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Medicine

Beurteilung der Gefäßfunktion bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung

Published: June 16, 2014 doi: 10.3791/51478
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Division of Renal Diseases and Hypertension, University of Colorado, Denver, 2Department of Integrative Physiology, University of Colorado, Boulder

Summary

Der Grad der vaskulären Dysfunktion beitragen und physiologischen Mechanismen können bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung durch Messen brachialis flussabhängigen Dilatation Aortapulswellengeschwindigkeit und vaskuläre Endothelzellen-Protein-Expression zu beurteilen.

Abstract

Patienten mit chronischer Nierenerkrankung (CKD) haben deutlich erhöhtes Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) im Vergleich zu der allgemeinen Bevölkerung, und das ist nur teilweise durch CVD traditionellen Risikofaktoren erläutert. Vaskuläre Dysfunktion ist ein wichtiger nicht-traditionellen Risikofaktor, gekennzeichnet durch den vaskulären endothelialen Dysfunktion (am häufigsten als beeinträchtigte Endothel-abhängige Dilatation [EDD] beurteilt) und Versteifung der großen elastischen Arterien. Während verschiedene Techniken existieren, um EDD und großen elastischen Arteriensteifheit, beurteilen die am häufigsten verwendet werden, sind Oberarmarterie flussvermittelte Dilatation (FMD BA) und Aorten-Pulswellengeschwindigkeit (aPWV) sind. Beide nicht-invasive Maßnahmen der vaskulären Dysfunktion sind unabhängige Prädiktoren für zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse bei Patienten mit und ohne Nierenerkrankung. Patienten mit CKD zeigen sowohl eingeschränkter MKS-BA und erhöhte aPWV. Während die genauen Mechanismen, durch die vaskuläre Dysfunktion Entlops in CKD sind unvollständig verstanden, erhöhten oxidativen Stress und eine anschließende Reduzierung der Stickoxid (NO) Bioverfügbarkeit wichtigen Beitrag. Zelluläre Veränderungen im oxidativen Stress kann durch das Sammeln von vaskulären Endothelzellen aus der Antekubitalvene und Mess Protein-Expression von Markern für oxidativen Stress mittels Immunfluoreszenz beurteilt werden. Wir bieten hier eine Diskussion dieser Methoden zur Bekämpfung der MKS BA, aPWV und vaskuläre Endothelzellen Protein-Expression zu messen.

Introduction

Chronische Nierenerkrankungen (CKD) ist eine große öffentliche Gesundheit betreffen, die epidemische Ausmaße erreicht hat, beeinflussen ~ 11,5% der Bevölkerung allein in den Vereinigten Staaten ein. Das Risiko eines kardiovaskulären Todes oder eines kardiovaskulären Ereignisses bei Patienten mit CKD im Vergleich mit der allgemeinen Bevölkerung 4.2 deutlich erhöht. Obwohl Patienten mit CKD zeigen eine hohe Prävalenz von traditionellen kardiovaskulären Risikofaktoren, das nur erklärt, einen Teil ihrer erhöhten Inzidenz von kardiovaskulären Erkrankungen (CVD) 5. Vaskuläre Dysfunktion ist eine wichtige nicht-traditionellen kardiovaskulären Risikofaktor immer mehr die Anerkennung auf dem Gebiet der Nephrologie 6-9.

Während viele Veränderungen mit der Entwicklung der arteriellen Dysfunktion beitragen, unter denen der größte Sorge sind die Entwicklung des vaskulären endothelialen Dysfunktion, am häufigsten als beeinträchtigt Endothel-abhängige Dilatation (EDD) bewertet und Versteifung des large elastische Arterien 10. Es gibt verschiedene Techniken, um EDD und großen elastischen Arteriensteifigkeit zu bewerten, aber die am häufigsten verwendet werden, sind Oberarmarterie flussvermittelte Dilatation MKS-BA und Aorten-Pulswellengeschwindigkeit (aPWV) sind. Eine andere häufig verwendete Technik, um beurteilen EDD ist die Messung Unterarmblutfluss Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe wie Acetylcholin mit Venenverschlussplethysmographie 11,12. Diese Methode erfordert jedoch Katheterisierung der Arteria brachialis, die mehr invasiv als MKS-BA ist und kann bei Patienten mit CKD kontraindiziert sein. Eine alternative Technik, um arterielle Steifheit zu bewerten ist, um die lokale arterielle Compliance (die Inverse der Steifigkeit) der Halsschlagader zu messen, obwohl dies nicht so weit verbreitet verwendet werden oder mit der klinischen Endpunkte aPWV 13 validiert.

