Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Evaluatie van de vaatfunctie bij patiënten met chronische nierziekte

Published: June 16, 2014 doi: 10.3791/51478
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Division of Renal Diseases and Hypertension, University of Colorado, Denver, 2Department of Integrative Physiology, University of Colorado, Boulder

Summary

De mate van vasculaire dysfunctie en bij te dragen fysiologische mechanismen kunnen bij patiënten met chronische nierziekte worden beoordeeld door het meten van de arteria brachialis flow-gemedieerde dilatatie, aorta-pulse wave velocity, en vasculaire endotheliale cel eiwit expressie.

Abstract

Patiënten met chronische nierziekte (CKD) hebben significant verhoogd risico op hart-en vaatziekten (HVZ) in vergelijking met de algemene bevolking, en dit is slechts gedeeltelijk te verklaren door de traditionele CVD risicofactoren. Vasculaire disfunctie is een belangrijke niet-traditionele risicofactor, gekenmerkt door vasculaire endotheliale dysfunctie (meestal beoordeeld als verminderde endotheel-afhankelijke dilatatie [EDD]) en verstijving van de grote elastische arteriën. Terwijl verschillende technieken bestaan ​​om EDD en grote elastische slagader stijfheid, beoordeelt de meest gebruikte zijn armslagader flow-gemedieerde dilatatie (MKZ BA) en aorta pulse wave velocity (aPWV), respectievelijk. Beide invasieve maatregelen van vasculaire dysfunctie onafhankelijke voorspellers van toekomstige cardiovasculaire gebeurtenissen bij patiënten met en zonder nierziekte. Patiënten met CKD tonen zowel een verminderde MKZ BA, en verhoogde aPWV. Hoewel de exacte mechanismen die vasculaire dysfunctie devesnoeit in CKD zijn onvolledig begrepen, verhoogde oxidatieve stress en een verdere verlaging van stikstofmonoxide (NO) biobeschikbaarheid dragen in belangrijke mate. Cellulaire veranderingen oxidatieve stress kan worden beoordeeld door het verzamelen van vasculaire endotheelcellen uit de antecubitale ader en het meten van eiwitexpressie van merkers van oxidatieve stress met immunofluorescentie. Wij bieden hier een bespreking van deze methoden om MKZ BA, aPWV, en vasculaire endotheliale cel eiwit expressie te meten.

Introduction

Chronische nierziekte (CKD) is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid dat epidemische proporties heeft bereikt, waaraan ongeveer 11,5% van de bevolking in de Verenigde Staten alleen 1. Het risico van cardiovasculaire dood of cardiovasculaire gebeurtenis bij patiënten met CKD aanzienlijk verhoogd vergeleken met de algemene bevolking 2-4. Hoewel patiënten met CKD vertonen een hoge prevalentie van traditionele cardiovasculaire risicofactoren, dit verklaart slechts een deel van hun verhoogde incidentie van hart-en vaatziekten (HVZ) 5. Vasculaire disfunctie is een belangrijke niet-traditionele cardiovasculaire risicofactor steeds meer erkenning op het gebied van nefrologie 6-9.

Hoewel veel veranderingen waarschijnlijk bijdragen tot de ontwikkeling van arteriële disfunctie onder de meest zorgwekkende zijn de ontwikkeling van vasculaire endotheliale dysfunctie, meestal beoordeeld als verminderde endotheel-afhankelijke dilatatie (EDD) en verstijving van de large elastische slagaders 10. Verschillende technieken bestaan ​​om EDD en grote elastische slagader stijfheid te beoordelen, maar de meest gebruikte zijn armslagader flow-gemedieerde dilatatie MKZ BA en aorta pulse wave velocity (aPWV), respectievelijk. Een andere veel gebruikte techniek om EDD beoordelen meet onderarm doorbloeding farmacologische middelen zoals acetylcholine middels veneuze occlusie plethysmografie 11,12. Echter, deze methode vereist catheterisatie van de arteria brachialis, dat is meer invasief dan MKZ BA en kan worden gecontra-indiceerd bij patiënten met CKD. Een alternatieve techniek om arteriële stijfheid evalueren is aan de locale arteriële compliantie (het omgekeerde van stijfheid) van de halsslagader te meten, hoewel dit niet zo veel gebruikt of gevalideerd met klinische eindpunten aPWV 13.

