Summary
血管功能障碍和促进生理机制的程度可以在慢性肾脏病通过测量肱动脉血流介导的舒张，主动脉脉搏波速度和血管内皮细胞的蛋白表达进行评估。
Abstract
慢性肾脏病（CKD）相比，总人口显著增加心血管疾病（CVD）的风险，这是由传统的心血管病危险因素只能部分解释。血管功能障碍是一种重要的非传统的危险因素，其特征在于，血管内皮功能障碍（最常见的评估为减值内皮依赖性扩张[EDD]）和大的弹性动脉的硬化。虽然各种技术存在来评估的EDD和大的弹性动脉僵硬，最常用的是肱动脉血流介导的舒张（FMD BA）和主动脉脉搏波速度（aPWV），分别为。两者的血管功能障碍这些非侵入性的措施是患者和无肾脏疾病的未来心血管事件的独立预测因素。慢性肾脏病患者宣扬受损的口蹄疫学士学位 ，并增加aPWV。而其中的确切机制血管功能障碍德韦洛普斯在CKD的不完全理解，增加的氧化应激和随后的还原中一氧化氮（NO）的生物利用度是非常重要的贡献者。在氧化应激的细胞的变化可以通过从肘前静脉收集血管内皮细胞和测定用免疫荧光氧化应激标志物的蛋白的表达进行评估。我们在这里提供的这些方法的讨论来衡量口蹄疫BA，aPWV和血管内皮细胞蛋白的表达。
Introduction
慢性肾脏病（CKD）是已经达到了流行病的程度，影响〜人口的11.5％，在美国就有1一个重要的公共卫生问题。 CKD患者心血管死亡或心血管事件的风险显著增加，与普通人群相比2-4。虽然CKD患者表现出传统的心血管危险因素的患病率较高，这只能说明他们增加的心血管疾病发生率（CVD）5的一部分。血管功能障碍是获得在肾脏病6-9领域日益认识到一个重要的非传统的心血管危险因素。
尽管许多变化可能的动脉功能障碍的发展做出贡献，在那些最令人关注的是血管内皮功能障碍的发展，最常用评估为减值内皮依赖性舒张功能（EDD）和LA的硬化RGE弹力型动脉10。各种技术的存在是为了评估EDD和大的弹性动脉僵硬，但最常用的是分别肱动脉血流介导的舒张口蹄疫BA和主动脉脉搏波速度（aPWV）。另一种常用的技术评估EDD是测量前臂血流反应使用静脉闭塞体积描记法11,12药理剂，如乙酰胆碱。然而，这种方法需要肱动脉，这比口蹄疫BA更具侵入性的，可能在CKD患者是禁忌的导尿。一种替代技术来评估动脉僵硬度是测量颈总动脉的局部动脉顺应性（刚度的倒数），虽然这是不广泛使用或证实与临床终点作为aPWV 13。
慢性肾脏病患者宣扬口蹄疫受损14-16 学士学位 ，并增加主动脉脉搏波速度APWV 13,17,18，甚至需要透析前。重要的是从临床的角度来看，两者的血管功能障碍这些非侵入性的措施是未来心血管事件和死亡率无论是在CKD患者19-21，以及在其他人群中22-26的独立预测因素。这些技术可用于研究各种人群心血管疾病的风险，包括慢性肾脏病患者。
其中CKD中动脉功能不全发展的确切机制尚未完全了解;然而，一氧化氮减少（NO）的生物利用度是一个关键贡献者27-30和两个EDD受损的共同机制和动脉僵硬度增加10,31。在CKD中，氧化应激增加，并有助于在NO生物利用度的32-34的减少。氧化应激被定义为活性氧（ROS）的相对于抗氧化防御系统过度的生物利用度。生理刺激，INC泸定炎症信号，促进氧化酶系统产生活性氧，包括超氧阴离子（O 2● - ）（ 例如 ，氧化剂酶NADPH氧化酶）35。超氧化物产生最终导致降低一氧化氮（NO）的生物利用度。
减值NO生物利用度可能反过来导致慢性肾脏病的发展，血管内皮功能障碍是事件的CKD 36的独立预测因素。这与动物实验数据表明eNOS的抑制引起的高血压（全身和肾小球）一致，肾小球缺血，肾小球硬化和肾小管-间质损伤37。事实上，为减少实验肾脏疾病，模仿人类疾病的发生和发展，显然有必要NO的生物利用度，提示内皮功能障碍的人CKD 38,39了关键作用。