Patienten mit CKD zeigen sowohl eingeschränkter MKS BA 14-16 und erhöhte Aorten-Pulswellengeschwindigkeit aPWV 13,17,18, auch vor der Dialyse benötigen. Wichtig ist aus klinischer Sicht sind diese beiden nicht-invasive Maßnahmen der vaskulären Dysfunktion unabhängige Prädiktoren für zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse und Mortalität sowohl bei Patienten mit CKD 19-21, sowie in anderen Populationen 22-26. Diese Techniken lassen sich Studium verschiedener Populationen in Gefahr, CVD, einschließlich Patienten mit CKD angewendet werden.

Die genauen Mechanismen, durch die arterielle Dysfunktion entwickelt sich in CKD sind unvollständig verstanden; jedoch reduziert Stickstoffmonoxid (NO) Bioverfügbarkeit eine kritische Faktor 27-30 und ein gemeinsamer Mechanismus sowohl beeinträchtigt EDD und erhöhten arteriellen Steifigkeit 10,31. In CKD wird oxidativen Stress erhöht und trägt zur Reduzierung der NO-Bioverfügbarkeit 32-34. Oxidativer Stress gilt als mäßiger Bioverfügbarkeit von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), bezogen auf die antioxidative Schutz definiert. Physiologische Stimuli, inc.Luding entzündlichen Signalisierung fördern Oxidationsenzymsysteme ROS zu produzieren, einschließlich Superoxid-Anion (O 2 ● -) (z. B. die Oxidationsmittel-Enzym NADPH-Oxidase.) 35. Produktion von Superoxid führt schließlich zur Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO) reduziert.

Beeinträchtigte NO Bioverfügbarkeit kann wiederum dazu beitragen, die Entwicklung der CKD, wie endotheliale Dysfunktion ist ein unabhängiger Prädiktor des einfallenden CKD 36. Dies steht im Einklang mit Tier-Daten, die auf eNOS-Hemmung induziert Hypertonie (systemischen und glomerulären), glomeruläre Ischämie, Glomerulosklerose und Tubulointerstitielle 37 Verletzungen. Tatsächlich reduziert NO Bioverfügbarkeit notwendig erscheint für die Entwicklung und Progression von experimenteller Nierenerkrankung, die menschliche Krankheit imitiert, was auf eine wichtige Rolle für die endotheliale Dysfunktion in der menschlichen CKD 38,39.

Marker der vaskulären oxidativen Stress in v beurteilenascular Endothelzellen aus menschlichen Versuchspersonen gesammelt, unter Verwendung einer Technik, die ursprünglich von Colombo et al. 40 entwickelt und modifiziert Dichtungen et al 41-43. Mit 2 sterile J-Leitungen werden die Zellen aus der Antekubitalvene gesammelt, zurückgewonnen, fixiert und später positiv als Endothelzellen identifiziert und für die Expression von Proteinen von Interesse unter Verwendung von Immunfluoreszenz analysiert.

Wir bieten hier eine Diskussion dieser Methodik, die zu einer) Maßnahme MKS-BA verwendet werden kann; b) messen aPWV; c) messen vaskulären endothelialen Zellprotein Expression von Markern für oxidativen Stress. Der Schwerpunkt liegt auf Patienten mit CKD, chronischer Dialyse erfordert.

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Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Colorado Mehrere Institutional Review Board (COMIRB).

1. Vorbereitung für Testing Session

  1. Die Teilnehmer sollten diese Einschränkungen für genaueste Messungen folgen: 12 Stunden schnell aus der Nahrung und Koffein, 12-Stunden-Zurückhaltung von der Übung, 12 h Zurückhaltung von Rauchen, sofern zutreffend,> 4 Halbwertszeit von Zurückhaltung Medikamente, wenn möglich (nicht durchführbar sein, in ein Bevölkerung, wie CKD-Patienten) und Frauen vor der Menopause sollten in 1-7 Tagen des Menstruationszyklus, um hormonelle Einflüsse zu minimieren getestet werden.
  2. Planen 500 ml der Spaltpuffer durch Zugabe von 2 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,05 g Heparin (180 USP Einheiten / mg) und 2,5 g Rinderserumalbumin zu 476,8 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei pH-Wert von 7,4. Dies kann bei 4 ° C mehrere Monate gelagert werden.
  3. Schalten Sie Ultraschall, Computer-und der Nicht-invasive hämodynamischeWorkstation (NIHem; arterielle Steifheit Ausrüstung). Schließen Sie die Kabel Ausgabe des Ultraschall an den Computer R-Wellen-Trigger-Box.

