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क्रोनिक किडनी रोग के साथ रोगियों में नाड़ी समारोह का आकलन

Published: June 16, 2014 doi: 10.3791/51478
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Division of Renal Diseases and Hypertension, University of Colorado, Denver, 2Department of Integrative Physiology, University of Colorado, Boulder

Summary

संवहनी रोग और शारीरिक तंत्र योगदान की डिग्री बाहु धमनी प्रवाह की मध्यस्थता फैलाव, महाधमनी नाड़ी तरंग वेग, और संवहनी endothelial सेल प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापने के द्वारा क्रोनिक किडनी रोग के साथ रोगियों में मूल्यांकन किया जा सकता.

Abstract

क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) के साथ रोगियों में काफी सामान्य आबादी की तुलना में हृदय रोग (सीवीडी) का खतरा बढ़ गया है, और यह केवल आंशिक रूप से पारंपरिक सीवीडी जोखिम कारकों से समझाया गया है. संवहनी रोग संवहनी endothelial रोग (सबसे अधिक बिगड़ा अन्तःचूचुक निर्भर फैलाव [EDD] के रूप में मूल्यांकन) और बड़े लोचदार धमनियों के stiffening विशेषता द्वारा एक महत्वपूर्ण गैर पारंपरिक जोखिम कारक है. विभिन्न तकनीकों EDD और बड़े लोचदार धमनी कठोरता का आकलन करने के लिए मौजूद हैं सबसे अधिक क्रमश बाहु धमनी प्रवाह की मध्यस्थता फैलाव (एफएमडी बीए) और महाधमनी नाड़ी तरंग वेग (aPWV), कर रहे हैं प्रयोग किया जाता है. संवहनी रोग के इन noninvasive उपायों दोनों के साथ और गुर्दे की बीमारी के बिना रोगियों में भविष्य हृदय की घटनाओं की स्वतंत्र predictors हैं. सीकेडी के साथ मरीजों को दोनों भ्रष्ट एफएमडी बीए का प्रदर्शन, और aPWV वृद्धि हुई है. जबकि जिसके द्वारा सटीक तंत्र संवहनी रोग एच.डी.सीकेडी में lops अधूरे समझ रहे हैं, वृद्धि हुई oxidative तनाव और नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) bioavailability में बाद में एक कमी महत्वपूर्ण योगदान कर रहे हैं. Oxidative तनाव में सेलुलर परिवर्तन कोहनी के सामने नस से संवहनी endothelial कोशिकाओं को इकट्ठा करने और immunofluorescence का उपयोग oxidative तनाव के मार्कर के प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता. हम एफएमडी बीए, aPWV, और संवहनी endothelial सेल प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए यहाँ इन तरीकों में से एक चर्चा प्रदान करते हैं.

Introduction

क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) अकेले 1 संयुक्त राज्य अमेरिका में ~ आबादी का 11.5% प्रभावित, महामारी अनुपात तक पहुँच गया है कि एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का विषय है. सीकेडी के साथ रोगियों में हृदय मौत या एक हृदय घटना का खतरा काफी सामान्य आबादी 2-4 के साथ तुलना में वृद्धि हुई है. सीकेडी के साथ रोगियों पारंपरिक हृदय जोखिम कारकों के एक उच्च व्याप्ति का प्रदर्शन हालांकि, यह केवल हृदय रोग के अपने वृद्धि हुई घटना (सीवीडी) 5 का हिस्सा बताते हैं. संवहनी रोग नेफ्रोलॉजी 6-9 के क्षेत्र में वृद्धि की मान्यता प्राप्त एक महत्वपूर्ण nontraditional हृदय जोखिम कारक है.

कई परिवर्तन होने की संभावना धमनी रोग के विकास में योगदान करते हैं, सबसे बड़ी चिंता का उन लोगों के बीच सबसे अधिक बिगड़ा अन्तःचूचुक निर्भर फैलाव (EDD) के रूप में मूल्यांकन संवहनी endothelial रोग के विकास, और ला के stiffening हैंrge लोचदार धमनियों 10. विभिन्न तकनीकों EDD और बड़े लोचदार धमनी कठोरता का आकलन करने के लिए मौजूद हैं, लेकिन सबसे अधिक इस्तेमाल किया क्रमशः बाहु धमनी प्रवाह की मध्यस्थता फैलाव एफएमडी बीए और महाधमनी नाड़ी तरंग वेग (aPWV), कर रहे हैं. EDD का आकलन करने के लिए एक और आमतौर पर इस्तेमाल तकनीक शिरापरक रोड़ा plethysmography 11,12 का उपयोग ऐसे acetylcholine के रूप में औषधीय एजेंटों के लिए प्रकोष्ठ रक्त प्रवाह प्रतिक्रिया को मापने है. हालांकि, इस पद्धति को एफएमडी बीए की तुलना में अधिक आक्रामक है और सीकेडी के साथ रोगियों में contraindicated जा सकता है जो बाहु धमनी, का कैथीटेराइजेशन की आवश्यकता है. धमनी कठोरता का आकलन करने के लिए एक वैकल्पिक तकनीक के रूप में यह व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है या aPWV 13 के रूप में नैदानिक ​​endpoints के साथ मान्य नहीं है, हालांकि, मन्या धमनी की स्थानीय धमनी अनुपालन (कठोरता का उलटा) को मापने के लिए है.

