已开发、优化、验证并应用了三种检测方法，包括基于细胞病变效应（CPE）的检测、剂量-反应检测和加药时间（ToA）检测，用于筛选针对蓝舌病毒（BTV）的新型抗病毒药物，并确定新发现抗病毒药物可能的作用机制（MoA）。
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摘要
摘要
为鉴定针对蓝舌病毒（BTV）的潜在抗病毒药物，我们开发、优化并验证了此处介绍的三种检测方法。基于细胞病变效应（CPE）的检测法是首个用于评估化合物是否具有抗病毒活性的方法，并已被用于大规模化合物文库的筛选。同时，该CPE法也可用于评估抗病毒药物的细胞毒性。剂量-反应检测法旨在确定所选抗病毒药物的有效浓度范围， 即 50%抑制浓度（IC50）或有效浓度（EC50），以及其细胞毒性范围（CC50）。ToA检测被用于初步的作用机制研究，以确定新型抗病毒药物在BTV病毒生命周期中的作用靶点，或其对宿主细胞机制的可能影响。这些检测对于评估抗病毒药物在细胞培养系统中的功效至关重要，并已应用于我们近期的研究，助力鉴定出多种针对BTV的新型抗病毒化合物。
引言
蓝舌病毒（BTV）是呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）的代表种，是一种双链RNA病毒。BTV是影响绵羊、山羊、牛及其他家畜的重要疫病之一，每年在全球造成约30亿美元的经济损失1,2。外来型BTV血清型被列为美国农业部高影响性家畜病原体"（USDA High Consequence Livestock Pathogens）"。近年来，BTV在北欧多个国家重新出现，导致牛羊群中爆发大规模疫情3,4。由于其重要的经济意义以及作为研究模型的价值，BTV已受到广泛的分子、遗传和结构层面的研究，并已开发出多种疫苗。然而，由于缺乏适用于抗病毒药物筛选的合适检测方法，目前尚无针对BTV的抗病毒药物可用。
在最近一项以BTV为模型系统的高通量筛选（HTS）研究中，我们开发、优化并验证了一种基于细胞病变效应（CPE）的检测方法，用于鉴定针对节肢动物传播病毒的潜在广谱抗病毒药物5基于CPE的检测是一种公认的检测方法，已用于针对多种可诱导快速且可观察到的CPE/凋亡病毒的抗病毒药物发现。5-7在我们的系统中，感染BTV后，脊椎动物细胞（包括HeLa、BSR和HEK 293T）中可明显观察到细胞病变效应（CPE）。8BTV 引起的细胞病变效应（CPE）可通过多种细胞活力检测方法进行监测和定量，包括 CellT....
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方案
1. 细胞、病毒与抗病毒化合物
- 在含有5%胎牛血清（FCS）、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养BSR细胞，该细胞系为幼仓鼠肾（BHK）细胞的衍生株10。
- 对于全部三种检测，将细胞接种于含1% FCS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM中，条件已如先前优化所述5。该培养基在三种检测中均称为检测培养基。
- 将所有细胞置于37 °C、5% CO2及80–95%湿度的培养箱中孵育。
- 按照先前所述方法对10型蓝舌病病毒（BTV-10）进行蚀斑纯化并扩增8。使用检测培养基将BTV-10稀释至各指定检测所需的浓度。
- 将所有待测化合物溶于DMSO，配制成10 mM的储存液。将储存液保存于-20 °C。
- 使用检测培养基将化合物稀释至各指定检测所需的浓度2。
2. 使用 CTG 试剂盒的基于 CPE 的检测
- 使用 MicroFlo select 分配器将 BSR 细胞接种至 384 孔微孔板（黑色；规格为 16 × 24）中。每孔接种密度为 5,000 个细胞，接种体积为 20 μl，用于抗病毒效果分析。
- 将细胞孵育 2–3 小....
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结果
1. 化合物的抗病毒功效
基于细胞的CPE检测方法被开发、优化并验证 体外 使用基于荧光素酶的CTG试剂盒鉴定针对BTV的新型抗病毒药物，方法如前所述2,5采用十剂量反应检测法，通过定量测定培养物中活细胞内的ATP含量来反映已鉴定先导化合物的抗病毒活性及细胞毒性，从而评估代谢活跃细胞的数量。5,11在我们之前的研究报告中，评估了多种潜在的抗病毒化合物，包括通过高通量筛选针对BTV鉴定出的各个簇中的化合物5及其衍生物通过 从头合成 合成2. 根据其EC50，CC50 和 SI50，鉴定出若干具有良好前景的先导化合物，具有强效的抗病毒活性、低毒性和高选择性。例如，化合物052（C052）被证实其EC50 0.27±0.12 μM图1)2 以及一个CC50 82.69 μM，两者在非线性回归分析中均呈现典型的.......
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讨论
在抗病毒药物发现与开发的初期筛选阶段，一个关键步骤是建立稳健的检测方法，包括选择可量化的标志物、设计简便的实验流程、获得足够强的信号以及将变异系数控制在10%以下。由于筛选过程需要高度的可重复性，并可能涉及大量待测分子，大多数生化或基于细胞的筛选实验均以最稳健、简便且经济的检测方法为基础，以提供化学起点。基于细胞病变效应（CPE）的检测方法被指定用于满足这些要求，以从大规模化合物库中识别有效的候选分子。CPE是指病毒在培养细胞中增殖所引起的细胞不良反应。目前已有多种检测方法可通过测量不同标志物来评估CPE，这些标志物包括死亡细胞数量（细胞毒性）、活细胞数量（细胞活力）以及细胞死亡机制（凋亡）。市面上已有基于CPE检测的商用试剂，其配套实验流程简便。例如，CTG试剂盒包含单一组分 "混合与测量" 步骤，已广泛用于量化病毒诱导的细胞病变效应（CPE）。然而，基于CPE的检测方法仅适用于能够快速诱导CPE的病毒。对于不能快速诱导CPE的病毒，已开发出多种其他检测方法。例如，基于复制子的检测利用携带复制子的细胞系，可用于筛选病毒复制抑制剂，包括翻译、多聚蛋白加工以及负链和正链RNA合成的抑制剂12-14反义.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本项目由美国国立卫生研究院（NIH）向 Q. Li 提供的资助 1R03MH08127-01 和 7R03MH08127-02，以及阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）医学院的 IMPACT 基金资助。感谢 Molette 基金和奥本大学（Auburn University）提供的支持。我们还感谢 Ms. Pulin Che 和 Mr. Volodymyr Musiienko 在本研究过程中提供的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM 培养基 | Gibco | 1134218 | 用于细胞培养 |
| FBS | Gibco | 16000044 | 用于细胞培养 |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 1000185 | 用于细胞培养 |
| DPBS | Gbico | 1049769 | 用于细胞培养 |
| CellTiter-Glo (CTG) 试剂盒 | Promega | TB288 | 用于细胞活力检测 |
| 70% 乙醇 | Fisher | S25309B | 由 95% 稀释而成 |
| 抗病毒 huashilcompounds | NIH MLSMR 和全新合成 | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR 细胞 | 本实验室研发 | ||
| Synergy-II 多功能微孔板读板仪 | BioTek | 用于化学发光信号读取 | |
| MicroFlo select 分液器 | BioTek | 用于添加细胞、病毒和试剂 | |
| 384 孔平底微孔板 | CORNING | 28908031 | 用于细胞培养 |
| Gen. 5 软件 | BioTek | 用于分析 Synergy-II 多功能微孔板读板仪的读数结果 | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | 用于生物统计分析和作图 |
参考文献
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341(2012).
- Meiswinkel, R., et al.
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重印与许可
