Summary
De myofibro is een invloedrijke stromale cellen van het maagdarmkanaal die belangrijk zijn fysiologische processen reguleert zowel in normale als ziektebeelden. We beschrijven een techniek die voor de isolatie van primaire myofibroblasten van zowel muis als humaan colon weefsel, dat kan worden gebruikt voor in vitro experimenten.
Abstract
De myofibroblast is een stromale cel van de gastro-intestinale (GI) stelsel dat is steeds veel aandacht voor de cruciale rol in vele GI functies. Terwijl verscheidene myofibro cellijnen zijn commercieel beschikbaar om deze cellen te bestuderen in vitro onderzoeksresultaten uit een cellijn blootgesteld aan experimentele celkweekomstandigheden hebben inherente beperkingen als gevolg van de al te reductionistische aard van het werk. Gebruik van primaire myofibroblasts biedt een groot voordeel in termen van het bevestigen van de experimentele bevindingen die in een cellijn. Isolatie primaire myofibroblasten van een diermodel maakt de studie myofibroblasten onder omstandigheden die beter nabootsen ziektetoestand onderzocht. Isolatie van primaire myofibroblasten uit menselijke dikke darm weefsel biedt misschien wel de meest relevante experimentele gegevens, omdat de cellen komen rechtstreeks van de patiënten met de onderliggende ziekte. We beschrijven een gevestigde techniek die u kunt wordentilized primaire myofibroblasts isoleren van zowel muis als mens darmweefsel. De geïsoleerde cellen werden gekenmerkt alfa-gladde spier actine en vimentine-positief en desmine-negatieve, overeenkomstig subepitheliale intestinale myofibroblasten zijn. Primaire myofibroblast cellen kunnen worden gekweekt in celkweek en gebruikt voor experimentele doeleinden over een beperkt aantal passages.
Introduction
De regulering van gastro-intestinale (GI) stelsel functie gepaard met complexe, dynamische interacties tussen de mucosale laag en de onderliggende mesenchym. Deze interacties normaal dienen om homeostase te behouden, maar kan ook leiden tot de ontwikkeling van ziektetoestanden onder pathologische omstandigheden 1. Myofibroblasten zijn een subpopulatie van stromale cellen die zich onderliggend aan de epitheliale laag die in een paracriene wijze communiceren met de omliggende cel subpopulaties een aantal kritische maagdarmkanaal processen mucosale regeneratie, reparatie en fibrose 2 omvatten regelen.
De 18Co cellijn is een voorbeeld van een menselijk colon myofibroblast cellijn die wijd gebruikt myofibroblast functie te bestuderen omdat zijn veel kenmerken van primaire in situ myofibroblasten. Deze omvatten de eiwitexpressie van een gladde spier actine (α-SMA) en vimentine, alsmede de expressie van een aantalceloppervlakreceptoren zoals de epidermale groeifactor receptor of receptoren voor lysofosfatidezuur 3,4. Door deze gedeelde ultrastructurele kenmerken en gelijkenissen in biologische functie 5 heeft de 18Co cellijn uitgebreid gebruikt om myofibroblast functie te bestuderen in de context van vele ziektetoestanden zoals inflammatoire darmziekte of colorectale kanker 3,6. Echter, er zijn inherente beperkingen en problemen bij het gebruik van een mobiele lijn. Deze omvatten genotypische instabiliteit tijd die cellijnen van primaire cellen onderscheidt, veranderen het fenotype en biologische functie van de cel, waaronder groei en interacties met andere celpopulaties. Cellijnen missen ook de normale bestanddelen van de micro GI (epitheliale, stromale en vasculaire componenten), die een belangrijke beperking voor het gebruik ervan. De conclusies getrokken uit de experimentele cellijn onderzoek vereist verdere validatie van de ri verminderensk van misinterpretatie.