सीकेडी के साथ मरीजों को भ्रष्ट एफएमडी बीए 14-16 और वृद्धि की महाधमनी नाड़ी तरंग वेग एपी दोनों का प्रदर्शनवेस्ट वर्जीनिया 13,17,18, यहां तक कि पूर्व डायलिसिस की जरूरत के लिए. महत्वपूर्ण बात यह एक नैदानिक ​​दृष्टिकोण से, संवहनी रोग के इन noninvasive उपायों के दोनों सीकेडी 19-21, साथ ही अन्य आबादी 22-26 में साथ रोगियों में दोनों भविष्य में हृदय की घटनाओं और मृत्यु दर के स्वतंत्र predictors हैं. इन तकनीकों में सीकेडी के साथ रोगियों सहित सीवीडी के जोखिम में विभिन्न आबादी का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.

धमनियों में शिथिलता सीकेडी में विकसित करता है जिसके द्वारा सटीक तंत्र अधूरे समझ रहे हैं; हालांकि, कम नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) जैव उपलब्धता एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता 27-30 और बिगड़ा EDD दोनों का एक आम तंत्र और वृद्धि की धमनी कठोरता 10,31 है. सीकेडी में, oxidative तनाव में वृद्धि हुई है और कोई bioavailability 32-34 में कमी करने के लिए योगदान देता है. ऑक्सिडेटिव तनाव एंटीऑक्सीडेंट सुरक्षा के सापेक्ष प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के अत्यधिक जैव उपलब्धता के रूप में परिभाषित किया गया है. शारीरिक उत्तेजनाओं, इंकभड़काऊ संकेतन luding, ऑक्सीडेंट एंजाइम सिस्टम को बढ़ावा देने superoxide आयनों (ओ 2 ● -) सहित आरओएस निर्माण करने के लिए (जैसे, ऑक्सीडेंट एंजाइम NADPH oxidase.) 35. Superoxide के उत्पादन अंततः नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) की bioavailability कम कर देता है की ओर जाता है.

Endothelial रोग घटना सीकेडी 36 के एक स्वतंत्र कारक है के रूप में प्रभावित नहीं bioavailability के बदले में, सीकेडी के विकास के लिए योगदान कर सकते हैं. यह जानवर डेटा एनोस निषेध उच्च रक्तचाप (प्रणालीगत और glomerular) लाती है यह दर्शाता है कि के साथ संगत है, glomerular ischemia, ग्लोमेरुलोस्केलेरोसिस, और tubulo-बीचवाला चोट 37. दरअसल, कोई bioavailability मानव सीकेडी 38,39 में endothelial रोग के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव दे, मानव रोग mimics कि प्रयोगात्मक गुर्दे की बीमारी के विकास और प्रगति के लिए आवश्यक प्रतीत होता है कम.

संवहनी oxidative तनाव के मार्कर वी में मूल्यांकन किया जा सकतामूल रूप से कोलंबो एट अल. 40 द्वारा विकसित और जवानों एट अल 41-43 संशोधित एक तकनीक का उपयोग, मानव अनुसंधान के विषय से एकत्र endothelial कोशिकाओं ascular. 2 बाँझ जम्मू, तारों का प्रयोग, कोशिकाओं कोहनी के सामने नस से एकत्र कर रहे हैं, बरामद तय है, और बाद में सकारात्मक endothelial कोशिकाओं के रूप में पहचान की है और immunofluorescence का उपयोग ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण.

हम यहाँ एक) उपाय एफएमडी बीए करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस पद्धति की चर्चा प्रदान; ख) aPWV उपाय; ग) oxidative तनाव के मार्कर के संवहनी endothelial सेल प्रोटीन अभिव्यक्ति उपाय. फोकस पुरानी डायलिसिस की जरूरत नहीं है, सीकेडी के साथ रोगियों पर है.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल कोलोराडो एकाधिक संस्थागत समीक्षा बोर्ड (COMIRB) के दिशा निर्देशों के बाद.

परीक्षण सत्र के लिए 1. तैयारी

  1. प्रतिभागियों को सबसे सटीक मापन के लिए इन प्रतिबंधों का पालन करना चाहिए: खाद्य और कैफीन से तेजी से 12 घंटा, व्यायाम, धूम्रपान से 12 घंटा संयम से 12 घंटा संयम दवाओं से लागू हो,> 4 आधा जीवन संयम यदि संभव हो तो (एक में संभव नहीं हो सकता है अगर ऐसे सीकेडी रोगियों के रूप में जनसंख्या), और पूर्व रजोनिवृत्त महिलाओं दिनों हार्मोनल प्रभावों को कम करने के लिए मासिक धर्म चक्र के 1-7 में परीक्षण किया जाना चाहिए.
  2. फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के 476.8 मिलीलीटर में 2 मिलीलीटर 0.5 मीटर की ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), हेपरिन (180 खासियत इकाइयों / मिलीग्राम) की 0.05 जी, और गोजातीय सीरम albumin की 2.5 ग्राम जोड़कर हदबंदी बफर के 500 मिलीलीटर की तैयारी 7.4 के पीएच. यह कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  3. अल्ट्रासाउंड, कंप्यूटर, और गैर इनवेसिव Hemodynamic चालू करेंकार्य केंद्र (NIHem, धमनी कठोरता उपकरण). कंप्यूटर आर लहर ट्रिगर बॉक्स अल्ट्रासाउंड outputting केबल से कनेक्ट करें.

