Summary
여기에서 우리는 소포, 전사 및 번역 기계 캡슐, 단백질 생산의 모니터링 준비를위한 간단한 방법을 설명합니다. 그 결과 세포가없는 시스템은 점점 더 복잡 해지는 세포의 모방을 구축하기 시작 지점으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
개별 분자에서 분자 시스템에 관심을 교대로, 실험실의 증가는 더 나은 세포의 삶의 복잡성을 나타내는 세포 모방 아래에서 위로 빌드 모색하고있다. 물에 기름 에멀젼, 마이크로 유체 장치 및 소포의 착취 등 구획화 된 세포의 모방을 구축하기 위해 수행 할 수있는 경로의 수, 거기 주기적합니다. 사용할 수있는 각 옵션에 특정 장점과 단점이 있습니다. 예를 들어, 물에서 기름 유화액 높은 캡슐화 효율을 제공하지만, 잘 살아있는 세포의 투과성 장벽을 모방하지 않습니다. 여기에 설명 된 방법의 주요 장점은 모두 간단하고 구현하는 싼 것입니다. 전사 번역 기계는 같은 원심 증발기 및 압출기와 같은 일반적인 기기를 활용 과정을 통해 인지질 소포의 내부에 캡슐화됩니다. 반응은 형광 분광법에 의해 모니터링됩니다. 프로토콜의 재조합 단백질 발현, 세포의 모방의 건설, 세포 수명의 최소 요구 사항의 탐사, 또는 유전 적 회로의 조립에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
셀 무료, 체외에서 전사 번역 반응과 합성 지질의 소포의 생성은 새로운 아무것도 없습니다. 그러나 모방 세포에 두 가지를 결합하는 challenging1-6 훨씬 더있다. E.는 T7 RNA 중합 효소의 유무에 관계없이 대장균 세포 추출물은 전사 번역 기계 7,8의 소스로 사용할 수 있습니다. 단백질 발현 및 폴딩을 촉진 할 수있는 추가 세포 구성 요소의 존재에서 세포 추출물 혜택을 누릴 수 있습니다. 또한, 개별적으로 정제 된 RNA와 단백질 분자의 혼합은, PURE 시스템 9 즉 intravesicular 단백질 합성에게 4,10-14을 중재하는 데 사용할 수 있습니다. PURE 시스템은 완전히 정의 세포 모방의 건설을 허용하고 세포 추출물에서 발견되는 핵산 활동에서 고통을하지 않습니다. 실제로, 이것은 그로 인하여 낮은 캡슐화 효율을 11로 프로세스를 용이 훨씬 적은 DNA 템플릿이 필요하다는 것을 의미합니다 16-18보고되었습니다.
전사 - 번역 반응을 모니터링하는 간단한 방법은 유전자 인코딩 된 요소의 형광 또는 발광을 측정하는 것입니다. 체외에서 반응이 자주 방사선 물질에 의해 측정하고 있지만 일반적으로, 반딧불 루시 페라 제 19 또는 GFP가 사용됩니다. 형광 감지 추가하여 생물학적 같은 과정의 확률 적 특성에 몇 가지 통찰력을 제공하고, 세포 계측법 기반 방법을 통해 소포 20,21의 인구를 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 모니터링 방법은 I과 호환되는 형광 단백질의 컬렉션을 포함 설계 규칙의 작은 세트와있는에서 빌드하는 부품의 라이브러리를 정의하는 데 사용되었습니다N 시험관 전사 번역 22 식 22 유전자 조직의 영향, 시그마 요인 16의 활동과 전사 터미네이터 (23)의 효율성이다. 그럼에도 불구하고, 많은 체외에서 예측 건물의 기능, 유전자 인코딩 장치를 높이기 위해 수행해야하는 남아있다.