Primaire myofibroblasten kan worden verkregen bij mens en muis colon weefsel om experimentele bevindingen die in een cellijn 7 bevestigen. De methode werd oorspronkelijk beschreven door Mahida, et al.. 8 en ons protocol is een van vele goed beschreven technieken kunnen worden gebruikt om primaire myofibroblasten isoleren van muis en humane colon 9. Voor elk muismodel van colon-en vaatziekten, kan deze techniek worden gebruikt om primaire myofibroblasts isoleren om te bestuderen hoe ze omgaan met naburige cellen of bijdragen aan zowel normale of pathologische GI verwerkt 10,11. Deze techniek kan worden gebruikt om te bestuderen hoe myofibroblasts bijdragen aan genezing, fibrose, en de ontwikkeling van colorectale adenomen en carcinomen mucosale. Primaire myofibroblasten kan ook worden verkregen uit colon weefsel dat is weggesneden bij de verrichting voor goedaardige (ontstekingsdarmziekte, stricturen, diverticulitis) of kwaadaardige caarden. Geïsoleerde primaire cellen van mens en muis colon weefsel kan worden gekweekt in celkweek en gebruikt op een beperkt aantal passages.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Verkrijgen Colon Tissue
Muis
Een protocol om dierproeven uit te voeren, waarin de motivering en doelstellingen van het onderzoek, werd ingediend en door onze institutionele Office of Animal Research Oversight goedgekeurd.
- Euthanaseren de muis met geïnhaleerde isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie.
- Maak een ventrale middellijn incisie, trek de dunne darm verwijderd en identificeren van de dikke darm. Trek de blaas en baarmoeder (indien aanwezig) lateraal en identificeren van het schaambeen en snijd het met fijne schaar om het rectum bloot.
- Ontleden de dorsale mesenterium van het rectum af van de dikke darm en het mobiliseren van de dikke darm uit de anus naar de blindedarm, en doorsnijden het naar de dikke darm van de dunne darm te verbreken.
- Plaats het model in ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Vul een spuit 10 ml met ijskoude PBS en spoel de dikke darm lumen meerdere malen om de inhoud te wissen, dan snijd de dikke darm open lengte-wise met een schaar.
- Plaats de dikke darm in een 50 ml conische buis met 20 ml ijskoude PBS. De dikke darm heeft niet in een bepaalde richting worden geplaatst. Was de colon vervangen PBS totdat de vloeistof voldoende helder zonder deeltjes.
Menselijk
Een protocol om menselijk weefsel te verkrijgen van chirurgische patiënten, waarin het belang van het verkrijgen van dit weefsel, alsmede een evaluatie van de potentiële risico's en voordelen, werd ingediend en door onze institutionele Bureau van de Human Research Protection Program goedgekeurd.
- Onderzoek samenwerking met een colorectaal chirurg moet kunnen menselijk weefsel te verkrijgen voor uw onderzoek. Een protocol voor de menselijke dikke darm weefsel te verkrijgen moet worden ingediend en door uw Institutional Review Board goedgekeurd.
- Schriftelijke toestemming is verkregen van de patiënt voorafgaand aan de chirurgische procedure.
- De chirurg zal een colon resectie uit te voeren in de standard mode. Zodra de colon is verwijderd uit de patiënt, wordt het monster onmiddellijk naar pathologie. 0,5 volledige dikte sectie darmwand niet noodzakelijk voor de pathologische evaluatie wordt aangeboden en onmiddellijk op ijs-koude PBS geplaatst. Dit exemplaar mag niet de dikke darm mesenterium, en Zachte appendages moet ook worden verwijderd, omdat de aanwezigheid van vet het verteringsproces beïnvloeden.