Patiënten met CKD tonen zowel een gestoorde MKZ BA 14-16 en verhoogde aorta pulse wave velocity aPWV 13,17,18, zelfs voorafgaand aan dialyse nodig. Belangrijk vanuit een klinisch oogpunt, beide invasieve maatregelen van vasculaire dysfunctie onafhankelijke voorspellers van toekomstige cardiovasculaire gebeurtenissen en mortaliteit zowel bij patiënten met CKD 19-21, alsmede in andere populaties 22-26. Deze technieken kunnen worden toegepast voor het bestuderen van verschillende populaties risico op CVD, waaronder patiënten met CKD.

De exacte mechanismen waardoor arteriële disfunctie ontwikkelt in CKD zijn onvolledig begrepen; echter verminderde stikstofoxide (NO) biobeschikbaarheid is kritisch medewerker 27-30 en een gemeenschappelijk mechanisme van zowel verminderde EDD en verhoogde arteriële stijfheid 10,31. In CKD, is oxidatieve stress verhoogd en draagt ​​bij aan de vermindering van NOx biologische beschikbaarheid 32-34. Oxidatieve stress wordt gedefinieerd als overmatige biobeschikbaarheid van reactive oxygen species (ROS) ten opzichte van de antioxidante verdedigingsmechanismen. Fysiologische stimuli, incLuding inflammatoire signalering promoten oxidant enzymsystemen produceren ROS, zoals superoxide anion (O 2 ● -) (bijvoorbeeld de oxidant enzym NADPH oxidase.) 35. De productie van superoxide leidt uiteindelijk tot minder biologische beschikbaarheid van stikstofoxide (NO).

Erosie biobeschikbaarheid kunnen op hun beurt bijdragen aan de ontwikkeling van CKD, zoals endotheliale dysfunctie is een onafhankelijke voorspeller van incident CKD 36. Dit is consistent met diergegevens aangeeft dat eNOS remming induceert hypertensie (systemische en glomerulaire), glomerulaire ischemie, glomerulosclerose en tubulo-interstitiële schade 37. Inderdaad, verminderde NO biobeschikbaarheid lijkt noodzakelijk voor de ontwikkeling en progressie van experimentele nierziekte die ziekte bij de mens nabootst, hetgeen duidt op een belangrijke rol voor het disfunctioneren van het endotheel in de menselijke CKD 38,39.

Markers van vasculaire oxidatieve stress kan worden beoordeeld in vascular endotheelcellen verzameld uit menselijke proefpersonen, met behulp van een techniek die oorspronkelijk ontwikkeld door Colombo et al.. 40 en gewijzigd Seals et al. 41-43. Met behulp van 2 steriele J-draden, worden de cellen verzameld uit de antecubitale ader, teruggewonnen, vaste, en later positief geïdentificeerd als endotheelcellen en voor de expressie van eiwitten van belang met behulp van immunofluorescentie geanalyseerd.

Wij bieden hier een bespreking van deze methodologie die gebruikt kan worden om a) maatregel MKZ BA; b) meten aPWV; c) meten vasculaire endotheliale cel eiwit expressie van markers van oxidatieve stress. De focus ligt op patiënten met CKD, niet die chronische dialyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de Colorado Multiple Institutional Review Board (COMIRB).

1. Voorbereiding voor testsessie

  1. Deelnemers moeten deze beperkingen volgen voor de meeste nauwkeurige metingen: 12 uur snel uit voedsel en cafeïne, 12 uur terughoudendheid uit te oefenen, 12 uur terughoudendheid van roken, indien van toepassing,> 4 halfwaardetijd terughoudendheid van medicijnen indien mogelijk (misschien niet haalbaar in een bevolking, zoals patiënten CKD), en pre-menopauzale vrouwen moeten worden getest in dagen 1-7 van de menstruele cyclus van hormonale invloeden te minimaliseren.
  2. Bereid 500 ml dissociatie buffer door toevoeging van 2 ml 0,5 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 0,05 g heparine (180 USP eenheden / mg) en 2,5 g runderserumalbumine tot 476,8 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en pH van 7,4. Dit kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele maanden.
  3. Zet op echografie, computer, en de niet-invasieve hemodynamischeWorkstation (NIHem; arteriële stijfheid apparatuur). Sluit de kabels uitvoeren van de echo op de computer R-top trekker doos.