संवहनी endothelial कोशिकाओं के 2. संग्रह और प्रसंस्करण

  1. एक प्रशिक्षित नर्स या चिकित्सक संग्रह से करता है (2.2-2.5, 2.7 कदम) और एक शोधकर्ता तारों इकट्ठा और प्रक्रियाओं (2.6, 2.8-2.19 कदम)
  2. एक सामयिक एंटीसेप्टिक के साथ कोहनी के सामने साइट तैयार एक बंधन लागू, नस का पता लगाने, और एक 18 जी कैथेटर के साथ cannulate. चतुर्थ के अंत पर एक heplock अडैप्टर रखें.
  3. बाँझ दस्ताने पर रखो और साइट पर बाँझ गवाक्षित पर्दे डाल दिया.
  4. पर्दे पर 2 जम्मू तारों रखें. दोनों तारों से 'जे' आकार खुलना को "जम्मू" की चाप खींचो.
  5. Heplock खुलना और नस लगभग 8 सेमी में जम्मू तार फ़ीड. तार हटाने से पहले आगे और पीछे कई बार पुश. तार पर सकल खून से बचें.
  6. वे एक में फिट तो तार कटाव को तार कटर का प्रयोग करेंहदबंदी बफर का ~ 30 मिलीग्राम से युक्त 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब
  7. दूसरे तार के लिए 2.5 कदम दोहराएँ.
  8. दूसरे तार के लिए कदम 2.6 दोहराएँ. गीला प्रयोगशाला के लिए ट्यूब लौटें.
  9. संदंश की एक जोड़ी के साथ तार लगाना और ट्यूब के अंदर तार पकड़ है, लेकिन समाधान ऊपर. 10 मिनट के लिए, बार बार 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से हदबंदी बफर इकट्ठा करने के लिए एक मोटर चालित pipetter का उपयोग करें और यह ट्यूब में तारों से अधिक तरल पदार्थ से हिला तो, तारों कुल्ला और कांपना करने के लिए तारों की लंबाई नीचे चलता है तो इसे जारी.
  10. 400 XG पर 7 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र
  11. 100 मिलीलीटर formaldehyde समाधान + 900 मिलीलीटर पीबीएस के संयोजन से पन्नी कवर ट्यूब में formaldehyde समाधान तैयार करें.
  12. धीरे धीरे, अपकेंद्रित्र से ट्यूब को हटाने वैक्यूम पंप पर बारी, सक्शन नली के अंत पर एक विंदुक टिप जगह और गोली परेशान बिना आराम से vacuuming, ट्यूब में ~ 400 मिलीलीटर छोड़ दें.
  13. पन्नी और पिपेट 1 मिलीलीटर formaldehyde समाधान में से ढकनमूना ठीक करने के लिए ट्यूब. Resuspend मत करो. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  14. विषय और अध्ययन यात्रा की जानकारी के साथ लेबलिंग और एक पैप कलम के साथ प्रत्येक स्लाइड पर एक अंडाकार ड्राइंग द्वारा 8 स्लाइड तैयार करें.
  15. 15 मिलीलीटर 400 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए पीबीएस, resuspend, और अपकेंद्रित्र जोड़ें
  16. दोहराएँ कदम 2.15, 12 एमएल 400 XG पर 6 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए पीबीएस, resuspend, और अपकेंद्रित्र जोड़
  17. धीरे धीरे, अपकेंद्रित्र से ट्यूब को हटाने वैक्यूम पंप पर बारी, सक्शन नली के अंत पर एक विंदुक टिप जगह और गोली परेशान बिना आराम से vacuuming, ट्यूब में ~ 2 मिलीलीटर छोड़ दें.
  18. समान रूप से अंडाकार क्षेत्रों में 8 स्लाइड भर में Resuspend और पिपेट.
  19. 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर और फिर (नमूने कई वर्षों के लिए ठीक हो जाएगा) के विश्लेषण के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर इनक्यूबेटर में रखें.

