已开发、优化、验证并应用了三种检测方法，包括基于细胞病变效应（CPE）的检测、剂量-反应检测和加药时间（ToA）检测，用于筛选针对蓝舌病毒（BTV）的新型抗病毒药物，并确定新发现抗病毒药物可能的作用机制（MoA）。
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摘要
摘要
为鉴定针对蓝舌病毒（BTV）的潜在抗病毒药物，我们开发、优化并验证了此处介绍的三种检测方法。基于细胞病变效应（CPE）的检测法是首个用于评估化合物是否具有抗病毒活性的方法，并已被用于大规模化合物文库的筛选。同时，该CPE法也可用于评估抗病毒药物的细胞毒性。剂量-反应检测法旨在确定所选抗病毒药物的有效浓度范围， 即 50%抑制浓度（IC50）或有效浓度（EC50），以及其细胞毒性范围（CC50）。ToA检测被用于初步的作用机制研究，以确定新型抗病毒药物在BTV病毒生命周期中的作用靶点，或其对宿主细胞机制的可能影响。这些检测对于评估抗病毒药物在细胞培养系统中的功效至关重要，并已应用于我们近期的研究，助力鉴定出多种针对BTV的新型抗病毒化合物。
引言
蓝舌病毒（BTV）是呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）的代表种，是一种双链RNA病毒。BTV是影响绵羊、山羊、牛及其他家畜的重要疫病之一，每年在全球造成约30亿美元的经济损失1,2。外来型BTV血清型被列为美国农业部高影响性家畜病原体"（USDA High Consequence Livestock Pathogens）"。近年来，BTV在北欧多个国家重新出现，导致牛羊群中爆发大规模疫情3,4。由于其重要的经济意义以及作为研究模型的价值，BTV已受到广泛的分子、遗传和结构层面的研究，并已开发出多种疫苗。然而，由于缺乏适用于抗病毒药物筛选的合适检测方法，目前尚无针对BTV的抗病毒药物可用。
在最近一项以BTV为模型系统的高通量筛选（HTS）研究中，我们开发、优化并验证了一种基于细胞病变效应（CPE）的检测方法，用于鉴定针对节肢动物传播病毒的潜在广谱抗病毒药物5基于CPE的检测是一种公认的检测方法，已用于针对多种可诱导快速且可观察到的CPE/凋亡病毒的抗病毒药物发现。5-7在我们的系统中，感染BTV后，脊椎动物细胞（包括HeLa、BSR和HEK 293T）中可明显观察到细胞病变效应（CPE）。8BTV 引起的细胞病变效应（CPE）可通过多种细胞活力检测方法进行监测和定量，包括 CellTiter Glo 细胞活力检测试剂盒（CTG 试剂盒）9该试剂盒通过定量检测细胞内三磷酸腺苷（ATP）的含量来确定培养物中活细胞的数量，ATP的存在表明具有代谢活性的活细胞存在。在优化条件下，本研究所建立的基于细胞病变效应（CPE）的检测方法显示出其可行性 "混合与测量" 一步式操作方案，且具有稳定的发光信号和良好的灵活性。与此同时，该基于CPE的检测方法能够排除对细胞活力具有毒性的化合物。基于CPE的检测方法在针对蓝舌病毒（BTV）的抗病毒药物筛选中表现出良好的稳健性和可靠性，并已用于筛选美国国立卫生研究院分子库小分子化合物库（NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository, MLSMR），成功鉴定出六个新的潜在抗病毒先导化合物簇5.