소포를 만들기 위해 사용할 수있는 여러 가지 방법이 있습니다. 가장 일반적인 방법은 수성 solution24에있는 부유 뒤에 유리 표면에 얇은 지질막의 생성에 따라 다릅니다. 수용액 전사 번역 기계가 포함되어있는 경우, 예를 들어, 다음 소포의 일부를 형성 단백질 생산에 필요한 구성 요소가 포함됩니다. 그러나, 이러한 방법의 캡슐화 효율은 소포의 단지 작은 비율이 활성화되어 있다는 것을 의미 낮다. 다른 방법의 대부분은 매우 높은 캡슐화 EFF의 특징iciency는 소포를 물에 기름 에멀젼 방울의 변환을 악용. 이 같은 방법은 미래에 일반화 될 가능성이 있지만, 현재 이러한 방법은 전문 장비의 필요성 고통 변경된 막 조성에 25 소포를 제공합니다. 소포 메소드에 물에있는 기름의 독특한 장점은 막 lamellarity을 제어 할 가능성이있다. 여기에 설명 된 방법은 추가 균질화 단계를 포함하여 약간의 수정과 함께 사방 연구소 (11)에 의해 설명 된 얇은 지질막 프로토콜을 기반으로합니다. 이 방법은 쉽고 싸고, 잘 전사 번역 기계 캡슐에 적합한 강력한 소포를 제공합니다.
Protocol
1. DNA 템플릿을 준비
- E.의 표준 실험실 균주에서 플라스미드 정제 같은 E. 등의 대장균, 대장균 DH5a 또는 상용 키트와 함께 노바 블루. 또한, 선형 PCR 제품은 유사 상용 키트로 정제 할 수있다. 단지 H 2 O와 DNA를 용출.
- 페놀 - 클로로포름은 DNA 솔루션에게 26의 압축을 풉니 다.
- UV 흡광도 또는 다른 적당한 방법으로 예를 들어 DNA 농도 및 순도를 결정합니다. 그것은 전사 번역 효율을 위해 고순도의 DNA를 사용하는 것이 중요합니다.
2. 얇은 지질막을 준비
- 건조한 지질 분말 무게를 용매에 용해. 1 파르 미트-2-oleoyl-SN-팔미-3-포스 포 콜린 (POPC)의 주식 솔루션은 40 mg / ml의 농도로 클로로포름에 준비가되어 있습니다.
주 : 유기 용제는 항상 유리 피펫 및 병 처리해야합니다. 즉, 플라스틱을 사용해서는 안됩니다. 스토어의바람직 아르곤 하에서 -20 ° C에서 밀폐, 용매 저항 호박색 유리 병에 똑딱 솔루션. - 5 ML 둥근 바닥 플라스크에 나누어지는 12 μmol의 POPC (40 MG / ML 주식 솔루션의 220 μL).
- 얇은 지질막을 생성하는 회전 증발기 (그림 1) 용매를 증발.
- 안전하게 원형 클립 증류 관에 둥근 바닥 플라스크를 연결하고 플라스크의 회전을 시작합니다.
- 콘덴서 코일을 통해 물의 순환을 시작합니다. 클로로포름 61.2의 낮은 비등점 ° C 대기압에서을 가지고 있기 때문에 열 목욕을 사용하여 필요하지 않습니다.
- 시스템이 마개가 열려 있는지 확인하여 대기로 열려 있는지 확인합니다. 진공 펌프의 전원을 켜고 천천히 시스템에 진공을 적용 꼭지를 닫습니다.
- 얇은 지질 필름은 불투명 필름을 형성하는 회전 증발하는 동안 둥근 바닥 플라스크의 벽에 증착그 눈으로 볼 수 있습니다. 회전 증발 0.5-2 시간 동안 계속하자. 프로세스를 중지하려면, 천천히, 진공 압력을 해제 회전을 중지하고 둥근 바닥 플라스크를 제거합니다.
3. 지질 부유 및 소포 균질화
- 직접 둥근 바닥 플라스크에 얇은 지질막에 1 ML 18.2 MΩ H 2 O를 추가합니다. 최대 속도 적극적으로 소용돌이 솔루션, 약 3,200 rpm으로, 지질 영화는 눈으로 관찰되는 유리에서 분리 될 때까지.