2. Verzamelen en verwerken van vasculaire endotheelcellen

  1. Een getrainde verpleegkundige of arts voert de collectie (stappen 2.2-2.5, 2.7) en een onderzoeker verzamelt en verwerkt de draden (stappen 2.6, 2,8-2,19)
  2. Prep de antecubitale site met een actueel antiseptische, een tourniquet toepassen, lokaliseren ader, en canule met een 18 G katheter. Plaats een heplock adapter op het uiteinde van de IV.
  3. Trek steriele handschoenen en zet steriele gefenestreerde gordijnen op de site.
  4. Plaats 2 J-draden op de gordijnen. Trek de boog van de "J" naar de "J"-vorm afwikkelen van beide draden.
  5. Haal het beschermkapje van de heplock en voeden J-draad in de ader van ongeveer 8 cm. Druk heen en weer een paar keer voordat het verwijderen van de draad. Vermijd grove bloed op de draad.
  6. Gebruik kniptang om de draden te knippen, zodat ze passen in een50 ml conische buis met ~ 30 ml dissociatie buffer
  7. Herhaal stap 2.5 voor de tweede draad.
  8. Herhaal stap 2.6 voor de tweede draad. Terug buis nat laboratorium.
  9. Pak de draden met een pincet en houd de draden binnenzijde van de buis, maar boven de oplossing. Gedurende 10 minuten, gebruik een gemotoriseerde pipetter herhaaldelijk verzamelen de dissociatie buffer van de 50 ml conische buis en laat hem dus het loopt over de lengte van de draden te spoelen en trillen de draden, dan schud het overtollige vocht van de draden in de buis.
  10. Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 400 xg en 4 ° C.
  11. Bereid de formaldehyde-oplossing in folie bedekt buis door het combineren van 100 ml formaldehyde-oplossing + 900 ml PBS.
  12. Verwijder langzaam tube van centrifuge, zet de vacuümpomp, plaats een pipet tip over einde van zuigslang en laat ~ 400 ml in de buis, stofzuigen van de rest zonder de pellet te verstoren.
  13. Dek af met folie en pipet 1 ml formaldehyde-oplossing inde buis om het monster op te lossen. Niet opnieuw in suspensie. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  14. Bereid 8 dia's door middel van etikettering met onderwerp en studiebezoek informatie en het trekken van een ovaal op elk glaasje met een pap pen.
  15. Voeg 15 ml PBS, resuspendeer en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 xg en 4 ° C.
  16. Herhaal stap 2.15, voeg 12 ml PBS, resuspendeer en centrifugeer gedurende 6 minuten bij 400 xg en 4 ° C.
  17. Verwijder langzaam tube van centrifuge, zet de vacuümpomp, plaats een pipet tip over einde van zuigslang en laat ~ 2 ml in de buis, stofzuigen van de rest zonder de pellet te verstoren.
  18. Resuspendeer en pipet gelijkmatig over de 8 dia's in de ovale gebieden.
  19. Plaats in incubator bij 37 ° C gedurende 5 uur en bewaar bij -80 ° C tot aan analyse (monsters goed voor vele jaren).