当通过基于细胞病变效应（CPE）的检测方法鉴定出潜在的抗病毒化合物后，需进一步进行十浓度梯度的剂量-反应实验，以确定其抗病毒活性范围及细胞毒性2。抗病毒效力以50%抑制浓度（IC50）或50%有效浓度（EC50）表示，即药物在基线与最大效应之间抑制病毒诱导CPE达到一半程度时的浓度。抗病毒药物的细胞毒性，i.e. 即50%细胞毒性浓度（CC50），是指药物引起基线与最大效应之间50%细胞毒性的浓度。选择性指数（SI），记作50%选择性指数（SI50），由CC50/IC50计算得出，用于评估抗病毒化合物对病毒诱导CPE的特异性。IC50（或EC50）、CC50和SI50值是判断抗病毒化合物是否具有足够强效性和选择性以推进后续药物开发的关键指标。
当抗病毒药物未表现出明显毒性时 体外，但能阻止病毒诱导的细胞病变效应（CPE）和病毒的 productive 生命周期，因此阐明其作用机制（MoA）至关重要2我们首先通过时间进程分析（ToA）实验来开展此类表征，以确定抗病毒化合物所影响的病毒生命周期中的可能作用环节。通常，在病毒感染前或感染后不同时间点将抗病毒化合物加入细胞。若在病毒感染过程中，化合物在其靶向环节之后才被加入，则其抗病毒活性较在该环节之前加入时更低。因此，ToA研究对于确定化合物的抗病毒效力及其潜在作用靶点（无论是病毒生命周期中的环节，还是参与病毒生命周期的宿主细胞机制）至关重要。
在所有三项检测中，均按照制造商说明书使用CTG试剂盒测定细胞活力5。该检测系统可输出足够强度的发光信号，可利用多种内部软件进行分析。每项检测均经过验证，并至少以三组独立实验、每组八个复孔的方式进行。对所有获得的数据，均分析三个参数，包括平均值（AVE）、标准差（STDEV）和变异系数（CV），以评估检测的稳健性。在确定检测的稳健性后，将使用多种生物统计学与图形分析工具对数据进一步分析并作图2。
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方案
1. 细胞、病毒与抗病毒化合物
- 在含有5%胎牛血清（FCS）、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养BSR细胞，该细胞系为幼仓鼠肾（BHK）细胞的衍生株10。
- 对于全部三种检测，将细胞接种于含1% FCS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM中，条件已如先前优化所述5。该培养基在三种检测中均称为检测培养基。
- 将所有细胞置于37 °C、5% CO2及80–95%湿度的培养箱中孵育。
- 按照先前所述方法对10型蓝舌病病毒（BTV-10）进行蚀斑纯化并扩增8。使用检测培养基将BTV-10稀释至各指定检测所需的浓度。
- 将所有待测化合物溶于DMSO，配制成10 mM的储存液。将储存液保存于-20 °C。
- 使用检测培养基将化合物稀释至各指定检测所需的浓度2。
2. 使用 CTG 试剂盒的基于 CPE 的检测
- 使用 MicroFlo select 分配器将 BSR 细胞接种至 384 孔微孔板（黑色；规格为 16 × 24）中。每孔接种密度为 5,000 个细胞，接种体积为 20 μl，用于抗病毒效果分析。
- 将细胞孵育 2–3 小时，直至细胞完全贴附于孔板表面。
- 向每孔加入终浓度为 10 μM 的抗病毒化合物，并充分混匀。
- 将 BTV 稀释至所需滴度，向每孔加入 5 μl BTV（指定 MOI）。对照孔中加入 5 μl 检测培养基。将感染后的细胞在 37 °C、5% CO2 及 80–95% 湿度条件下孵育 72 小时。
- 在感染后 72 小时（72 h.p.i.），使用前将 CTG 缓冲液和冻干 CTG 底物解冻并平衡至室温。按照生产商说明书，将冻干的酶/底物与缓冲试剂混合，配制均一的 CTG 试剂溶液。
- 将检测板在室温下平衡 15 分钟。
- 通过分配器向每孔加入等体积（25 μl）的 CTG 试剂。在室温避光条件下孵育 15 分钟后，使用多功能酶标仪以 0.1 秒的积分时间测定发光信号。
3. 剂量-反应实验
- 使用分液器将种子BSR细胞接种至384孔微孔板（黑色；16 × 24格式）中，用于抗病毒效力检测时每孔接种体积为20 μl，接种密度为5,000 个细胞/孔；用于细胞毒性检测时每孔接种体积为25 μl，接种密度为5,000 个细胞/孔。
- 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育细胞 2–3 小时2 并在80-95%湿度下培养，直至细胞充分贴壁。
- 在每种化合物的384孔板的四分之一区域内进行检测（相当于96孔板），如图所示 表1在单次实验中，每种浓度分配八个复孔。将第一列设为阳性对照，不添加化合物和病毒，最后一列（12th）作为阴性对照，仅加入病毒而不加化合物。