2. Erhebung und Verarbeitung von Vascular Endothelial Cells

  1. Eine ausgebildete Krankenschwester oder Arzt führt die Sammlung (Schritte von 2,2 bis 2,5, 2.7) und ein Forscher sammelt und verarbeitet die Drähte (Schritte 2.6, 2,8 bis 2,19)
  2. Bereiten Sie die Ellen Website mit einem Antiseptikum, gelten ein Tourniquet, suchen Vene und kanülieren mit einer 18 G-Katheter. Legen Sie ein heplock Adapter auf dem Ende des IV.
  3. Setzen Sie auf sterile Handschuhe und legte sterile fenestrierten drapiert über die Website.
  4. Platz 2 J-Drähte an den Vorhängen. Ziehen Sie den Bogen des "J", die "J"-Form aus beiden Drähte abwickeln.
  5. Die Kappe des heplock und Futtermittel J-Draht in die Vene ca. 8 cm. Hin und her schieben mehrmals, bevor Sie den Draht. Vermeiden Brutto Blut auf dem Draht.
  6. Verwenden Sie Drahtschneider, um die Drähte schnippeln, so dass sie in einem Anfall50 ml konischen Röhrchen mit ~ 30 ml Spaltpuffer
  7. Wiederholen Sie Schritt 2,5 für die zweite Leitung.
  8. Wiederholen Sie Schritt 2.6 für die zweite Leitung. Zurück Rohr Nasslabor.
  9. Schließe die Drähte mit einer Zange und halten Sie die Drähte im Inneren der Röhre, aber vor der Lösung. Für 10 Minuten, mit einem motorisierten Pipettierers immer wieder sammeln die Dissoziation Puffer aus der 50 ml konischen Röhrchen und lassen es so läuft es über die gesamte Länge der Leitungen zu spülen und die Drähte vibrieren, dann schütteln Sie überschüssige Flüssigkeit aus Drähten in die Röhre.
  10. Zentrifuge für 7 min bei 400 × g und 4 ° C.
  11. Bereiten Sie die Formaldehydlösung in Folie abgedeckt Rohr durch die Kombination von 100 ml Formaldehyd-Lösung + 900 ml PBS.
  12. Langsam entfernen Rohr aus der Zentrifuge, schalten Sie die Vakuumpumpe, legen Sie eine Pipettenspitze am Ende der Saugschlauch und lassen ~ 400 ml in der Röhre, Staubsaugen den Rest, ohne das Pellet zu stören.
  13. Mit Folie abdecken und Pipette 1 ml Formaldehyd-Lösung indas Rohr, um die Probe zu beheben. Resuspendieren Sie nicht. Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur.
  14. Bereiten 8 gleitet durch Markierung mit Thema und Studienbesuch Informationen und zeichnen ein Oval auf jeder Folie mit einem Pap-Stift.
  15. 15 ml PBS resuspendieren und zentrifugieren Sie für 5 min bei 400 × g und 4 ° C.
  16. Wiederholen Sie Schritt 2.15, fügen Sie 12 ml PBS resuspendieren und zentrifugieren für 6 min bei 400 x g und 4 ° C
  17. Langsam entfernen Rohr aus der Zentrifuge, schalten Sie die Vakuumpumpe, legen Sie eine Pipettenspitze am Ende der Saugschlauch und lassen ~ 2 ml in der Röhre, Staubsaugen den Rest, ohne das Pellet zu stören.
  18. Resuspendieren und Pipette gleichmäßig auf die acht Rutschen in den Bereichen oval.
  19. Platz in Brutschrank bei 37 ° C für 5 Stunden und dann bei -80 ° C zu lagern, bis zur Analyse bereit (Proben wird gut für viele Jahre sein).