2. Ontbloten epitheelcellen
- Incubeer de gehele muis colon in 25 ml van 5 mM EDTA in HBSS (kamertemperatuur) in een 50 ml conische buis. Plaats de conische buis op 37 ° C schudden luchtbad (250 rpm) gedurende 15 minuten. Na 15 min, giet uit het fluïdum en vullen van de buis met 25 ml 5 mM EDTA, herhaald voor een totaal van 5 wasbeurten. Voor de menselijke dikke darm, na het verkrijgen van een ½ inch strook van dikke darm wand van de patholoog snijd de dikke darm met een schaar in vier even grote stukken. Plaats twee stukken in een 50 ml conische buis enPlaats de overige twee stukjes darmweefsel in een afzonderlijke 50 ml conische buis. Incubeer daarna met 25 ml van 5 mM EDTA in HBSS en wast voeren, zoals hierboven beschreven.
- Tweemaal Spoel de dikke darm in 20 ml ijskoude PBS.
- Plaats de muis darmweefsel in een nieuwe 50 ml conische buis met 20 ml RPMI-5, 10 U van Dispase en 2000 U collagenase D (kamertemperatuur). Voor het colon weefsel gebruik twee keer zoveel Dispase en collagenase (20 U dispase, 4000 U collagenase D).
- Plaats de buis in een 37 ° C schudden lucht bad verticaal georiënteerd (als horizontaal geplaatst, er is te veel beluchting en celbeschadiging). Schudden bij 250 rpm tot maximaal 60 minuten. Na blootstelling aan de Dispase en collagenase D, de dikke darm weefsel begint te verteren en het colon weefsel begint te vezelig kijken. Dit duurt meestal ongeveer 30 minuten. Wanneer de dikke darm heeft deze verschijning, verwijder de dikke darm van de enzymen.
- Schud elke buis op en neer 2-4 keer te breken van de weefsel. PEllet het weefsel bij 200 x g in een tafelblad centrifuge (4 ° C) gedurende 5 minuten. Giet voorzichtig het supernatant af en gooi.
3. Myofibro Isolatie en Cultuur
- Resuspendeer elk pellet door toevoeging van 10 ml ACK lysisbuffer (47 ° C). Centrifugeer opnieuw bij 200 xg gedurende 5 min (4 ° C), giet de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer elk pellet door toevoeging van 10 ml RPMI-5 met een pipet.
- Ga helft van de celsuspensie (5 ml) door een 70 urn zeef met een pipet 10 ml in een 100 mm-TC behandelde schotel. Voeg vervolgens nog eens 15 ml RPMI-5. Herhaal de resterende 5 ml celsuspensie in een andere 100 mm-TC behandelde schotel. Een muis colon zal daarom opleveren twee 100 mm-TC behandeld gerechten. Een ½ inch strook van de menselijke dikke darm weefsel zal in totaal vier 100-mm-TC behandeld gerechten opleveren.
- Plaats de weefselkweekplaten in een 10% CO2 incubator bij 37 ° C. De kweekomstandigheden zijn dezelfde fof muis en menselijke primaire cellen.
- Na 3 uur, voorzichtig afwassen niet-hechtende cellen met twee wijzigingen van HBSS. Het puin drijvende moet voorzichtig worden afgewassen. Hechtende cellen bestaan uit epitheelcellen, macrofagen en myofibroblasten. Een week na het zaaien, myofibroblasten alleen verdeel, macrofagen en epitheelcellen senesce na de eerste passage. Voeg verse RPMI-5 en groeien de cellen in celkweek.
- Cellen worden gepasseerd door behandeling met trypsine gedurende 5 min en wordt 2:1.