3. Beoordeling van MKZ BA en aPWV

  1. Heb onderzoeksonderwerp veranderen in besteedbaar shorts en hebben him / haar plat achterover liggen in een rustige, afm, klimaat gecontroleerde ruimte.
  2. Plaats het juiste aantal ECG voor de specifieke ultrageluid en arteriële stijfheid apparaat (de procedure wordt de niet-invasieve hemodynamische Workstation [NIHem] arteriële stijfheid, die 4 elektroden vereist meten) en bloeddrukmanchet op onderwerp.
  3. Na 20 min, beginnen bloeddrukmetingen. Voer minstens 3, en herhaal tot metingen zijn binnen 5 mmHg, rust 2 min. tussen elke meting.
  4. Begin tonometrie door palpatie van de arteria brachialis puls en het plaatsen van de tonometer naar brachialis golfvormen opnemen met behulp van het softwareprogramma.
  5. Herhaal dit voor de radiale, dijbeen en halsslagaders.
  6. Meet de afstand tot elk van deze sites uit de supersternal inkeping met een meetlint (brachialis, radiale en carotis) en aangepaste heerser / remklauw (dijbeen).
  7. Bereken carotis-brachialis, carotis-radiale en carotis-femorale (aPWV) met behulp van het softwareprogramma.
  8. Plaatsonderarm bloeddruk manchet net distaal van het olecranon proces en opnemen ten minste 10 cardiale cycli van de uitgangssituatie armslagader echobeelden en snelheid van de bloedstroom metingen, met een vasculaire software ingesteld op modus te activeren. Een mechanische arm kan worden gebruikt om de ultrasone sonde stabiliseren indien gewenst.
  9. Blaas onderarm bloeddrukmanchet tot 250 mmHg en beginnen timer. Instrueer deelnemer heel stil blijven.
  10. Begin opname snelheden met een vasculaire software ingesteld op modus activeren wanneer de timer leest 04:45. Trigger laat de manchet om 5:00 en verander de ultrageluid om B-mode (diameter) beelden op te nemen als de klok luidt 05:10.
  11. Doorgaan met opnemen tot de klok luidt 07:00.
  12. Record minstens 10 cardiale cycli van de uitgangssituatie armslagader ultrasound beelden met een vasculaire software ingesteld op modus te activeren.
  13. Neem bloeddruk onderwerp. Als systolische bloeddruk> 100 mmHg, plaatst 0,4 mg sublinguaal nitroglycerine onder het onderwerp &# 39; s tong en beginnen met timer, tenzij de patiënt heeft nog een contra-indicatie.
  14. Begin met het opnemen B-mode (beelden diameter) als de klok luidt 03:00 met de vasculaire software ingesteld op de modus te activeren.
  15. Stoppen met opnemen als de klok luidt 08:00.
  16. Monitor bloeddruk tot het terugkeert naar de uitgangswaarde

4. Voorbereiden van humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) controleglaasjes

  1. Grow HUVECs om doorgang 5-6 en ~ 80% confluentie.
  2. Trypsinize met 3 ml trypsine of wat noodzakelijk is voor de schotel / kolf.
  3. Neutraliseer trypsine met een gelijk volume van trypsine neutraliserende oplossing.
  4. Centrifugeer bij 200 xg gedurende ~ 5 minuten en verwijder trypsine en neutraliserende oplossing vacuüm.
  5. Resuspendeer in ~ 10 ml PBS te wassen.
  6. Centrifugeer bij 200 xg ~ 5 minuten. Verwijder PBS.
  7. Verwijder de PBS en vast te stellen in 1800 pi PBS + 200 pi formaldehyde.
  8. Resuspendeer in PBS (~ 10 ml).
  9. Centrifugeer bij 200 xg ~5 min. Verwijder PBS, resuspendeer in een geschikt volume -200 pl per dia.
  10. Store glijbanen bij -80 ° C tot klaar voor analyse (monsters zal goed voor vele jaren).

Kleuring van vasculaire endotheelcellen 5.