3. Beurteilung der MKS-BA und aPWV

  1. Haben Forschungsthema Veränderung in Einweg-Shorts und haben him / sie liegen in Rückenlage in einem ruhigen, schwach, klimatisierte Zimmer.
  2. Legen Sie die entsprechende Anzahl von EKG für die spezifische Ultraschall und arterielle Steifheit Gerät (dieses Verfahren wird das nicht-invasive hämodynamische Workstation [NIHem], um die arterielle Steifigkeit, die vier Elektroden erfordert messen) und Blutdruckmanschette am Thema.
  3. Nach 20 Minuten beginnen Blutdruckwerte. Führen Sie mindestens 3, und wiederholen, bis Messungen sind innerhalb von 5 mmHg, Ruhe-2 min zwischen jeder Lesung.
  4. Beginnen Tonometrie durch Palpation der A. brachialis Puls und Platzierung der Tonometer zu brachial Wellenformen Aufnahme mit dem Software-Programm.
  5. Wiederholen Sie für die radialen, Femur-und Halsschlagadern.
  6. Messen Sie den Abstand zu jedem dieser Standorte aus der supersternal Kerbe mit einem Maßband (brachial, Radial-und Halsschlagader) und benutzerdefinierte Herrscher / Sattel (Femur).
  7. Berechnen Karotis-Arm-, Karotis-Radial-, und Halsschlag-Oberschenkel-(aPWV) mit dem Software-Programm.
  8. OrtUnterarm Blutdruckmanschette nur distal des Olecranon und Rekord mindestens 10 Herzzyklen der Grundlinie A. brachialis Ultraschallbilder und Blutströmungsmessung, mit einem Gefäß Software eingestellt auslösen Modus. Ein mechanischer Arm verwendet werden, um die Ultraschallsonde zu stabilisieren, falls gewünscht.
  9. Pumpen Unterarm Blutdruckmanschette auf 250 mmHg und beginnen Timer. Weisen Sie die Teilnehmer, ganz still zu bleiben.
  10. Starten Sie die Aufnahme Geschwindigkeiten mit einer Gefäß Software Satz auszulösen, wenn der Timer-Modus liest 04.45. Trigger lassen Sie die Manschette um 5:00 und ändern Sie den Ultraschall zur B-Modus (Durchmesser) Bilder aufnehmen, wenn die Uhr liest 05.10.
  11. Aufnahme fortsetzen, bis die Uhr liest 07.00.
  12. Nehmen Sie mindestens 10 Herzzyklen der Grundlinie A. brachialis Ultraschallbilder mit einer Gefäß Software eingestellt auslösen Modus.
  13. Nehmen Thema Blutdruck. Wenn systolischer Blutdruck> 100 mmHg, legen 0,4 mg Nitroglycerin sublingual unter dem Thema &# 39, die Zunge und beginnen Timer, es sei denn, der Patient hat einen weiteren Kontraindikation.
  14. Starten Sie die Aufnahme B-Modus (Durchmesser-Bilder), wenn die Uhr liest 03.00 Uhr mit der Gefäß Software eingestellt auslösen Modus.
  15. Beenden Sie die Aufnahme, wenn die Uhr liest 08.00.
  16. Überwachung der Blutdruck, bis sie zum Ausgangswert zurück

4. Vorbereitung menschlichen Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVEC) Steuer Slides

  1. Wachsen HUVECs um den Durchgang 5-6 und ~ 80% Konfluenz.
  2. Trypsinieren mit 3 ml Trypsin oder was auch immer notwendig ist, für die Schüssel / Kolben.
  3. Trypsin zu neutralisieren, mit einem gleichen Volumen an Trypsin-Neutralisationslösung.
  4. Zentrifuge bei 200 g für ca. 5 Min. und entfernen Trypsin und Neutralisationslösung von Vakuum.
  5. Resuspendieren in ~ 10 ml PBS zu waschen.
  6. Zentrifugieren bei 200 × g ~ 5 min. PBS entfernen.
  7. PBS entfernen und zu beheben 1800 ul PBS + 200 ul Formaldehyd.
  8. Resuspendieren in PBS (~ 10 ml).
  9. Zentrifugieren bei 200 × g ~5 min. Entfernen PBS resuspendieren in einem geeigneten Volumen auf ~ 200 ul pro Folie hinzufügen.
  10. Shop Objektträger bei -80 ° C bis zur Analyse bereit (Proben wird gut für viele Jahre sein).