- 2 ML의 microcentrifuge 튜브에 지방 분산을 전송합니다.
- 셋업 링 5 개 mm 팁 균질화를 개최하라. 안전하게 지방 분산을 보유하는 균질 아래의 microcentrifuge 스탠드를 놓습니다. 18.2 MΩ H 2 O의 끝을 담그고 몇 초 동안 실행하여 균질의 분산 요소를 씻어.
- 일을 보장 지질 분산에 직접 분산 요소를 배치끝에서 microcentrifuge 관의 바닥에 접촉하지 않습니다. 전력 레벨 4 이상 14,000 rpm에서 1 분간 균질화.
4. 소포 압출 및 동결 건조
- 외부 케이싱으로 구성되어 미니 압출기 (그림 2), 두 개의 테플론 내부 막 지원, 두 개의 O-링, 하나의 테프론 베어링을 전시 리테이너 너트의 부품을 조립.
- 내부 막 지지대 홈에 두 개의 O-링을 놓습니다. Prewet 2 개의 필터 한 400 nm의 막. 필터는 그들 사이의 막으로 O-링의 안쪽에 테플론에 배치됩니다.
- 막 O-링 사이에 두 개의 필터로 둘러싸인 막 압출기 외부 케이스에 지원 놓습니다. 케이스 내부에 테프론 베어링을 배치하고 고정 너트를 부착하고 손으로 조입니다.
- 두 주사기를 씻어 18.2 MΩ 물을 채운다. 작은 시간에 주사기 바늘을 삽입압출기 어셈블리의 양쪽 끝에 테프론 oles. 바늘은 쉽게 미끄러 져한다 바늘을 강요하지 않습니다. 압출기 하우징과 착용에 주사기와 압출기를 고정합니다.
- 천천히 한 주사기의 출력 및 기타에 물을 밀어 압출기를 통해 물을 전달합니다. 이것은 하나의 흐름을 나타냅니다. 현재의 누출이없는 것을 보장 세 구절의 총 반복합니다. 물이 주사기를 제거하고 물을 폐기하십시오.
- 샘플 하나의 주사기를 작성하여 압출기에 연결하고 위의 단계 4.3에서 설명한대로 천천히 세포막을 통해 소포 솔루션을 전달합니다. 11 구절의 총 배 반복합니다. 압출 공정의 진행으로, 샘플은 덜 혼탁하고 막을 가로 질러 밀어 쉽게 될 것입니다. 저항의 급격한 감소는, 그러나, 일반적으로 막의 파열을 나타냅니다.
- 압출 소포 솔루션을 전송하고의 microcentrifuge 튜브에 소포의 40 μL 분주합니다.플래시 드라이 아이스하거나 또는 액체 질소에 각각 나누어지는을 동결.
- 30에서 하룻밤 원심 증발기 ° C. 각 나누어지는 냉동 건조 -20 ℃에서 동결 건조 된 빈 소포를 저장
5. 전사 - 번역 기계 캡슐
- 전사 - 번역 반응의 구성 요소를 믹스의 RNase 억제제의 20 단위를 추가합니다. 얼음에 품어.
- DNA 템플릿을 추가합니다. 제어 반응, 250 플라스미드 인코딩 mVenus의 NG 또는 T7 전사 프로모터 뒤에 비슷한 형광 단백질과 강한 E. 대장균 리보솜 결합 부위가 권장됩니다.
- RNase가없는 물과 최종 부피 25 μL를 가져옵니다.
- 단계 5.3에서 조립 반응 10 μL와 동결 건조 된 소포의 수화물 나누어지는 (단계 4.6). 간단히 소용돌이는 혼합물은 소포가 재현 탁 할 때까지. 이 미만 30 초를 취해야한다.
- 3 얼음에 반응을 품다0 분 소포가 팽창 할 수 있도록합니다.