- 将化合物用检测培养基稀释至 50 μM，并加入到 2nd 以每孔20 μl的量将化合物加入96孔板，用于抗病毒功效检测。使用八通道半自动移液器将化合物混匀五次，使其浓度达到25 μM。
- 使用8通道半自动移液器，将20 μl混合液转移至2nd 柱到下一柱（3rd），充分混匀，配制成12.5 μM的浓度。随后从3中取出20 μl混合液，重复此过程rd 柱到下一柱（4th）以形成另一个两倍稀释，浓度为6.25 μM。重复此两倍系列稀释至第11孔th 柱。吸取并弃去11中混合物的20 μlth 加入并混匀化合物后的柱子。
- 以 MOI 0.01 为基准，向第 2 至第 11 列的每孔中加入 BTV-10，每孔体积为 5 μl。加入病毒后，各列中化合物的终浓度应为：第 2 列 20 μM，第 3 列 10 μM，随后进行两倍系列稀释至第 11 列，终浓度为 0.04 μM。
- 在第1列中加入5 μl培养基作为仅细胞对照（阳性），在第12列中每孔加入5 μl BTV作为仅BTV感染对照（阴性）。
- 将化合物稀释至初始浓度为 200 μM，用于细胞毒性检测。同样，向第 2 列每孔加入 25 μl 化合物，并用八通道半自动移液器与培养基混合 5 次，使浓度达到 100 μM。不要加入 BTV。
- 通过从第2列吸取25 μl至相邻的第3列，依次进行两倍系列稀释，直至最后一列（第12列）th）。在第12列中，混匀后吸取并弃去25 μl混合液。第2列的最终浓度应为100 μM，且第12列th 柱浓度应为 0.2 μM。第 1 列为仅细胞对照。
- 在进行抗病毒效果和细胞毒性检测时，将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 处理后在37°C、5% CO₂及80-95%湿度条件下培养72小时。按照上述方法（步骤2.5–2.7）使用CTG试剂盒检测细胞活力。
4. 加药时间（ToA）实验
- 使用分液器将BSR细胞以每孔5,000个细胞、每孔15 μl的接种体积，接种至384孔微孔板（黑色；16 × 24格式）的第1至24列。
- 针对每种化合物，在384孔板的一半区域使用全部24列，每个时间点设置八个重复孔（表2）。将第1列设为仅含细胞的对照组，每孔加入10 μl培养基；将第24列设为仅BTV感染对照组（阴性对照），每孔加入5 μl培养基和5 μl病毒（MOI为0.01），最终体积为每孔25 μl。
- 选择第2至22列中的偶数列作为不同感染后时间点（h.p.i.）的抗病毒效果评估孔。在这些孔中，每孔加入5 μl BTV（MOI为0.01）感染细胞，并在不同的h.p.i.时间点每孔加入5 μl稀释后的化合物，使最终体积为25 μl/孔。对于标注的-2和-1 h.p.i.时间点，需在BTV感染前向BSR细胞中加入化合物；对于0 h.p.i.，则同时加入化合物和BTV。
- 同时，将第3至23列中的奇数列设为仅含化合物的对照组，按指定时间点（-2、-1、0、1、2、4、8、16、24、48 h.p.i.）加入化合物。在这些孔中，每孔加入5 μl培养基和5 μl稀释后的化合物，最终体积为25 μl/孔。
- 处理完成后，将细胞置于37 °C、5% CO2、湿度为80–95%的培养箱中孵育。
- 在感染后72小时（72 h.p.i.）使用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力，具体操作如前所述（实验步骤2.5–2.7）。
5. 数据分析
- 首先使用基于多功能读数仪获得的发光信号的内部专用软件处理所有数据。确定每种处理的平均值（平均值）、标准偏差（STDEV）以及变异系数（CV），其中变异系数要求不超过10%。
- 将上述软件处理后的数据导入生物统计与图形分析软件工具，进行非线性回归分析，以确定EC50和CC50的数值。
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结果
1. 化合物的抗病毒功效
基于细胞的CPE检测方法被开发、优化并验证 体外 使用基于荧光素酶的CTG试剂盒鉴定针对BTV的新型抗病毒药物，方法如前所述2,5采用十剂量反应检测法，通过定量测定培养物中活细胞内的ATP含量来反映已鉴定先导化合物的抗病毒活性及细胞毒性，从而评估代谢活跃细胞的数量。5,11在我们之前的研究报告中，评估了多种潜在的抗病毒化合物，包括通过高通量筛选针对BTV鉴定出的各个簇中的化合物5及其衍生物通过 从头合成 合成2. 根据其EC50，CC50 和 SI50，鉴定出若干具有良好前景的先导化合物，具有强效的抗病毒活性、低毒性和高选择性。例如，化合物052（C052）被证实其EC50 0.27±0.12 μM图1)2 以及一个CC50 82.69 μM，两者在非线性回归分析中均呈现典型的...