5. Färbung von Vascular Endothelial Cells

  1. Nehmen Sie Dias von -80 ° C Gefrierschrank und warten 5 Minuten bei Raumtemperatur (dieses Verfahren für eine Charge von 10 Objektträger, auch ein Steuerschieber HUVEC).
  2. Überschüssiges Wasser mit einer heiklen Aufgabe wischen (nicht berühren Zentrum von Rutschbahn).
  3. Re-Hydrat die Folien durch Zugabe verändert PBS zu jeder Folie und lassen Sie sie für 10 min.
  4. Während die Folien stehen, bereiten Sie 5% Esel-Serum und anderen Lösungen.
    1. Bereiten Sie 5% Esel-Serum durch Zugabe von 300 ul der Esel-Serum zu 5.700 ul veränderten PBS (bis zu einem pH-Wert von 7,4) für bis zu 10 Objektträger (erhöhen diesen Betrag für mehr).
    2. Verdünnen Sie die primären Antikörper von Interesse in 1000 ul von 5% Serum. Zum Beispiel Nitrotyrosin und NADPHOxidase (1:300 und 1:1500) könnte als Marker für oxidativen Stress verwendet werden.
    3. Bereiten sekundären AF568 durch Verdünnen 5 ul der AF568 zu 1.500 μll von 5% Serum.
    4. Vorbereitung VE durch Verdünnen von 2 ul VE Cadherin Cadherin bis 1000 &mgr; l 5% Serum.
    5. Vorbereitung AF488 durch Verdünnen von 5 &mgr; l VE-Cadherin zu 1000 &mgr; l 5% Serum.
    6. Halten AF568, AF488 VE Cadherin und unter Folie durch den gesamten Prozess und legen Sie dann auf Rocker in 4 ° C Kühlschrank während der Vorbereitung Rutschen.
  5. Nach 10 min Rehydrierung, trockenen Objektträger mit einer heiklen Aufgabe zu wischen.
  6. Plus 5% Eselserum für 60 min und legen ein Stück Plastik Paraffinfilm über dem eingekreisten Bereich um eine vollständige Abdeckung der chemischen gewährleisten.
  7. Entsorgen Sie die Plastikfolie Paraffin-und Trockenrutschen mit einer heiklen Aufgabe zu wischen. Nicht waschen. In primären Antikörper für 60 min und legen ein Stück Plastik Paraffinfilm über den eingekreisten Bereich zu gewährleisten,vollständige Abdeckung der chemischen.
  8. Entsorgen Sie die Plastikparaffinfilm gründlich mit veränderten PBS aus Spritzflasche und genießen in Folie Spalten für 5 min. Während die Schieber Einweichen, verschieben Sie sie in einen dunklen Raum. Arbeiten in der Dunkelheit für alle weiteren Schritte.
  9. Chemische Präparate mit Kimwipes, fügen AF568 (sekundärer Antikörper) für 45 Minuten und setzen Sie ein Stück Plastik Paraffinfilm über den eingekreisten Bereich um eine vollständige Abdeckung der chemischen gewährleisten. Cover von Licht.
  10. Entsorgen Sie die Plastikparaffinfilm in der biohazard Abfallbehälter. Spülen Sie mit veränderten PBS aus Spritzflasche, und dann in Spalten einweichen für 5 min.
  11. Chemische Präparate mit Kimwipes, dann fügen VE Cadherin 60 min und legen ein Stück Plastik Paraffinfilm über den eingekreisten Bereich um eine vollständige Abdeckung der chemischen gewährleisten. Cover von Licht.
  12. Entsorgen Sie die Plastikparaffinfilm in der biohazard Abfallbehälter. Spülen Sie mit veränderten PBS aus Spritzflasche, und dann in Spalten einweichen für 5 min.
  13. Chemische Präparate miteine heikle Aufgabe zu wischen, fügen AF488 für 30 min und legen ein Stück Plastik Paraffinfilm über den eingekreisten Bereich um eine vollständige Abdeckung der chemischen gewährleisten. Cover von Licht.
  14. Entsorgen Sie die Plastikparaffinfilm in der biohazard Abfallbehälter. Spülen Sie mit veränderten PBS aus Spritzflasche, und dann in Spalten einweichen für 5 min.
  15. Trocken-Folien mit einer heiklen Aufgabe wischen und lassen Folien für 20 Minuten trocknen. Cover von Licht.
  16. Einen Tropfen nur fluoroshield Montagemedium mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol Hydrochlorid (DAPI) zu jeder Folie abdecken und jeweils mit einem Deckglas.
  17. Objektträger in 4 ° C Kühlschrank mit Folie abgedeckt. Imaging muss innerhalb von 48 Stunden abgeschlossen sein.