एफएमडी बीए और aPWV की 3. आकलन

  1. डिस्पोजेबल शॉर्ट्स में अनुसंधान विषय परिवर्तन किया है और जएक शांत, मंद, जलवायु नियंत्रित कमरे में im / उसके झूठ लापरवाह.
  2. उचित विशिष्ट अल्ट्रासाउंड और धमनी कठोरता डिवाइस के लिए ईसीजी की संख्या (इस प्रक्रिया गैर इनवेसिव Hemodynamic कार्य केंद्र [NIHem] 4 इलेक्ट्रोड की आवश्यकता है जो धमनी कठोरता, को मापने के लिए उपयोग करता है), और इस विषय पर रक्तचाप कफ रखें.
  3. 20 मिनट के बाद, रक्तचाप रीडिंग शुरू करते हैं. कम से कम 3 प्रदर्शन करना, और माप 5 mmHg के भीतर कर रहे हैं जब तक प्रत्येक पढ़ने के बीच 2 मिनट आराम, दोहराएँ.
  4. बाहु धमनी नाड़ी के लिए छूकर और सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग बाहु waveforms रिकॉर्ड करने के लिए टनमीटर रखकर tonometry शुरू करो.
  5. , रेडियल ऊरु और मन्या धमनियों के लिए दोहराएँ.
  6. एक टेप उपाय (बाहु, रेडियल और मन्या) और कस्टम शासक / कैलीपर (ऊरु) का उपयोग supersternal पायदान से इन साइटों में से प्रत्येक के लिए दूरी को मापने.
  7. सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग मन्या-बाहु, मन्या रेडियल, और मन्या-ऊरु (aPWV) की गणना.
  8. जगहमोड ट्रिगर करने के लिए सेट एक संवहनी सॉफ्टवेयर के साथ कूर्पर प्रक्रिया और रिकॉर्ड आधारभूत बाहु धमनी अल्ट्रासाउंड छवियों और रक्त प्रवाह वेग माप के कम से कम 10 हृदय चक्र को सिर्फ बाहर का प्रकोष्ठ रक्तचाप कफ,. एक यांत्रिक भुजा अगर वांछित अल्ट्रासाउंड जांच स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  9. 250 mmHg के लिए प्रकोष्ठ रक्तचाप कफ फुलाना और टाइमर लगते हैं. बहुत अभी भी रहने के लिए भागीदार के निर्देश दें.
  10. टाइमर 04:45 पढ़ता है जब मोड ट्रिगर करने के लिए एक संवहनी सॉफ्टवेयर सेट के साथ रिकॉर्डिंग वेग शुरू करो. उत्प्रेरक 5:00 पर कफ जारी है और घड़ी 05:10 पढ़ता जब बी मोड (व्यास) छवियों को रिकार्ड करने के लिए अल्ट्रासाउंड बदल जाते हैं.
  11. घड़ी 07:00 पढ़ता है जब तक रिकॉर्डिंग जारी.
  12. मोड ट्रिगर करने के लिए सेट एक संवहनी सॉफ्टवेयर के साथ आधारभूत बाहु धमनी अल्ट्रासाउंड छवियों का रिकॉर्ड कम से कम 10 हृदय चक्र.
  13. विषय का रक्तचाप लो. अगर सिस्टोलिक रक्तचाप> 100 एमएमएचजी, विषय के तहत मांसल नाइट्रोग्लिसरीन की 0.4 मिलीग्राम जगह और# 39; जीभ और रोगी एक और contraindication है, जब तक टाइमर शुरू करते हैं.
  14. घड़ी मोड ट्रिगर करने के लिए सेट संवहनी सॉफ्टवेयर के साथ 03:00 पढ़ता जब बी मोड (व्यास तस्वीरें) की रिकॉर्डिंग शुरू.
  15. घड़ी 08:00 पढ़ता है जब रिकॉर्डिंग बंद करो.
  16. यह आधारभूत देता है जब तक रक्तचाप की निगरानी

4. मानव नाल की शिरा endothelial सेल की तैयारी (HUVEC) नियंत्रण स्लाइड्स

  1. पारित होने के 5-6 के लिए HUVECs बढ़ो और ~ 80% confluency.
  2. 3 trypsin के मिलीलीटर या जो भी पकवान / कुप्पी के लिए आवश्यक है साथ Trypsinize.
  3. Trypsin निष्क्रिय समाधान के एक बराबर मात्रा का उपयोग trypsin बेअसर.
  4. ~ 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र और निर्वात द्वारा trypsin और निष्क्रिय समाधान निकालने.
  5. धोने के लिए ~ 10 मिलीलीटर पीबीएस में Resuspend.
  6. 200 XG ~ 5 मिनट पर अपकेंद्रित्र. पीबीएस निकालें.
  7. पीबीएस निकालें और 1800 μl पीबीएस + 200 μl formaldehyde में तय कर लो.
  8. पीबीएस (~ 10 मिलीलीटर) में Resuspend.
  9. ~ 200 XG पर अपकेंद्रित्र5 मिनट. स्लाइड प्रति ~ 200 μl जोड़ने के लिए एक उचित मात्रा में पीबीएस, resuspend निकालें.
  10. -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान स्लाइड्स के विश्लेषण के लिए तैयार है जब तक (नमूने कई वर्षों के लिए ठीक हो जाएगा).