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讨论
在抗病毒药物发现与开发的初期筛选阶段，一个关键步骤是建立稳健的检测方法，包括选择可量化的标志物、设计简便的实验流程、获得足够强的信号以及将变异系数控制在10%以下。由于筛选过程需要高度的可重复性，并可能涉及大量待测分子，大多数生化或基于细胞的筛选实验均以最稳健、简便且经济的检测方法为基础，以提供化学起点。基于细胞病变效应（CPE）的检测方法被指定用于满足这些要求，以从大规模化合物库中识别有效的候选分子。CPE是指病毒在培养细胞中增殖所引起的细胞不良反应。目前已有多种检测方法可通过测量不同标志物来评估CPE，这些标志物包括死亡细胞数量（细胞毒性）、活细胞数量（细胞活力）以及细胞死亡机制（凋亡）。市面上已有基于CPE检测的商用试剂，其配套实验流程简便。例如，CTG试剂盒包含单一组分 "混合与测量" 步骤，已广泛用于量化病毒诱导的细胞病变效应（CPE）。然而，基于CPE的检测方法仅适用于能够快速诱导CPE的病毒。对于不能快速诱导CPE的病毒，已开发出多种其他检测方法。例如，基于复制子的检测利用携带复制子的细胞系，可用于筛选病毒复制抑制剂，包括翻译、多聚蛋白加工以及负链和正链RNA合成的抑制剂12-14反义...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本项目由美国国立卫生研究院（NIH）向 Q. Li 提供的资助 1R03MH08127-01 和 7R03MH08127-02，以及阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）医学院的 IMPACT 基金资助。感谢 Molette 基金和奥本大学（Auburn University）提供的支持。我们还感谢 Ms. Pulin Che 和 Mr. Volodymyr Musiienko 在本研究过程中提供的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM 培养基 | Gibco | 1134218 | 用于细胞培养 |
| FBS | Gibco | 16000044 | 用于细胞培养 |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 1000185 | 用于细胞培养 |
| DPBS | Gbico | 1049769 | 用于细胞培养 |
| CellTiter-Glo (CTG) 试剂盒 | Promega | TB288 | 用于细胞活力检测 |
| 70% 乙醇 | Fisher | S25309B | 由 95% 稀释而成 |
| 抗病毒 huashilcompounds | NIH MLSMR 和全新合成 | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR 细胞 | 本实验室研发 | ||
| Synergy-II 多功能微孔板读板仪 | BioTek | 用于化学发光信号读取 | |
| MicroFlo select 分液器 | BioTek | 用于添加细胞、病毒和试剂 | |
| 384 孔平底微孔板 | CORNING | 28908031 | 用于细胞培养 |
| Gen. 5 软件 | BioTek | 用于分析 Synergy-II 多功能微孔板读板仪的读数结果 | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | 用于生物统计分析和作图 |
参考文献
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