血管氧化应激的标志物可以在v中进行评估血管性从人类研究对象收集内皮细胞，采用最初由科伦坡等 40开发和改性密封件等 41-43的技术。使用2个无菌的J-丝，细胞是从肘前静脉收集，回收，固定和购买积极鉴定为内皮细胞和使用免疫目的蛋白质的表达进行分析。
我们在此提供这样的方法，可以用来向）测量FMD BA的讨论;二）测量aPWV; C）测量氧化应激标志物的血管内皮细胞蛋白的表达。重点是慢性肾脏病患者，而不是需要长期透析治疗。
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Protocol
此协议遵循科罗拉多多机构审查委员会（COMIRB）的指导方针。
1，用于测试会议筹备工作
- 参与者应遵循这些限制的最精确的测量：12小时快速从食物和咖啡因，从运动，吸烟12小时克制，12小时克制（如适用），> 4的半衰期从药物克制如果可能的话（可能是不可行的人群如慢性肾病患者）和绝经前妇女应在1-7天的月经周期，以尽量减少激素的影响进行测试。
- 加入2毫升的0.5M乙二胺四乙酸（EDTA），0.05 g的肝素（180 USP单位/ mg）和2.5克牛血清白蛋白，以在476.8毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备500mL的解离缓冲液的pH值为7.4。这可以被存储在4℃下几个月。
- 打开超声波，电脑，以及非侵入血流动力学工作站（NIHem;动脉僵硬度的设备）。连接电缆输出超声波电脑R波触发盒。
2，收集血管内皮细胞及处理
- 一个训练有素的护士或医生进行收集（步骤2.2-2.5，2.7）和一个研究人员收集和处理的导线（步骤2.6 2.8-2.19）
- 与局部防腐剂PREP肘网站，应用止血带，找到静脉，导管插入带有18G的导管。放置一个heplock适配器上的第四末端。
- 戴上无菌手套，并穿上无菌有窗的窗帘在现场。
- 将2 J-导线上的窗帘。拉的“J”从两个电线解开的“J”形弧线。
- 摘帽的heplock和饲料J形导丝插入静脉大约8 cm。卸下前导线来回推几次。避免毛血在电线上。
- 用钢丝钳剪断电线，使他们适合在50ml锥形管中含有约30毫升分离缓冲液
- 重复第二线步2.5。
- 重复第二线步2.6。返回管湿实验室。
- 扣的导线与一对镊子和保持的导线管的内部，而是在溶液上方。 10分钟后，用电动吸移管从50ml锥形管中反复收集解离缓冲液，并使其向下穿过导线的长度，以冲洗和振动的电线，然后抖落多余的电线流体进入管释放。
- 离心400×g离心7分钟，4°C。
- 通过组合百毫升甲醛溶液+ 900毫升的PBS制备在金属箔覆盖管的甲醛溶液。
- 慢慢地从离心分离机取出管，打开真空泵上，放置一个移液管尖的抽吸软管的端部，并离开〜400毫升的管中，抽真空脱休息，而不会干扰沉淀。
- 盖上铝箔和吸管1毫升甲醛溶液成管固定样品。不要重悬。孵育在室温下10分钟。
- 通过标记与主题和考察访问信息和每张幻灯片用PAP笔在画一个椭圆形的准备8幻灯片。
- 加入15毫升的PBS，重悬，离心5分钟，在400 XG和4°C。
- 重复步骤2.15，加上12毫升的PBS，重悬，离心6分钟，在400 XG和4°C。
- 慢慢地从离心分离机取出管，打开真空泵上，放置一个移液管尖的抽吸软管的端部，并离开约2ml的管中，抽真空脱休息，而不会干扰沉淀。
- 重悬和吸管均匀地分布在8幻灯片中的椭圆形区域。
- 放置在培养箱中37℃，5小时，然后在-80℃下保存，直到准备分析（样本将被罚款多年）。
口蹄疫BA和aPWV 3。评估
- 有研究课题换上一次性短裤和有HIM /她仰卧在一个安静，昏暗，气候控制的空间。
- 将心电图的具体超声和动脉僵硬度的装置将适当数量（此过程使用非侵入血流动力学工作站[NIHem]测量动脉僵硬度，这需要4个电极），以及受血压袖带。