संवहनी endothelial कोशिकाओं के 5. धुंधला

  1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर स्लाइड ले लो और (इस प्रक्रिया एक HUVEC नियंत्रण स्लाइड सहित 10 स्लाइड के एक बैच के लिए है) कमरे के तापमान पर 5 मिनट इंतज़ार करो.
  2. एक नाजुक कार्य पोंछ (स्लाइड के केंद्र स्पर्श नहीं करते हैं) के साथ अतिरिक्त पानी दूर साफ कर लें.
  3. प्रत्येक स्लाइड के लिए बदल पीबीएस जोड़कर स्लाइड्स पुन हाइड्रेट और 10 मिनट के लिए छोड़ दें.
  4. स्लाइड खड़े हैं, वहीं 5% गधा सीरम और अन्य समाधान तैयार करते हैं.
    1. अप करने के लिए 10 स्लाइड के लिए (7.4 पीएच के लिए) बदल पीबीएस के 5,700 μl को गधा सीरम के 300 μl जोड़कर 5% गधा सीरम तैयार (अधिक के लिए इस राशि में वृद्धि).
    2. 5% सीरम के 1,000 μl में ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी पतला. उदाहरण के लिए, nitrotyrosine और NADPH के लिएoxidase (1:300 और 1:1,500) oxidative तनाव के मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
    3. 5% सीरम के 1,500 μll को AF568 के 5 μl गिराए द्वारा माध्यमिक AF568 तैयार करें.
    4. तैयार करें के 2 μl गिराए द्वारा cadherin VE 5% सीरम के 1,000 μl को Cadherin VE.
    5. के 5 μl गिराए द्वारा AF488 तैयार करें 5% सीरम के 1,000 μl को Cadherin VE.
    6. AF568 रखें, पूरी प्रक्रिया के माध्यम से पन्नी के नीचे cadherin और AF488 VE और स्लाइड तैयार करते समय तो 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में घुमाव पर जगह है.
  5. पुनर्जलीकरण के 10 मिनट के बाद, एक नाजुक कार्य के साथ शुष्क स्लाइड पोंछे.
  6. 60 मिनट के लिए 5% गधा सीरम जोड़ें और रसायन की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए परिक्रमा क्षेत्र पर प्लास्टिक आयल फिल्म का एक टुकड़ा रखें.
  7. एक नाजुक कार्य के साथ प्लास्टिक आयल फिल्म और शुष्क स्लाइड त्यागें पोंछ. धो मत करो. 60 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और यह सुनिश्चित करने के लिए परिक्रमा क्षेत्र पर प्लास्टिक आयल फिल्म का एक टुकड़ा जगहरासायनिक की पूरी कवरेज.
  8. धार बोतल से बदल पीबीएस के साथ कुल्ला और 5 मिनट के लिए स्लाइड कॉलम में लेना, प्लास्टिक आयल फिल्म त्यागें. स्लाइड जज्ब कर रहे हैं, एक अंधेरे कमरे में उन्हें स्थानांतरित. शेष सभी चरणों के लिए अंधेरे में काम करते हैं.
  9. Kimwipes साथ सूखी स्लाइड्स, 45 मिनट के लिए AF568 (माध्यमिक एंटीबॉडी) को जोड़ने और रसायन की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए परिक्रमा क्षेत्र पर प्लास्टिक आयल फिल्म का एक टुकड़ा रखें. प्रकाश से ढक दें.
  10. Biohazard अपशिष्ट कंटेनर में प्लास्टिक आयल फिल्म त्यागें. धार बोतल से बदल पीबीएस के साथ कुल्ला, और फिर 5 मिनट के लिए कॉलम में लेना.
  11. Kimwipes साथ सूखी स्लाइड्स, फिर जोड़ने के लिए 60 मिनट के लिए Cadherin VE और रसायन की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए परिक्रमा क्षेत्र पर प्लास्टिक आयल फिल्म का एक टुकड़ा रखें. प्रकाश से ढक दें.
  12. Biohazard अपशिष्ट कंटेनर में प्लास्टिक आयल फिल्म त्यागें. धार बोतल से बदल पीबीएस के साथ कुल्ला, और फिर 5 मिनट के लिए कॉलम में लेना.
  13. साथ सूखी स्लाइड्सएक नाजुक काम 30 मिनट के लिए AF488 जोड़ने और रसायन की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए परिक्रमा क्षेत्र पर प्लास्टिक आयल फिल्म का एक टुकड़ा जगह, पोंछे. प्रकाश से ढक दें.
  14. Biohazard अपशिष्ट कंटेनर में प्लास्टिक आयल फिल्म त्यागें. धार बोतल से बदल पीबीएस के साथ कुल्ला, और फिर 5 मिनट के लिए कॉलम में लेना.
  15. एक नाजुक कार्य के साथ सूखी स्लाइड्स पोंछे और स्लाइड 20 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं. प्रकाश से ढक दें.
  16. प्रत्येक स्लाइड के लिए 4 के साथ मध्यम बढ़ते ही fluoroshield की एक बूंद ', 6 diamidino-2-phenylindole हाइड्रोक्लोराइड (DAPI) जोड़ें और एक कवर पर्ची के साथ प्रत्येक को कवर किया.
  17. पन्नी के साथ कवर 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में स्लाइड रखें. इमेजिंग 48 घंटा के भीतर पूरा किया जाना चाहिए.

6. इमेजिंग और संवहनी endothelial कोशिकाओं का विश्लेषण

  1. विशिष्ट खुर्दबीन के विनिर्देशों के अनुसार दाग endothelial कोशिकाओं के लिए इमेजिंग खुर्दबीन तैयार करें. एक एकल अंधा तकनीशियन एक बल्लेबाजी के लिए किसी विशेष प्रोटीन का विश्लेषण करना चाहिएकोशिकाओं की चर्चा.
  2. योजनाबद्ध तरीके स्लाइड स्कैन करें. Cadherin VE और DAPI के लिए सकारात्मक धुंधला द्वारा परमाणु अखंडता की पुष्टि के लिए सकारात्मक धुंधला द्वारा endothelial कोशिकाओं की पहचान.
  3. बाद में विश्लेषण के लिए स्लाइड प्रति छवि 30 कोशिकाओं. HUVEC सहित, दाग बैच में प्रत्येक स्लाइड के लिए दोहराएँ.
  4. एक गुणात्मक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए धुंधला की तीव्रता का विश्लेषण करें.
  5. विभिन्न धुंधला सत्र, HUVEC में यही प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एकत्र endothelial कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति के अनुपात के रूप में रिपोर्ट मूल्यों के बीच तीव्रता धुंधला में मतभेद के संभावित confounding प्रभाव को कम करने के लिए.