  1. Neem schuift uit -80 ° C vriezer en wacht 5 minuten bij kamertemperatuur (deze procedure is voor een partij van 10 dia's, waaronder een HUVEC controle dia).
  2. Veeg overtollig water met een delicate opdracht veeg (denk centrum van dia niet aanraken).
  3. Re-hydrateren de dia's door het toevoegen van veranderde PBS aan elke dia en laat ze gedurende 10 minuten.
  4. Terwijl de dia's staan, bereiden 5% ezel serum en andere oplossingen.
    1. Bereid 5% ezel serum door toevoeging van 300 pi serum ezel 5.700 gl veranderde PBS (tot pH 7,4) gedurende 10 slides (verhoging dit bedrag meer).
    2. Verdun het primaire antilichaam van belang in 1000 ui 5% serum. Bijvoorbeeld, nitrotyrosine en NADPHoxidase (1:300 en 1:1,500) worden gebruikt als markers van oxidatieve stress.
    3. Bereid secundaire AF568 door het verdunnen van 5 ul van AF568 tot 1500 μll van 5% serum.
    4. Bereid VE cadherine door het verdunnen van 2 ui VE cadherine tot 1000 ul 5% serum.
    5. Bereid AF488 door verdunnen 5 pl VE cadherine tot 1000 ul 5% serum.
    6. Houd AF568, VE cadherine en AF488 onder folie door het hele proces en plaats dan op rocker in 4 ° C koelkast tijdens de voorbereiding glijbanen.
  5. Na 10 min van rehydratie, droge dia's met een delicate taak vegen.
  6. Voeg 5% ezel serum gedurende 60 minuten en leg een stuk plastic paraffine folie over het omcirkelde gebied om volledige dekking van de chemische waarborgen.
  7. Gooi de plastic paraffine film en droge dia's met een delicate taak te vegen. Niet wasbaar. Voeg primair antilichaam gedurende 60 minuten en leg een stuk plastic paraffine folie over het omcirkelde gebied om ervoor te zorgenvolledige dekking van de chemische stof.
  8. Gooi de plastic paraffine film, spoelen met gewijzigde PBS uit spuit fles en genieten in dia kolommen voor 5 minuten. Terwijl de dia's worden weken, zet ze in een donkere kamer. Werken in het donker voor alle overige stappen.
  9. Droge dia's met Kimwipes, voeg AF568 (secundair antilichaam) gedurende 45 minuten en leg een stuk plastic paraffine folie over het omcirkelde gebied om volledige dekking van de chemische waarborgen. Dekken tegen licht.
  10. Gooi de plastic paraffine film in de biologisch gevaarlijk afval container. Spoel met gewijzigde PBS uit spuit fles, en dan genieten in kolommen voor 5 minuten.
  11. Droge dia's met Kimwipes, voeg dan VE Cadherine gedurende 60 minuten en leg een stuk plastic paraffine folie over het omcirkelde gebied om volledige dekking van de chemische waarborgen. Dekken tegen licht.
  12. Gooi de plastic paraffine film in de biologisch gevaarlijk afval container. Spoel met gewijzigde PBS uit spuit fles, en dan genieten in kolommen voor 5 minuten.
  13. Droge dia's meteen delicate taak vegen, voeg AF488 30 minuten en leg een stuk plastic paraffine folie over het omcirkelde gebied om volledige dekking van de chemische waarborgen. Dekken tegen licht.
  14. Gooi de plastic paraffine film in de biologisch gevaarlijk afval container. Spoel met gewijzigde PBS uit spuit fles, en dan genieten in kolommen voor 5 minuten.
  15. Droge dia's met een delicate taak af te vegen en laat dia's drogen gedurende 20 minuten. Dekken tegen licht.
  16. Voeg een druppel alleen van fluoroshield montage medium met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool hydrochloride (DAPI) aan elke dia en elk met een dekglas.
  17. Plaats de glaasjes in 4 ° C koelkast afgedekt met folie. Imaging moet worden voltooid binnen 48 uur.

