chaque test. Les facteurs de stress sont gavage du repas test ou le blocage de l'animal pendant la mesure. Les avantages du test de l'haleine sont que la souris est en mouvement libre et non anesthésiésou sous sédation en aucune façon.
En résumé, la 13 C-octanoïque test respiratoire à l'acide permet l'étude de la progression de la maladie avec l'âge et le traitement et ces données peuvent ensuite être corrélée avec l'évolution d'autres paramètres physiologiques et l'évaluation histologique chez le même animal. Parmi les autres applications, le test permet également l'étude de la façon dont les médicaments peuvent modifier directement la vidange gastrique ainsi que les enquêtes sur la réponse au traitement chez les animaux qui développent des modifications de la vidange gastrique en raison de la maladie ou d'autres interventions.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Cette publication vidéo a été rendue possible grâce au financement de l'Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) pour le projet de Programme de subventions "pathobiologie du système entérique» DK 68055. Christopher T. Creedon a été soutenue par le public Rochester Ecoles Programme de mentorat.
Nous remercions M. Gary Stoltz pour l'assistance technique, Mme Kristy Zodrow pour l'assistance secrétariat et le Dr Douglas Baer de Los Gatos Research, Inc (Mountain View, CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A source of constant air-supply, flow as well as composition | central air supply in the research facility | ||
| 130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply |
In-house built | ||
| Octanoic acid | Cambridge isotope laboratories (Andover, MA) | CLM-293-1 | |
To prepare the egg meal:
|
Any supplier | Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal | |
| Carbon dioxide isotope analyzer | Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA) |
References
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![Évaluation de la vidange gastrique chez des souris diabétiques non obèses aide d'un [<sup> 13</sup> C]-octanoïque test respiratoire à l'acide](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/50301.jpg)