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Representative Results

एफएमडी बीए प्रतिक्रियाशील hyperemia निम्नलिखित बाहु धमनी के व्यास में शिखर परिवर्तन के रूप में मात्रा निर्धारित है. इस प्रकार, आराम से कम व्यास एक 5 मिनट रक्तचाप कफ रोड़ा अवधि (चित्रा 1) के अंत के बाद व्यास की तुलना में है. पैनल एक बाहु धमनी के एक प्रतिनिधि अल्ट्रासाउंड छवि से पता चलता है, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त के रूप में पैनल बी, निम्नलिखित 2 मिनट के लिए कफ रिलीज से व्यास में आर लहर gated परिवर्तन का ग्राफ को प्रदर्शित करता है. परिवर्तन (चित्रा 1 में परिवर्तन 4.8% है) अक्सर काफी कम है, माप में छोटे मतभेदों के परिणाम पर बड़ा प्रभाव पड़ सकता है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित बढ़त का पता लगाने सॉफ्टवेयर के उपयोग अत्यधिक माप 44,45 में पूर्वाग्रह और संभावित त्रुटि को कम करने के लिए सिफारिश की है. प्रतिक्रियाशील hyperemia दौरान फैलाव के लिए प्रोत्साहन समूहों या तुलना की जा रही स्थितियों के बीच अलग हो सकता है, कतरनी दर डॉपलर रक्त प्रवाह का उपयोग कर की गणना की जानी चाहिएवेग, और एफएमडी बीए 46,47 लागू जब अंतर के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.

aPWV हमारे अनुसंधान में इस्तेमाल NIHem सहित अधिकांश व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिस्टम, द्वारा कम से कम ऑपरेटर इनपुट के साथ गणना की है. ईसीजी की आर लहर दी गई साइट पर तरंग का "पैर" की तुलना में है और समय का अंतर मन्या धमनी (एक पैनल) और ऊरु धमनी (पैनल बी) के लिए (चित्रा 2) की गणना की जाती है. दूरी माप एक वेग की गणना करने के समय के अंतर के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. aPWV (यानी. महाधमनी साथ) ऊरु धमनी मन्या धमनी के बीच वेग को दर्शाता है.

संवहनी endothelial कोशिकाओं की Immunofluorescent विश्लेषण oxidative तनाव के स्तर के सेलुलर सबूत प्रदान कर सकते हैं. धुंधला सत्र के बीच धुंधला तीव्रता में अंतर के लिए खाते, प्रत्येक व्यक्ति के विषय (प्रतिनिधि आईएमए के लिए एक दिया प्रोटीन की प्रतिदीप्ति का स्तर चित्रा 3 एक पैनल) में दिखाया गया GES HUVEC नियंत्रण स्लाइड (प्रतिनिधि छवियों चित्रा 3 पैनल बी में दिखाया गया है) के प्रतिदीप्ति की तुलना में है. इस प्रकार, प्रोटीन अभिव्यक्ति में मतभेद (एक हस्तक्षेप अध्ययन के दौरान, उदाहरण के लिए) समूहों के बीच या स्थितियों में या तो तुलना की जा सकती.

चित्रा 1
बाहु धमनी प्रवाह की मध्यस्थता फैलाव (एफएमडी बीए) के आकलन के दौरान प्राप्त चित्रा 1. प्रतिनिधि आधारभूत बाहु धमनी व्यास. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त के रूप में एक) क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) के साथ एक रोगी में. निम्नलिखित 2 मिनट के लिए कफ रिलीज से व्यास में बी) आर लहर gated परिवर्तन, रेखांकन भी दिखाया गया है.लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
सीकेडी के साथ एक रोगी में aPWV के आकलन से चित्रा 2. प्रतिनिधि परिणाम प्रिंट आउट. ए) मन्या धमनी के पैर को ईसीजी के आर लहर से समय में देरी, ऊरु धमनी (tfoot) के पैर को ईसीजी के आर लहर से बी) के समय में देरी, मन्या तरंग के साथ मढ़ा. दोनों पैनलों भी संबंधित साइटों के लिए suprasternal पायदान से inputted दूरी दिखाने पत्र (डी द्वारा प्रतिनिधित्व किया, सेमी में). गणना की aPWV मूल्य पैनल बी में दिखाया गया है (पत्र PWV द्वारा प्रतिनिधित्व किया, सेमी / सेक में). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें. </ P>

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रोटीन अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि छवियाँ. ए) DAPI (परमाणु अखंडता, नीला), सकारात्मक endothelial सेल पहचान (Cadherin VE, सीकेडी बी के साथ एक रोगी से एकत्र कोशिकाओं) से और एक मानव नाल की शिरा endothelial सेल के लिए लाल), हरा) ऑक्सीडेंट एंजाइम NADPH oxidase ब्याज की (प्रोटीन (HUVEC) नियंत्रण स्लाइड.