- 50 MM 트리스 - 염산, 50 mM의 NaCl을, 산도 7.4의 27.0 μL 20.2 밀리그램 / ML proteinase를 K. DNase의와 RNA 분해 효소 1.5 μL로 소포의 1.5 μl를 추가하여 30 μL의 최종 볼륨 20 배 소포 혼합물을 희석 단백질 분해 효소 K에 대한 대안 extravesicular 자료를 저하로이 단계에서 추가 할 수 있습니다.
- 37 적어도 2.5 시간 동안 품어 ° C.
6. 현미경 사용
- 서로 다른 시간 지점에서 소포와 형광 단백질 생산의 진행 상황을 검사합니다. 소포는 400 nm의 소포 압출에 사용되는 분리막의 기공 크기보다 큰 직경을해야합니다.
- 표준 현미경 슬라이드에 20 X 5mm 실리콘 스페이서를 배치하여 샘플 챔버를 준비합니다. 샘플 챔버에 소포의 피펫 10 μL. 챔버에 실리콘 처리 된 유리 커버 슬립을 놓습니다.
- 63X 오일 분산 O로 소포를 관찰악용 형광 단백질에 대한 적절한 필터 세트를 사용하여 시야 및 형광 현미경에 의한 연구와 유사한 목적.
Representative Results
형광 현미경 extravesicular 물질이 효소 저하 때문 형광 만 (그림 3), 소포의 내부 관찰 보여준다. mVenus의 표현, intravesicular 형광 37 ° C에서 1.5 시간 후 관찰되기 시작하고 6 시간 내에 최대의 형광 강도에 도달합니다. 최적 배양 온도와 시간은 사용되는 특정 구조에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 서로 다른 형광 단백질은 온도에 의존 방식에서 확실히 다르게 성숙. 즉, 단백질 생산의 관찰은 단백질 합성과 폴딩시뿐만 아니라 발색단 형성에 전적으로 의존하지 않습니다. 전체적인 단백질 합성은 전사 및 번역 27에 필요한 소모 부품의 유입을 허용하는 막 단백질 모공을 통합하여 증가시킬 수 있습니다.
그것은 유사한 전사 transla을 수행하는 것이 좋습니다악용 유전자 구조가 작동하는지 확인하는 소포의 부재 TION 반응. 이 컨트롤 반응이 더 쉽게 형광 분광법보다 현미경으로 모니터링합니다. 그림 4는 구조 인코딩 mVenus의 시험관 전사 - 번역 반응을 보여줍니다. 캡슐화 반응은 유사 intravesicular 반응보다 훨씬 높은 총 형광 강도를 제공합니다. 총 intravesicular 볼륨이 extravesicular 볼륨 (즉, 희석 효과)보다 훨씬 작으므로이 캡슐화 효율로 인해입니다.
그림 1. 회전하는 증발기, 진공 펌프. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 주택 압출기 부품은 별도로 표시됩니다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 주사기, 고정 너트, 테프론 베어링, 내부 막은 서로를 마주 검은 색 O-링, 압출기 외부 케이싱, 그리고 두 번째 주사기를 지원합니다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
. 리포솜의 mVenus 단백질 생산의 그림 3 형광 이미지와 C :.. multilamellar 소포의 시야 이미지 1.5 시간과 2.5 시간 후 B와 &# 160, D : mVenus의 생산은 형광 (녹색으로 표시) 1.5 및 2.5 시간 후에, 각각에 의해 시각입니다. 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. mVenus의 시험 관내 전사 및 번역 nonencapsulated의 생체 조절 반응합니다. 형광 강도는 4 시간 동안 5 분마다 측정 하였다. 데이터는 실시간 PCR 장비로 획득 하였다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
무 세포 합성 생물학은 아직 초기 단계에 있지만, 진보는 점점 더 복잡 해지는 세포와 같은 시스템을 만들 수있는 토대를 마련했다. 소포 28의 완전히 정의 구성 요소 9 내부에서 전사 번역 기계의 재구성은 환경에 반응하는 인공 cells17, 18 건설의 뒷부분에 노력을 촉진 특히 중요했습니다. 마찬가지로, 인공 세포 연구는 진화 과정에게 4,29,30을 검사하는 데 사용되었습니다, 기계적인 RNA의 내용과 단백질 합성 22,31, 신진 대사 load32, 33의 영향, 그리고 바이러스 입자 (34)의 조립. 중요한 것은 충분한 지식은 이제 기본적인 세포 기능이 이전 보고서와 문서에 설명 된 프로토콜에 따라 실험실에서 소포 내부 재구성 할 수 존재합니다.