6. Beeldvorming en-analyse van de vasculaire endotheliale cellen

  1. Bereid microscoop voor beeldvorming lood endotheelcellen volgens de specificaties van de specifieke microscoop. Een eenzijdig blinde technicus moet een bepaald eiwit te analyseren voor een vleermuisch van cellen.
  2. Scannen dia's systematisch. Identificeer endotheelcellen door positieve kleuring voor VE Cadherine en bevestig nucleaire integriteit door positieve kleuring voor DAPI.
  3. Afbeelding 30 cellen per glijbaan voor latere analyse. Herhaal dit voor elke dia in het gebrandschilderde partij, met inbegrip van de HUVEC.
  4. Analyseer de intensiteit van de kleuring van het primaire antilichaam van belang met een kwalitatieve software.
  5. Om de mogelijke verstorende effect van verschillen in intensiteit kleuring verschillende kleuring sessies verslag waarden verhouding van eiwitexpressie in de verzamelde endotheelcellen hetzelfde eiwit expressie in de HUVEC minimaliseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MKZ BA wordt gekwantificeerd als de piek verandering in diameter van de slagader volgende reactieve hyperemie. Aldus is de diameter in rust ten opzichte van de diameter na het einde van een 5 min bloeddrukmanchet occlusie periode (figuur 1). Een representatief ultrasone beeld van de arteria brachialis Paneel A toont en Paneel B toont een grafiek van de R-golf gated verandering in diameter van leeglopen van de manchet tot 2 minuten na, zoals verkregen met behulp van commercieel verkrijgbare software. Als de verandering is vaak heel minimaal (In figuur 1 is de verandering is 4.8%), kunnen kleine verschillen in de grote impact hebben op de resultaten. Gebruik van commercieel beschikbare geautomatiseerde edge detectie software is sterk aanbevolen om vertekening en potentiële fouten zo klein mogelijk in de meting 44,45. Als stimulans voor dilatatie tijdens reactieve hyperemie verschillen tussen groepen of omstandigheden worden vergeleken, moeten afschuifsnelheid worden berekend volgens de Doppler bloedstroomsnelheden, en MKZ BA moet worden gecorrigeerd voor verschillen indien van toepassing 46,47.

aPWV wordt berekend met minimale operator inbreng van de meeste commercieel beschikbare systemen, waaronder NIHem gebruikt in het onderzoek. De R-golf van het ECG wordt vergeleken met "voet" van de golfvorm op een bepaalde plaats en het tijdsverschil berekend (figuur 2) van de halsslagader (Panel A) en de femorale arterie (Panel B). De afstandsmetingen worden gebruikt in combinatie met de tijdsverschillen een snelheid berekenen. aPWV betreft snelheid tussen de halsslagader om de femorale slagader (dwz. langs de aorta).

Immunofluorescentie analyse van vasculaire endotheliale cellen cellulaire bewijs van het niveau van oxidatieve stress verschaffen. Ter compensatie van verschillen in kleurintensiteit tussen kleuring sessies het niveau van fluorescentie van een bepaald eiwit voor elke individuele patiënt (vertegenwoordiger ima ges getoond in figuur 3 Paneel A) wordt vergeleken met de fluorescentie van de HUVEC regelschuif (vertegenwoordiger afbeeldingen in Figuur 3 weergegeven Panel B). Zo kunnen verschillen in eiwit expressie worden vergeleken, hetzij tussen groepen of over aandoeningen (bijvoorbeeld tijdens een interventiestudie).

Figuur 1
Figuur 1. Vertegenwoordiger basislijn armslagader diameter verkregen tijdens de evaluatie van de arteria brachialis flow-gemedieerde dilatatie (MKZ BA). A) Bij een patiënt met chronische nierziekte (CKD). B) R-golf gated verandering in diameter van manchet release 2 min. volgende grafisch weergegeven, zoals verkregen met behulp van commercieel verkrijgbare software.target = "_blank"> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Representatieve resultaten print-out van de beoordeling van aPWV bij een patiënt met CKD. A) vertraging tussen de R-golf van het ECG om de voet van de halsslagader, B) vertraging tussen de R-golf van het ECG om de voet van de femorale arterie (tfoot), bedekt met de halsslagader golfvorm. Beide panelen tonen ook de ingevoerde afstanden van de suprasternal inkeping aan de respectieve locaties (voorgesteld door de letter D, in cm). De berekende aPWV waarde wordt getoond in paneel B (vertegenwoordigd door de letters PWV, in cm / sec). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. </ P>