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Discussion

एफएमडी बीए और aPWV के लिए सही परिणाम प्राप्त करने क्रमशः, उच्च गुणवत्ता अल्ट्रासाउंड छवियों और दबाव waveforms प्राप्त करने की आवश्यकता है. इस लिए केन्द्रीय ऑपरेटर 44 से प्रत्येक तकनीक के उचित और निरंतर प्रशिक्षण और उपयोग है. इसके अलावा, यह परीक्षण सत्र (जैसे, पिछले 12 घंटे में तेजी, जलवायु नियंत्रित कक्ष, आदि) 44,45 मानकीकरण से संभव के रूप में परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं कि के रूप में कई बाहरी चर के लिए नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है. जैसा कि ऊपर कहा, व्यावसायिक रूप से आर लहर gated अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और किनारे खोज सॉफ़्टवेयर का उपयोग अत्यधिक माप 44,45 में पूर्वाग्रह और संभावित त्रुटि को कम करने के लिए सिफारिश की है. एफएमडी बीए बिगड़ा हुआ है, इस कारण अन्तःचूचुक से कोई रिलीज बिगड़ा के लिए या कारण नहीं जारी किया संवहनी चिकनी मांसपेशियों का बिगड़ा जवाबदेही के लिए भी हो सकता है. Sublingual नाइट्रोग्लिसरीन चिकनी की जवाबदेही के लिए नियंत्रित करने के लिए प्रशासित किया जाता हैएफएमडी बीए में किसी भी परेशानी होती है नाइट्रिक ऑक्साइड 44,45 निर्माण करने के लिए संवहनी endothelium की क्षमता के लिए विशिष्ट है कि समाप्त करने के क्रम में एक exogenous नाइट्रिक ऑक्साइड दाता को पेशी सेल परत,.

माप एक वेग है, दूरी और समय दोनों की सटीक मापन महत्वपूर्ण हैं. हम वर्णन किया है प्रोटोकॉल Framingham हार्ट अध्ययन 24 में नियोजित कार्यप्रणाली पर आधारित है. बल्कि एक टेप उपाय से उठाया नली का व्यास के इस्तेमाल की बजाय पेट का मोटापा अधिक क्षमता मापने की तुलना में एक सीधा रास्ता लेने के द्वारा ऊरु धमनी को suprasternal पायदान से दूरी की माप की सटीकता में सुधार. एक साफ तरंग का एक स्पष्ट "पैर" माप स्थल पर आवेग (देखें चित्र 2) को ईसीजी के आर लहर से समय अंतर की गणना के लिए अत्यंत आवश्यक है.

वैकल्पिक तकनीकों endothelial समारोह और एआर दोनों का आकलन करने के लिए उपलब्ध हैंवे गैर आक्रामक रहे हैं और अच्छी तरह से मध्यस्थ परिणामों के रूप में स्थापित किया है क्योंकि terial कठोरता, एफएमडी बीए और aPWV आमतौर पर नैदानिक ​​अनुसंधान में इस्तेमाल कर रहे हैं दोनों. इसके अलावा, वे अच्छी तरह से विभिन्न आबादी में मान्य है और हृदय की घटनाओं और मृत्यु दर 19-26 की स्वतंत्र रूप से भविष्य कहनेवाला हैं. इस प्रकार, वे इस तरह के सीकेडी के साथ रोगियों के रूप में, एक दिया आबादी में हृदय जोखिम को कम करने के लिए एक हस्तक्षेप के लिए प्रभावकारिता का आकलन नैदानिक ​​अध्ययन में किराए endpoints के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. सीवीडी के जोखिम पर अन्य आबादी की तुलना में इन तकनीकों का संशोधन, विशेष रूप से सीकेडी के साथ रोगियों का अध्ययन करने की आवश्यकता नहीं है.

हालांकि, एफएमडी बीए और aPWV कि योग्यता चर्चा करने के लिए दोनों महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. एफएमडी बीए इस प्रकार microvascular endothelial समारोह की एक सूची प्रदान नहीं करता है, एक बड़ी नाली धमनी (बाहु धमनी) के संवहनी endothelial समारोह का आकलन है. शिरापरक रोड़ा plethysm उपयोग कर एक अलग तकनीकography उत्तरार्द्ध का आकलन करने के लिए बेहतर अनुकूल है. हालांकि, इस पद्धति को एफएमडी बीए की तुलना में अधिक आक्रामक है और सीकेडी के साथ रोगियों में contraindicated जा सकता है जो बाहु धमनी, का कैथीटेराइजेशन की आवश्यकता है. इसके अलावा, एफएमडी बीए की माप अच्छी तरह से प्रदर्शन किया जा क्रम में लंबा और विशिष्ट प्रशिक्षण की आवश्यकता है. aPWV (जैसे मन्या धमनी के रूप में) स्थानीय धमनी कठोरता से अलग हो सकता है, जो बड़े लोचदार धमनी कठोरता का एक सूचकांक, प्रदान करता है. धमनी कठोरता का आकलन करने के लिए एक वैकल्पिक तकनीक के रूप में यह व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है या aPWV 13 के रूप में नैदानिक ​​endpoints के साथ मान्य नहीं है, हालांकि, मन्या धमनी की स्थानीय धमनी अनुपालन (कठोरता का उलटा) को मापने के लिए है. इसके अलावा, महाधमनी कठोरता का एक कारक के रूप में नहीं के योगदान संवहनी बिस्तर 48 से भिन्न हो सकते हैं. अंतिम, आधारभूत विकास सहित के रूप में उपयुक्त के लिए मापा और सांख्यिकीय समायोजित करने की आवश्यकता है कि एफएमडी बीए और aPWV दोनों की व्याख्या करने की क्षमता घालमेल कर दिया है, वहाँ रहे हैंiameter और कतरनी एफएमडी बीए 45 के लिए दर, और हृदय गति और aPWV 49 के लिए रक्तचाप.