6. Imaging und Analyse der Vascular Endothelial Cells

  1. Bereiten Mikroskop zur Abbildung Bunt Endothelzellen nach Vorgaben des speziellen Mikroskop. Eine einzelne geblendet Techniker sollte eine bestimmte Protein für eine Fledermaus zu analysierench von Zellen.
  2. Dias scannen systematisch. Identifizieren Endothelzellen durch positive Färbung für VE-Cadherin und bestätigen Kernintegrität durch positive Färbung für DAPI.
  3. Bild 30 Zellen pro Objektträger für die spätere Analyse. Wiederholen Sie für jede Folie in der gefärbten Partie, einschließlich der HUVEC.
  4. Analysieren der Intensität der Färbung für den primären Antikörper von Interesse unter Verwendung eines qualitativen Software.
  5. Um die mögliche Verwechslung Wirkung Intensitätsunterschiede zwischen verschiedenen Färbung Färbungs Sitzungen Bericht Werte als Verhältnis der Proteinexpression in den gesammelten Endothelzellen auf die gleiche Protein-Expression in HUVEC minimieren.

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Representative Results

FMD BA wird als die Spitzendurchmesseränderung der Arteria brachialis folgenden reaktiven Hyperämie quantifiziert. Somit wird der Durchmesser in Ruhe auf den Durchmesser nach dem Ende des 5-Minuten Blutdruckmanschette Verschlusszeit (Fig. 1) verglichen. Panel A zeigt eine repräsentative Ultraschallbild der Arteria brachialis, und Panel B zeigt eine Grafik der R-Welle gated Änderung im Durchmesser von Manschettenmitteilung zu 2 Minuten nach, als mit kommerziell erhältlichen Software erhalten. Da die Veränderung oft gering (in Fig. 1 ist die Änderung 4,8%), können kleine Unterschiede in der Mess große Auswirkungen auf die Ergebnisse haben. Verwendung von handelsüblichen automatischen Kantenerkennung-Software wird dringend empfohlen, Voreingenommenheit und potenzielle Fehler in der Messung 44,45 minimieren. Als der Reiz für die Dilatation während des reaktiven Hyperämie kann zwischen Gruppen oder Bedingungen, die verglichen unterscheiden, sollte Scherrate mit der Doppler-Blutfluss berechnet werdenGeschwindigkeiten und MKS-BA sollte für Unterschiede, wenn zutreffend 46,47 eingestellt werden.

aPWV mit minimaler Bedien von den meisten im Handel erhältlichen Systeme, einschließlich der NIHem in unserer Forschung berechnet. Die R-Zacke des EKG ist mit "Fuß" der Wellenform an einer gegebenen Stelle verglichen und die Zeitdifferenz für die Halsschlagader (Panel A) und die Oberschenkelarterie (Feld B) berechnet wird (Fig. 2). Die Abstandsmessungen werden in Verbindung mit den Zeitdifferenzen verwendet werden, um eine Geschwindigkeit zu berechnen. aPWV bezeichnet Geschwindigkeit zwischen der Halsschlagader auf die Oberschenkelarterie (dh. entlang der Aorta).

Immunfluoreszenzanalyse von vaskulären Endothelzellen zelluläre Nachweis des Niveaus von oxidativem Stress bereitzustellen. Um Unterschiede in der Farbintensität zwischen Färbung Sitzungen Konto, das Niveau der Fluoreszenz eines bestimmten Proteins auf jedes einzelne Motiv (Vertreter ima ges in Fig. 3 Panel A) gezeigt ist, um die Fluoreszenz des HUVEC Steuerschieber (repräsentative Bilder in Fig. 3 gezeigten Tafel B) verglichen. Somit können Unterschiede in der Proteinexpression entweder zwischen den Gruppen oder zwischen Bedingungen (z. B. während einer Interventionsstudie) verglichen werden.

Figur 1
Abbildung 1. Vertreter Basis Arteria brachialis Durchmessers während Beurteilung der Arteria brachialis flussvermittelte Dilatation (FMD BA) erhalten. A) Bei einem Patienten mit chronischer Nierenerkrankung (CKD). B) R-Wellen-gated Änderung im Durchmesser von Manschetten Freisetzung in 2 min nach wird grafisch dargestellt, wie mit handelsüblichen Software erhalten.target = "_blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse Ausdruck aus Beurteilung der aPWV bei einem Patienten mit CKD. A) Verzögerungszeit vom R-Zacke des EKGs an den Fuß der Halsschlagader, B) Zeitverzögerung von der R-Zacke des EKGs an den Fuß des Oberschenkelarterie (TFOOT), überlagert mit der Halsform. Beide Panels zeigen auch die eingegebenen Entfernungen von der Jugulum an die jeweiligen Standorte (mit dem Buchstaben D dargestellt, in cm). Der berechnete Wert wird in aPWV Tafel B gezeigt (mit den Buchstaben PWV vertreten, in cm / s). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. </ P>

Fig. 3
3. Repräsentative Bilder der Proteinexpression. A) DAPI (Kernintegrität, blau), VE-Cadherin (positive Endothelzellen Identifizierung; grün) das Oxidationsmittel Enzym NADPH-Oxidase-(Protein von Interesse; rot) aus Zellen von einem Patienten mit CKD B gesammelt) und für eine menschliche Nabelschnur Endothelzellen (HUVEC) Steuerschieber.