- 20分钟后，开始血压读数。执行至少为3，并重复直到测量是在5毫米汞柱，搁在每次读数之间持续2分钟。
- 通过触诊的肱动脉搏动，并把眼压计使用的软件程序来记录肱波形开始眼压测量。
- 重复桡，股动脉和颈动脉。
- 测量每个从supersternal缺口用卷尺（肱动脉，桡动脉和）和自定义尺/卡尺（股）这些站点的距离。
- 使用的软件程序计算颈臂，颈动脉 - 桡和颈股（aPWV）。
- 地方前臂血压袖带只是远端尺骨鹰嘴过程和记录的基线肱动脉超声图像及血流速度的测量，至少10个心动周期，设置为触发模式下的血管的软件。一，机械手臂可用于如果需要以稳定的超声探头。
- 前臂充气血压袖带至250毫米汞柱，并开始计时。指导参与者仍然一动不动。
- 开始录制速度与血管的软件时设置的定时器读取4点45分触发模式。触发释放袖带5:00，改变超声记录B型（直径）的图像时，时钟读取5:10
- 继续录制，直到时钟读取7:00
- 基线肱动脉超声图像设置为触发模式下的血管的软件记录至少10个心动周期。
- 取对象的血压。如果收缩压> 100毫米汞柱，将0.4毫克舌下含服硝酸甘油的主题下＆＃39;的舌头，并开始计时，除非患者有另一个禁忌。
- 开始录制B型（直径图像）时，时钟读取3点00分设置为触发模式血管的软件。
- 停止录制时，时钟读取8点。
- 监测血压，直到它返回到基线
4，准备人脐静脉内皮细胞（HUVEC）控制幻灯片
- 脐静脉内皮细胞生长到通道5-6和〜80％汇合。
- 胰蛋白酶消化用3ml胰蛋白酶或什么是必要的菜/烧瓶。
- 使用胰蛋白酶中和溶液等体积的中和胰蛋白酶。
- 离心机在200 XG〜5分钟，用真空去除胰蛋白酶及中和的解决方案。
- 重悬在约10毫升的PBS洗。
- 离心机在200×g离心约5分钟。除去PBS。
- 除去PBS中，在1800年PBS液+ 200μL甲醛固定。
- 重新悬浮于PBS中（〜10毫升）中。
- 离心机在200 XG〜5分钟。在一个适当的量以每年新增幻灯片〜200微升PBS中删除，重悬。
- 店幻灯片在-80°C，直到准备分析（样本将被罚款多年）。
血管内皮细胞5。染色
- 就拿滑出-80℃冷冻，等待5分钟，在室温（此程序是一批10张幻灯片，其中包括血管内皮细胞控制幻灯片）。
- 擦去多余的水用一个棘手的任务擦拭（不要触摸滑动的中心）。
- 重新滋润的幻灯片中加入PBS改变对每张幻灯片，让他们10分钟。
- 而幻灯片站立，准备5％驴血清和其他解决方案。
- 准备5％驴血清中加入300微升驴血清至5700微升改变的PBS（至pH 7.4），最多10张幻灯片（增加这个金额以上）。
- 淡化所关心的主要抗体在1,000微升5％血清。例如，硝基酪氨酸和NADPH氧化酶（1:300和1:1,500）可以作为氧化应激的标志物。
- 通过稀释5微升AF568的1500μll5％血清的准备二次AF568。
- VE准备通过稀释2微升的钙粘蛋白VE钙粘到1000微升5％血清。
- 准备AF488通过稀释5微升的VE钙粘到1000微升5％血清。
- 保持AF568，VE在整个过程中根据箔cadherin和AF488，然后放在摇杆在4℃的冰箱而准备的幻灯片。
- 补液后10分钟，干片具有微妙的任务擦拭。
- 添加5％驴血清60分钟，然后将一块塑料石蜡膜在圈定的区域，以确保该化学品的完全覆盖。
- 一个棘手的任务丢弃塑料石蜡膜和干片擦拭， 不要冲洗 。加第一抗体60分钟，将一块塑料石蜡膜在圈定的区域，以确保完全覆盖了化学。
- 丢弃塑料石蜡薄膜，改变PBS从喷瓶冲洗，浸泡在幻灯片列5分钟。而幻灯片浸泡，将它们移动到一个黑暗的房间。在黑暗中所有剩余的步骤工作。
- 干片用的Kimwipes，45分钟添加AF568（二级抗体），并把一块塑料薄膜石蜡过的圆形区域，以确保化学品的全覆盖。从灯罩。
- 丢弃在生物危险废物容器的塑料石蜡膜。用PBS改变从喷瓶冲洗，然后浸泡在列5分钟。