संवहनी endothelial कोशिकाओं के संग्रह में एक महत्वपूर्ण विचार endothelial कोशिकाओं छवियों में ओवरलैपिंग न्यूनतम लाल रक्त कोशिकाओं के साथ की पहचान की जा सकती है, जैसे कि जम्मू तारों पर खून को कम करने और बाद में स्लाइड पर है. कोशिकाओं उबरने जब यह उचित तकनीक के लिए प्रशिक्षण के साथ ही पर्याप्त मात्रा में कपड़े धोने के साथ प्राप्त किया जा सकता है. स्लाइड्स का विश्लेषण करते हैं, तो यह प्रतिदीप्ति निष्पक्ष मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और छवियों अन्य कोशिकाओं के साथ ज्यादा पृष्ठभूमि या ओवरलैप के बिना, स्पष्ट कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. पूर्व अध्ययन के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए धुंधला और माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए तकनीक के लिए dilutions की अनुकूलन महत्वपूर्ण कदम हैं. ध्यान से, इस तकनीक के सेल उपज ~ संग्रह प्रति 600 संवहनी endothelial कोशिकाओं, कुल mRNA की एक अपर्याप्त राशि इस प्रकार immunofl करने के लिए हमारी जांच सीमित, जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए उपलब्ध हैब्याज की प्रोटीन की uorescent धुंधला हो जाना.

, संवहनी oxidative तनाव का आकलन परिसंचारी या मूत्र मार्करों के लिए प्रस्तुत तकनीक के अलावा oxidative तनाव 12,50 आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, वे संवहनी endothelium के स्तर को विशिष्ट oxidative तनाव के स्तर की कम चिंतनशील हो सकता है. प्रस्तुत तकनीक के साथ संयोजन के रूप में इन मार्कर का उपयोग oxidative तनाव के समग्र स्तर का सबसे अच्छा संकेत प्रदान कर सकता है.

हम एफएमडी बीए, aPWV, और संवहनी endothelial सेल प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि तरीकों की एक सिंहावलोकन प्रदान की है. इन तकनीकों में सीकेडी के साथ रोगियों के लिए न केवल उचित है, लेकिन यह भी हृदय रोग का खतरा बढ़ अन्य आबादी में हैं. सामूहिक रूप से, वे संवहनी endothelial रोग, बड़े लोचदार धमनी कठोरता, और oxidative तनाव सहित शारीरिक तंत्र, योगदान में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों उसे तकनीकी सहायता के लिए नीना Bispham धन्यवाद. इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (12POST11920023), और एनआईएच (K23DK088833, K23DK087859) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
J-wire St. Jude 404584 2 per collection
Disposable shorts (MediShorts) Quick Medical 4507
Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem) Cardiovascualr Engineering N/A Includes custom ruler.  An alternate system is the Sphygmocor
Ultrasound G.E. Model: Vivid7 Dimension We use a G.E., but there are many companies and models
Vascular software (Vascular Imager)  Medical Imaging Applications N/A
R-wave trigger box Medical Imaging Applications N/A custom made
Rapid Cuff Inflation System Hokanson Model: Hokanson E20
Forearm blood pressure cuff Hokanson N/A custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder 
HUVECs Invitrogren C-015-5C
Donkey serum Jackson 017-000-121
Pap pen Research Products International 195505
VE Cadherin Abcam ab33168
AF568 Life Technologies A11011 depends on specifications of microscpe 
AF488 Life Technologies A11034 depends on specifications of microscpe 
Nitrotyrosine antibody  Abcam ab7048
NADPH oxidase antibody Upstate 07-001
DAPI  Vector H-1200
Delicate task wipe (Kimwipe)  Fisher Scientific 06-666-A
Plastic paraffin film (parafilm)  Fisher Scientific 13-374-10
Confocal microscope  Olympus Model: FV1000 FCS/RICS many options exist 

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References

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चिकित्सा अंक 88 क्रोनिक किडनी रोग endothelial कोशिकाओं प्रवाह की मध्यस्थता फैलाव immunofluorescence oxidative तनाव नाड़ी तरंग वेग
क्रोनिक किडनी रोग के साथ रोगियों में नाड़ी समारोह का आकलन
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Jablonski, K. L., Decker, E.,… More

Jablonski, K. L., Decker, E., Perrenoud, L., Kendrick, J., Chonchol, M., Seals, D. R., Jalal, D. Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease. J. Vis. Exp. (88), e51478, doi:10.3791/51478 (2014).

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