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Discussion

Beziehen präzise Ergebnisse für die MKS-BA und aPWV erfordert den Erwerb qualitativ hochwertige Ultraschallbilder und Druckwellenformen auf. Zentral ist dabei angemessene und kontinuierliche Schulung und Nutzung der einzelnen Verfahren durch den Bediener 44. Darüber hinaus ist es wichtig, so viele externe Variablen, die die Ergebnisse wie möglich durch die Standardisierung der Testsitzung (z. B. vor 12 Stunden fasten, klimatisierten Raum, etc.) 44,45 beeinflussen steuern. Wie oben erwähnt, ist die Verwendung von handels R-Wellen-gated Erfassungssoftware und Kantenerkennungssoftware empfohlen vorzuspannen und mögliche Fehler bei der Messung zu minimieren 44,45. Wenn MKS BA beeinträchtigt ist, könnte dies entweder durch die NO-Freisetzung aus dem Endothel beeinträchtigt oder aufgrund eingeschränkter Reaktionsfähigkeit der glatten Gefäßmuskulatur auf dem NO sein. Nitroglycerin sublingual verabreicht wird, um die Reaktionsfähigkeit der glatten steuernMuskelzellschicht durch eine exogene Stickstoffmonoxid-Donor, um zu folgern, dass eine Beeinträchtigung der FMD BA spezifisch auf die Fähigkeit des vaskulären Endothels zu Stickstoffmonoxid 44,45 erzeugen.

Da die Messung einer Geschwindigkeit, sind genaue Messungen sowohl der Distanz und Zeit kritisch. Das Protokoll wir beschrieben haben, ist zu dem in der Framingham-Herzstudie 24 verwendeten Methodik. Verwendung von erhöhten Sättel anstatt einem Maßband verbessert die Genauigkeit der Messung des Abstandes von der suprasternalen Kerbe, um die Oberschenkelarterie, indem sie einen direkten Pfad anstatt Potentialmessung über abdominale Adipositas. Ein klares "Fuß" von einem sauberen Wellenform ist für die Berechnung der Zeitdifferenz von der R-Zacke des EKG auf den Impuls an der Messstelle (siehe Abbildung 2) unbedingt notwendig.

Während alternative Techniken zur Verfügung, um sowohl die endotheliale Funktion und ar bewertenMaterial Steifigkeit, MKS-BA und aPWV sind sowohl in der klinischen Forschung häufig verwendet, da sie nicht-invasiv und auch als Vermittler Ergebnisse etabliert. Darüber hinaus werden sie auch in verschiedenen Populationen validiert sind und unabhängig prädiktiv für kardiovaskuläre Ereignisse und Mortalität 19-26. So können sie als Surrogat-Endpunkte in klinischen Studien, die die Wirksamkeit einer Intervention, um das kardiovaskuläre Risiko in einer bestimmten Population zu reduzieren, wie Patienten mit CKD verwendet werden. Modifikation dieser Verfahren ist nicht erforderlich, insbesondere Patienten mit chronischen Nierenerkrankungen zu untersuchen, verglichen mit anderen Risikopopulationen von CVD.

Es gibt jedoch wichtige Einschränkungen sowohl MKS-BA und aPWV dass Verdienst Diskussion. MKS-BA beurteilt vaskulären endothelialen Funktion eines großen Leitungsarterie (Arteria brachialis), so ist ein Index der mikrovaskulären endothelialen Funktion nicht bieten. Eine separate Technik mit Venenverschluss plethysmgraphie ist besser geeignet, die letztere zu beurteilen. Diese Methode erfordert jedoch Katheterisierung der Arteria brachialis, die mehr invasiv als MKS-BA ist und kann bei Patienten mit CKD kontraindiziert sein. Zusätzlich Messung der FMD BA erfordert langwierige und spezifische Ausbildung, um gut durchgeführt werden. aPWV liefert einen Index der großen elastischen Arteriensteifigkeit, die von der lokalen arteriellen Steifigkeit (wie die Halsschlagader) abweichen. Eine alternative Technik, um arterielle Steifheit zu bewerten ist, um die lokale arterielle Compliance (die Inverse der Steifigkeit) der Halsschlagader zu messen, obwohl dies nicht so weit verbreitet verwendet werden oder mit der klinischen Endpunkte aPWV 13 validiert. Darüber hinaus kann der Beitrag von NO als Determinante der Aorta Steifigkeit durch Gefäßbett 48 variieren. Zuletzt gibt es potenzielle verwechselt, um die Interpretation der beiden BA-und MKS-aPWV, die gemessen und eingestellt werden muss statistisch für gegebenenfalls einschließlich der Grundlinie diameter und Scherrate für MKS-BA 45, und die Herzfrequenz und der Blutdruck für 49 aPWV.