- 干燥载玻片用的Kimwipes，再加入VE钙粘蛋白60分钟，将一块塑料石蜡膜在圈定的区域，以确保该化学品的完全覆盖。从灯罩。
- 丢弃在生物危险废物容器的塑料石蜡膜。用PBS改变从喷瓶冲洗，然后浸泡在列5分钟。
- 干片与一个棘手的任务擦拭，加AF488 30分钟，将一块塑料石蜡膜在圈定的区域，以确保该化学品的完全覆盖。从灯罩。
- 丢弃在生物危险废物容器的塑料石蜡膜。用PBS改变从喷瓶冲洗，然后浸泡在列5分钟。
- 干片具有微妙的任务擦拭，并允许片干燥20分钟。从灯罩。
- 只添加含氟聚合物的一滴安装介质用4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚盐酸盐（DAPI）对各滑动并覆盖每个盖玻片。
- 放置在玻片4℃的冰箱用铝箔纸覆盖。成像需48小时内完成。
6，成像和血管内皮细胞分析
- 准备显微镜，用于根据特定的显微镜的式样成像染的内皮细胞。单盲法技术人员应该分析任何特定的蛋白质的蝙蝠通道细胞。
- 系统扫描幻灯片。由阳性染色鉴定内皮细胞VE钙粘蛋白和阳性染色的DAPI确认核的完整性。
- 每张幻灯片图片30细胞以供日后分析。重复的染色批次中的每个幻灯片，包括血管内皮细胞。
- 分析染色的兴趣使用定性软件的主要抗体的强度。
- 为了尽量减少不同的染色会议，报告值作为收集内皮细胞蛋白表达在血管内皮细胞相同的蛋白表达率之间的差异在强度染色的可能的混杂效应。
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Representative Results
口蹄疫BA被量化为以下反应性充血的最大变化在肱动脉的直径。因此，在其余的直径相比，直径的5分钟，血压袖带闭塞期间（ 图1）的端部以下。图A显示肱动脉的代表超声图像，和图B显示在直径以下的R波门控变化从袖口释放到2分钟的图形，如用市售软件获得。由于变化往往相当少（在图1中的变化是4.8％），在测量小的差异对结果的影响较大。使用市售的自动边缘检测软件，强烈建议尽量减少在测量44,45偏差和潜在的错误。作为经济刺激的反应性充血扩张可能会团体或条件进行比较有所不同，剪切速率应利用多普勒血流计算速度和口蹄疫广管局应的差异时适用的46,47进行调整。
aPWV被大多数商用系统，包括在我们的研究中使用的NIHem计算以最小的操作员输入。 R波的心电图进行比较，在给定站点上的波形的“脚”和时间差来计算（ 图2）的颈总动脉（图A）和股动脉（图B）。的距离测量值被用于与所述时间差相结合，以计算速度。 aPWV指速度的颈内动脉之间的股动脉（ 即 ，沿着主动脉）。
血管内皮细胞的免疫荧光分析可以提供氧化应激水平的细胞的证据。考虑到染色会话之间的差异在染色强度，给定的蛋白质的每个个体对象（代表伊马的荧光水平在图3中图A）所示水电站是相对于HUVEC控制滑动（ 图3 B组中所示的代表图像）的荧光。因此，在蛋白表达的差异可以比较两种群体之间或跨条件下（ 例如 ，在干预研究中）。
肱动脉血流介导的舒张功能（FMD BA）的评估中得到如图1所示。代表基线肱动脉内径。 A）在慢性肾脏病（CKD）患者B）R波门控的直径以下的变化从袖口释放到2分钟以图形方式显示，由于使用市售软件获得。目标=“_blank”>请点击这里查看该图的放大版本。
图2。代表性的成果打印出从与慢性肾脏病病人的评估aPWV的。 A）从R波的心电图，以颈动脉脚下延时，B），从R波的心电图，以股动脉（TFOOT）脚下的时间延迟，叠加与颈动脉波形。两个面板还显示输入的距离，从胸骨上切迹到各自的网站（由字母D表示;厘米）。计算aPWV值显示在B组（由字母PWV代表;在厘米/秒）。 请点击这里查看这个数字的放大版本。 </ P>