Afkortingen
HBSS: Hank's gebalanceerde zoutoplossing; RPMI-5: Roswell Park Memorial Institute media; ACK: ammonium-chloride-Kalium; FCS: foetaal kalf serum, TC-behandeld: weefselkweek behandeld
Oplossingen
ACK lysisbuffer - (4,15 g NH4Cl, 0,5 g KHCO 3, 18,6 mg Na2EDTA, 400 ml H2O, pH op 7,2-7,4 met 1 N HCl). Filter sterilize door een 0,2 um filter en bewaar bij 4 ° C. RPMI-5 - (500 ml te maken: 454,5 ml RPMI, 25 ml FCS, 5 ml 200 mM L-glutamine, 5 ml 1 M HEPES, pH 7,4, 5 ml 100 mM natrium pyruvaat, 5 ml 100x Pen-Strep, 500 ml 50 mM B-ME in PBS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eenmaal geïsoleerd, kan primaire humane myofibroblasten worden gekweekt in celkweek en gebruikt over een beperkt aantal passages (tot passage 4). Deze cellen worden gekenmerkt als een gladde spier actine en vimentine positieve en negatieve desmine (figuur 1A), in overeenstemming met intestinale subepitheliaal myofibroblasten 5,7. Ze hebben ook een kenmerkende stervormige morfologie (figuur 1B). Primaire myofibroblasten kan vervolgens worden gebruikt voor experimentele bevindingen die in een cellijn bevestigen. Deze benadering werd gebruikt om te tonen dat de pro-inflammatoir cytokine TNF-α (10 ng / ml) induceerde de verhoogde expressie van EGF receptor expressie en signalering in deze cellen 7. Upregulated EGF receptor expressie en signalering werd aanvankelijk gevonden met behulp van de eerder genoemde humane colon myofibroblast cellijn 18Co (figuur 2). In figuur 2A, tonen we aan dat blootstelling van 18Co cellen aan TNF-45, leidde tot een tijdsafhankelijke toename van EGF receptor expressie. Dit correleerde met verbeterde EGF geïnduceerde COX-2 expressie en p42/44 MAPK fosforylering in deze cellen (Figuur 2B). Om deze experimentele bevindingen te valideren, werden experimenten herhaald met behulp van primaire humane myofibroblasten geïsoleerd van chirurgisch weggesneden dikke darm van patiënten met colorectale kanker. Zoals weergegeven in figuur 2C en 2D, primaire humane myofibroblasten na te bootsen de experimentele bevindingen aanvankelijk geïdentificeerd in de 18Co cellijn 7.
Figuur 1. Primaire myofibroblasten kunnen worden geïsoleerd uit humaan colon weefsel 7. Geïsoleerde primaire cellen vertonen een myofibroblastachtige fenotype die consequent zijn een-SMA en vimentine positief (figuur 1A) en tonen een gestraalde morfologie ( 
Figuur 2. Experimentele bevindingen in een cellijn worden onderbouwd met behulp van primaire menselijke myofibroblast cellen 7. De humane colon myofibroblast cellijn 18Co werd gebruikt om dat TNF-α aantonen induceert de opregulatie van EGF receptor expressie en signalisatie in deze cellen (Figuur 2A). Dit opregulatie van EGF receptor expressie werd geassocieerd met verhoogde EGF receptor signalering, figuur 2B, waarbij daaropvolgende blootstelling aan EGF tot verbeterde p42/44 MAPK fosforylering en COX-2 expressie. Deze effecten werden volledig geremd met de EGF-receptor remmer AG1478. Primaire humane myofibroblasten geïsoleerd van chirurgisch weggesneden dikke darm van patiënten met colorectale kanker bevestigen deze experimentele bevindingen (figuren 2Cen 2D). Tumor necrosis factor-alfa = TNF-α, EGFR = EGF-receptor, AG = AG1478, COX-2 = cyclo-oxygenase-2. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. 
Figuur 3. Primaire myofibroblasten kunnen worden geïsoleerd uit muizen darmweefsel. Een 10X weergave van primaire muis myofibroblast cellen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De algemene techniek lijkt goed wanneer de muis of colon. Deze techniek kan ook worden gebruikt om myofibroblasten isoleren van de dunne darm. Specifieke details voor de isolatie van myofibroblasten van 1. muis en 2. colon worden hieronder besproken.