Eine wichtige Überlegung bei der Sammlung von vaskulären Endothelzellen zu minimieren Blut auf den J-Leitungen und die danach auf die Folien, so dass die Endothelzellen mit minimalem roten Blutkörperchen in überlappende Bilder identifiziert werden. Dies kann mit dem Training für die richtige Technik sowie angemessene Wasch bei der Wiederherstellung der Zellen erreicht werden. Bei der Analyse der Objektträger, ist es entscheidend, dass die Fluoreszenz objektiv quantifiziert werden und die Bilder sind klar, ohne viel Hintergrund oder Überschneidungen mit anderen Zellen. Optimierung von Verdünnungen für Färbung und Mikroskopie Technik zur Analyse vor der Analyse der Proben Studie sind Schlüsselschritte. Zu beachten ist, die Zellausbeute dieser Technik ist ~ 600 vaskulären Endothelzellen pro Sammlung, eine unzureichende Menge an Gesamt-mRNA vorhanden, um die Genexpression zu messen, damit unser Sonde einschränkend immunofluorescent Anfärben der Proteine ​​von Interesse.

Zusätzlich zu den Techniken zur Beurteilung der vaskulären oxidativen Stress, Zirkulations oder Urinmarkierungen dargestellt werden verwendet, um oxidativen Stress 12,50 beurteilen. Jedoch können sie weniger reflektierend von der Höhe des oxidativen Stresses spezifischen Pegel des vaskulären Endothels ist. Mit Hilfe dieser Marker in Verbindung mit den vorgestellten Techniken kann die beste Anzeige des Gesamtniveaus der oxidative Stress.

Wir haben einen Überblick über Methoden, die verwendet werden können, um MKS-BA, aPWV und vaskuläre Endothelzellen Protein-Expression zu messen. Diese Verfahren eignen sich sowohl für Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz, sondern auch in anderen Populationen mit einem erhöhten Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen. Gemeinsam bieten sie einen Einblick in den vaskulären endothelialen Dysfunktion, großen elastischen Arteriensteifigkeit und trägt physiologischen Mechanismen, einschließlich oxidativem Stress.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Die Autoren danken Nina Bispham für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (12POST11920023) und den NIH (K23DK088833, K23DK087859) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
J-wire St. Jude 404584 2 per collection
Disposable shorts (MediShorts) Quick Medical 4507
Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem) Cardiovascualr Engineering N/A Includes custom ruler.  An alternate system is the Sphygmocor
Ultrasound G.E. Model: Vivid7 Dimension We use a G.E., but there are many companies and models
Vascular software (Vascular Imager)  Medical Imaging Applications N/A
R-wave trigger box Medical Imaging Applications N/A custom made
Rapid Cuff Inflation System Hokanson Model: Hokanson E20
Forearm blood pressure cuff Hokanson N/A custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder 
HUVECs Invitrogren C-015-5C
Donkey serum Jackson 017-000-121
Pap pen Research Products International 195505
VE Cadherin Abcam ab33168
AF568 Life Technologies A11011 depends on specifications of microscpe 
AF488 Life Technologies A11034 depends on specifications of microscpe 
Nitrotyrosine antibody  Abcam ab7048
NADPH oxidase antibody Upstate 07-001
DAPI  Vector H-1200
Delicate task wipe (Kimwipe)  Fisher Scientific 06-666-A
Plastic paraffin film (parafilm)  Fisher Scientific 13-374-10
Confocal microscope  Olympus Model: FV1000 FCS/RICS many options exist 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Beurteilung der Gefäßfunktion bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung
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Jablonski, K. L., Decker, E.,… More

Jablonski, K. L., Decker, E., Perrenoud, L., Kendrick, J., Chonchol, M., Seals, D. R., Jalal, D. Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease. J. Vis. Exp. (88), e51478, doi:10.3791/51478 (2014).

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