Figuur 3
Figuur 3. Vertegenwoordiger beelden van eiwit expressie. A) DAPI (nucleaire integriteit, blauw), VE Cadherine (positieve endotheelcellen identificatie; groen) de oxidant enzym NADPH oxidase (eiwit van belang; rode) uit cellen verzameld uit een patiënt met CKD B) en voor een humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) controleglaasje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het verkrijgen van nauwkeurige resultaten voor MKZ BA en aPWV vereist het verwerven van ultrasound beelden van uitstekende kwaliteit en de druk golfvormen, respectievelijk. Centraal in dit passend en voortgezette opleiding en het gebruik van elke techniek door de exploitant 44. Bovendien is het essentieel om controle zo veel externe variabelen die de resultaten mogelijk kunnen beïnvloeden door normalisatie van de testsessie (bijv. eerdere 12 uur vasten, klimaatkamer, enz.) 44,45. Zoals hierboven vermeld, is het gebruik van commercieel R-golf gated acquisitie software en edge-detectie software ten zeerste aanbevolen om vertekening en potentiële fouten zo klein mogelijk in de meting 44,45. Wanneer MKZ BA is aangetast, kan dit hetzij als gevolg van erosie vrijlating uit het endotheel of als gevolg van verminderde responsiviteit van de vasculaire gladde spieren om de NO vrijgegeven. Sublinguale nitroglycerine wordt toegediend om te controleren voor de responsiviteit van de gladdespiercellen laag om een exogeen stikstofoxide donor, om te concluderen dat een stoornis in MKZ BA specifiek is voor het vermogen van het vasculaire endotheel stikstofoxide 44,45 produceren.

Aangezien de meting een snelheid nauwkeurige metingen van zowel de afstand en tijd kritisch. De techniek die we hebben beschreven is het gebruikt in de Framingham Heart Study 24 methode. Gebruik van verhoogde remklauwen in plaats van een meetlint verbetert de nauwkeurigheid van de meting van de afstand tot de suprasternal inkeping aan de liesslagader door het nemen van een directe weg in plaats van potentiële meet dan abdominale obesitas. Een duidelijke "voet" van schoon golfvorm is absoluut noodzakelijk voor de berekening van het tijdsverschil van de R-golf van het ECG de impuls op de meetplaats (zie figuur 2).

Terwijl de alternatieve technieken zijn beschikbaar voor zowel endotheelfunctie en ar beoordelenteriaal stijfheid, MKZ BA en aPWV zijn beide vaak gebruikt in klinisch onderzoek omdat het om niet-invasieve en goed ingeburgerd als tussenpersoon uitkomsten. Bovendien zijn zij goed gevalideerd in verschillende populaties en onafhankelijk vooruitlopend van cardiovasculaire gebeurtenissen en mortaliteit 19-26. Aldus kunnen ze worden gebruikt als surrogaat eindpunten in klinische studies welke de werkzaamheid van een interventie cardiovasculaire risico te verminderen in een bepaalde populatie, zoals patiënten met CKD. Wijziging van deze technieken behoeven niet specifiek bestuderen patiënten met CKD, in vergelijking met andere populaties risico op CVD.

Er zijn echter belangrijke beperkingen aan zowel MKZ BA en aPWV die verdienste discussie. MKZ BA beoordeelt vasculaire endotheliale functie van een grote leiding slagader (de brachiale slagader), laat dus geen index van microvasculaire endotheliale functie. Een aparte techniek met veneuze afsluiting plethysmography beter aan laatstgenoemde beoordelen. Echter, deze methode vereist catheterisatie van de arteria brachialis, dat is meer invasief dan MKZ BA en kan worden gecontra-indiceerd bij patiënten met CKD. Daarnaast meten van MKZ BA vereist een langdurig en specifieke opleiding om goed te worden uitgevoerd. aPWV geeft een index van grote elastische slagader stijfheid, die kan verschillen van lokale arteriële stijfheid (zoals de halsslagader). Een alternatieve techniek om arteriële stijfheid evalueren is aan de locale arteriële compliantie (het omgekeerde van stijfheid) van de halsslagader te meten, hoewel dit niet zo veel gebruikt of gevalideerd met klinische eindpunten aPWV 13. Bovendien kan de bijdrage van NO als determinant van aorta stijfheid variëren vaatbed 48. Laatste, zijn er potentiële verwart met de interpretatie van zowel de MKZ BA en aPWV dat hoeft te worden gemeten en statistisch gecorrigeerd voor zover van toepassing, met inbegrip van basislijn diameter en afschuifsnelheid voor MKZ BA 45, en de hartslag en bloeddruk voor aPWV 49.