1. Muis Colon
Irrigatie van de muis colon wordt vergemakkelijkt door het bevestigen van een in 4, 16 G Popper stompe einde naald aan een uiteinde van de dikke darm. Dit helpt ook bij het snijden van de dikke darm in de lengte. U kunt de dikke darm weefsel accordeon op de naald, plaats dan een punt van de schaar met het scherpe uiteinde naar boven en schuif de dikke darm weefsel over de schaar rand tijdens het snijden om het in de lengte te openen.
In stap 2.1, is het belangrijk te begrijpen dat kernmateriaal van dode cellen kan leiden tot cel klonteren. De toevoeging van DNase (50 mg / ml) kunnen worden gebruikt om dit probleem aan te pakken.
De meest kritische stap is stap 2.4. Houd een cazichtig horloge van de dikke darm weefsel. Wanneer de dikke darm begint te vezelig uitzien, verwijder de dikke darm van de enzymen. U hoeft niet om de dikke darm voor de gehele 60 minuten incuberen. Als de dikke darm weefsel wordt blootgesteld aan de Dispase en collagenase D te lang, de cellen sterven. Dit is een veel voorkomende fout die zal resulteren in een lage celopbrengst.
Vervuiling van de cellen is een veel voorkomend probleem. Zorgvuldige techniek, passende wassen en filtering zal de kans op besmetting te minimaliseren, samen met de standaard steriele technieken die worden gebruikt voor de celcultuur werk.
2. Human Colon
De duur van incubatie met de enzymen afhankelijk van de grootte van het monster dat wordt verteerd. We krijgen meestal een ½ inch volledige dikte strook dikke darm wand mens. Er is een wijziging in stap 2.3 als het isoleren van myofibroblasten uit menselijk darmweefsel. Voor stap 2.3, voor menselijke darm moet u het bedrag van Dispase (20 U) en co verdubbelenllagenase D (4000 U) gebruikt. Een nog groter deel van de dikke darm zal een langere incubatietijd nodig. Houd er ook rekening mee dat de specifieke activiteit van de enzymen kan variëren met veel, dus je kan hebben om de incubatietijd dienovereenkomstig aan te passen.
Zowel primaire muis en humane myofibroblasten, 0nce gekweekt in kweek, de geïsoleerde cellen worden onderzocht om te beoordelen zuiverheid van de cellen en bevestigen dat de cellen myofibroblast-achtige. Dit kan met verschillende technieken zoals immunohistochemische kleuring (antilichamen tegen merkers myofibroblast omvatten een gladde spier actine en vimentine, monoklonaal antilichaam tegen CD68 specifiek is voor macrofagen, CD31 specifiek voor endotheelcellen, en CD45 specifiek voor immuuncellen; antilichamen tegen E-cadherine en diverse cytokeratines zijn specifiek voor epitheelcellen. mRNA expressie kan ook worden bepaald door RT-PCR 12. Flowcytometrie kan ook worden gebruikt voor celanalyse 13.
in vitro en co-cultuur experimenten. Primaire cellen kunnen worden geïmplanteerd in het subcutane weefsel van muizen om cel-cel interacties 14 bestuderen. Toekomstige toepassingen kunnen re-implantatie van primaire myofibroblasten te betrekken in de dikke darm wand van een syngene muis gebruik te maken van de muis colonoscopie volgende genetische manipulatie.
Een aantal alternatieven voor primaire myofibroblasten isoleren van mens en muis colon zijn ook beschreven. Twee zijn hieronder opgesomd:
- Mahida, et al.. Am.. J. Physiol. 273 G1341-1348, (1997).
- De Wever, et al.. Int. J. Oncol. 39, 393-400, (2011).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant 5KO8DK085136-02 te JY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
References
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).
- Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).
- Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).
- Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line. Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).
- Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).
- Yoo, J., et al. TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- De Wever, O., et al. Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts. Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).
- Edwards, R. A., Smock, A. Z. Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts. Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).
- Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).
- Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Lahar, N., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 6, e26898 (2011).