图3蛋白表达的代表性的图像。 A）DAPI（细胞核完整性，蓝色），VE钙粘蛋白（阳性内皮细胞识别，从CKD患者乙患者采集的细胞）和人脐静脉内皮细胞红色），绿色）的氧化酶NADPH氧化酶的权益（蛋白质（HUVEC）控制幻灯片。
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Discussion
获得准确的结果口蹄疫BA和aPWV需要获得高质量的超声图像和压力波形，分别。中央的，这是由操作员44适当并继续训练每种技术和使用。此外，重要的是，以控制可能通过标准化测试会话（ 例如 ，前12小时快，气候受控的房间等 ）44,45影响结果的尽可能多的外部变量。如上所述，使用商用的R波门控采集软件和边缘检测软件，强烈建议，以尽量减少在测量44,45偏差和潜在的错误。当口蹄疫BA受损，这可能是要么是由于受损的内皮细胞释放NO或因血管平滑肌的反应受损的NO释放。硝酸甘油施用时，控制该光滑的响应肌肉细胞层的外源性一氧化氮供体，以得出结论，在口蹄疫BA任何减值是针对血管内皮产生一氧化氮44,45的能力。
作为测量的速度，距离和时间的精确测量是至关重要的。我们所描述的协议是基于在弗雷明汉心脏研究24采用的方法。使用卡尺提出的，而不是一个卷尺提高距离从胸骨上切迹到股动脉中，采取了直接路径，而不是通过腹部肥胖电位测量的测量精度。一个干净的波形的一个明确的“脚”是从R波的心电图，以在测量现场的冲动（ 见图2）的时间差计算绝对必要的。
虽然替代技术可用于评估在血管内皮功能和ARterial刚度，口蹄疫BA和aPWV都是在临床研究中常用的，因为它们是无创，确立为中介的成果。此外，它们被充分验证在不同种群，并独立地预测心血管事件和死亡率19-26的。因此，它们可以被用来作为替代终点在评估疗效的干预，以减少心血管疾病的风险在一个特定人群，如慢性肾脏病患者的临床研究。不需要修改这些技术的具体研究慢性肾脏病患者，相对于其他人群心血管疾病的风险。
但是，有一些重要的限制，既口蹄疫BA和aPWV这值得讨论。口蹄疫BA评估大型导管动脉（肱动脉）的血管内皮功能，因此不提供微血管内皮功能的指标。使用静脉闭塞plethysm一个单独的技术地理学更适合于评估后者。然而，这种方法需要肱动脉，这比口蹄疫BA更具侵入性的，可能在CKD患者是禁忌的导尿。此外，口蹄疫BA的测量需要长时间的和具体的培训将表现良好秩序。 aPWV提供了较大的弹性大动脉僵硬度的指标，这可能与当地的动脉僵硬度（如颈动脉）。一种替代技术来评估动脉僵硬度是测量颈总动脉的局部动脉顺应性（刚度的倒数），虽然这是不广泛使用或证实与临床终点作为aPWV 13。此外，NO作为主动脉僵硬的决定因素的贡献可能由血管床48有所不同。最后，存在着潜在的的困惑既口蹄疫BA和aPWV的诠释需要进行测量和统计上作适当调整的，包括基线ðiameter和剪切速率为口蹄疫BA 45，和心脏速率和血压aPWV 49。
血管内皮细胞的集合中的一个重要的考虑是最小化血液在J-线和随后的幻灯片，使得内皮细胞可以用最少的红血细胞中的图像重叠来识别。这可以恢复细胞时可实现与适当的技术培训，以及足够的清洗。当分析的幻灯片，这是至关重要的荧光可以客观量化和图像清晰，没有太多的背景或重叠的其他细胞。优化稀释的前研究样品的分析和染色技术显微镜分析的关键步骤。值得注意的是，该技术的细胞产量是〜每收集600血管内皮细胞，总mRNA的量不足，可用来测量基因表达，从而限制了我们的探头immunofl感兴趣的蛋白uorescent染色。
除了 提出用于评估血管氧化应激，循环或尿标记物的技术可以被用来评估氧 化应激12,50。然而，它们可以是以下的反射特定于血管内皮细胞水平的氧化应激的水平。在用所提出的技术一起使用这些标记物可提供氧化应激的总体水平的最佳指示。