, 설명 캡슐화 홍보 쉽다고에 추가ocedure 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 많은 빈, 동결 건조 소포 분주은 사전에 할 수 있으며, 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장됩니다. 프로토콜은 유기 용제, 급격한 온도 변화, 또는 투석 오랜 기간에 적용되지 생물학적 분자 않습니다. 우리는 필요에 따라 절차의 상냥함 추가 구성 요소의 결합을 촉진 할 것으로 기대합니다. 우리는 또한 캡슐 또는 전사 변환 효율 막 지질 성분의 변화에 악영향을 관찰하지 않았습니다. 따라서, 막 단백질, 특정 형태학, 또는 시각화의 설립에 더 순종 지질 생각할 악용 될 수 있습니다.
설명 방법의 주요 한계는 결과 소포가 크기 또는 lamellarity에서 동질하지 않은 것입니다. 많은 애플리케이션의 경우, 이러한 어려움은 데이터의 해석을 방해하지 않습니다. 그러나 필요한 경우 추가 단계가 좁은 일에 통합 할 수 있습니다전자 크기 분포 및 캡슐화 후 같은 압출의 추가 라운드로 세포막의 층을, 감소는, 동결 해동, 또는 투석 35. 이들과 다른 문제를 회피 의심 할 여지없이 더 나은 방법이 개발 될 것이다. 그때까지 우리는 프로토콜이 아니라 세포의 모방의 건설에 적합하도록 여기에서 설명하는 찾을 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자는 Armenise 하버드 재단, 마리 퀴리 트렌 티노 COFUND (ACS), 트 렌토 (Ecomm)의 자치 지방과 자금 CIBIO을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quick Spin Mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Spectrometer | NanoDrop 1000 | NDB767ND | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 770557 | MW 760 g/mol Transition Temp -2 °C CAS# 26853-31-6 |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 459836 | Anhydrous, >99.5% |
| Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use | Sigma Aldrich | P3803-100mL | Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA |
| Chloroform | Biotech Grade Fluka | 496189-1L | Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer |
| Brown amber glass bottles | VWR | 89043-518 | 55X 48 mm |
| Rotary evaporator | Buchi Rotovapor R-210/Sigma | Z563846EU-1EA | With jack and water bath, 29/32 joint 240 V |
| Analog vortex mixer | VWR | 945300 | Speed 1,000-3,200 rpm |
| Homogenizer | IKA T10 Basic Ultra-Turbax | 3420000 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610020 | |
| Extruder filters | Whatman | 610014 | drain disc 10 mm |
| Extruder polycarbonate membrane 400 nm | Whatman | 61007 | nuclepore polycarbonate |
| Speed vacuum | Labconco | 7970011 | Centritrap DNA concentrator |
| PURExpress kit | New England Biolabs | NRM #E6800S | |
| RNAse inhibitor (40,000 U/ml) | New England Biolabs | #M0307S | |
| Proteinase K (20.2 mg/ml) | Fermentas | #EO0491 | |
| Microscope | Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera | ||
| RealTime | CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad) | ||
| Silicon press to seal -Molecular Probe | Life Technologies | P18174 | Resistant from -25-30 °C |
| Siliconized glass circle cover slides | Hampton Research | HR3-231 | Diameter= 22 mm |
| ImageJ | NIH |
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