我们已提供的方法可以用来测量FMD BA，aPWV，和血管内皮细胞蛋白表达的概述。这些技术不仅适用于慢性肾脏病患者，而且在其他人群心血管疾病的风险增加。总的来说，他们提供的洞察血管内皮功能障碍，大的弹性动脉僵硬和促进生理机制，包括氧化应激。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
作者感谢尼娜Bispham她的技术援助。这项工作是由美国心脏协会（12POST11920023）和美国国立卫生研究院（K23DK088833，K23DK087859）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| J-wire | St. Jude | 404584 | 2 per collection |
| Disposable shorts (MediShorts) | Quick Medical | 4507 | |
| Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem) | Cardiovascualr Engineering | N/A | Includes custom ruler. An alternate system is the Sphygmocor |
| Ultrasound | G.E. | Model: Vivid7 Dimension | We use a G.E., but there are many companies and models |
| Vascular software (Vascular Imager) | Medical Imaging Applications | N/A | |
| R-wave trigger box | Medical Imaging Applications | N/A | custom made |
| Rapid Cuff Inflation System | Hokanson | Model: Hokanson E20 | |
| Forearm blood pressure cuff | Hokanson | N/A | custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder |
| HUVECs | Invitrogren | C-015-5C | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| Pap pen | Research Products International | 195505 | |
| VE Cadherin | Abcam | ab33168 | |
| AF568 | Life Technologies | A11011 | depends on specifications of microscpe |
| AF488 | Life Technologies | A11034 | depends on specifications of microscpe |
| Nitrotyrosine antibody | Abcam | ab7048 | |
| NADPH oxidase antibody | Upstate | 07-001 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| Delicate task wipe (Kimwipe) | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Confocal microscope | Olympus | Model: FV1000 FCS/RICS | many options exist |
References
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