Een belangrijke overweging bij de verzameling van vasculaire endotheelcellen wordt geminimaliseerd bloed op de J-draden en vervolgens op de dia, zodat de endotheelcellen kan worden geïdentificeerd met minimale rode bloedcellen in overlappende beelden. Dit kan met de opleiding voor de juiste techniek en adequate was bij het herstellen van de cellen. Bij het analyseren van de dia's, is het essentieel dat fluorescentie objectief kan worden gekwantificeerd en de beelden zijn duidelijk, zonder veel achtergrond of overlap met andere cellen. Optimalisatie van verdunningen voor het kleuren en techniek voor microscopie analyse voorafgaand aan de analyse van de studie monsters zijn belangrijke stappen. Opmerkelijk is de cel opbrengst van deze techniek is ~ 600 vasculaire endotheelcellen per verzameling, een onvoldoende hoeveelheid totaal mRNA beschikbaar voor genexpressie, waardoor beperkt onze probe immunofluorescentie kleuring van eiwitten van belang.

Naast de technieken die voor de beoordeling van vasculaire oxidatieve stress, circulerende urine markers kunnen worden gebruikt om oxidatieve stress 12,50 beoordelen. Zij kunnen echter minder reflecterend van het niveau van oxidatieve stress specifiek niveau van het vasculaire endotheel. Met behulp van deze markers in combinatie met de gepresenteerde technieken kunnen de beste indicatie van het algemene niveau van oxidatieve stress te bieden.

We hebben een overzicht van methoden die kunnen worden gebruikt om MKZ BA, aPWV en vasculaire endotheelcellen eiwitexpressie meten ontvangen. Deze technieken zijn niet alleen geschikt voor patiënten met CKD, maar ook in andere populaties met een verhoogd risico van cardiovasculaire ziekte. Gezamenlijk bieden ze inzicht in de vasculaire endotheliale dysfunctie, grote elastische slagader stijfheid, en het bijdragen fysiologische mechanismen, waaronder oxidatieve stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

De auteurs danken Nina Bispham voor haar technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (12POST11920023), en de NIH (K23DK088833, K23DK087859).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
J-wire St. Jude 404584 2 per collection
Disposable shorts (MediShorts) Quick Medical 4507
Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem) Cardiovascualr Engineering N/A Includes custom ruler.  An alternate system is the Sphygmocor
Ultrasound G.E. Model: Vivid7 Dimension We use a G.E., but there are many companies and models
Vascular software (Vascular Imager)  Medical Imaging Applications N/A
R-wave trigger box Medical Imaging Applications N/A custom made
Rapid Cuff Inflation System Hokanson Model: Hokanson E20
Forearm blood pressure cuff Hokanson N/A custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder 
HUVECs Invitrogren C-015-5C
Donkey serum Jackson 017-000-121
Pap pen Research Products International 195505
VE Cadherin Abcam ab33168
AF568 Life Technologies A11011 depends on specifications of microscpe 
AF488 Life Technologies A11034 depends on specifications of microscpe 
Nitrotyrosine antibody  Abcam ab7048
NADPH oxidase antibody Upstate 07-001
DAPI  Vector H-1200
Delicate task wipe (Kimwipe)  Fisher Scientific 06-666-A
Plastic paraffin film (parafilm)  Fisher Scientific 13-374-10
Confocal microscope  Olympus Model: FV1000 FCS/RICS many options exist 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levey, A. S., et al. A new equation to estimate glomerular filtration rate. Ann Intern Med. 150, 604-612 (2009).
  2. Foley, R. N., Parfrey, P. S., Sarnak, M. J. Epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. J Am Soc Nephrol. 9, (1998).
  3. Parfrey, P. S., Harnett, J. D. Cardiac disease in chronic uremia. Pathophysiology and clinical epidemiology. Asaio J. 40, 121-129 (1994).
  4. Schiffrin, E. L., Lipman, M. L., Mann, J. F. Chronic kidney disease: effects on the cardiovascular system. Circulation. 116, 85-97 (2007).
  5. Sarnak, M. J., et al. Cardiovascular disease risk factors in chronic renal insufficiency. Clin Nephrol. 57, 327-335 (2002).
  6. Kendrick, J., Chonchol, M. B. Nontraditional risk factors for cardiovascular disease in patients with chronic kidney disease. Nat Clin Pract Nephrol. 4, 672-681 (2008).
  7. Bellasi, A., Ferramosca, E., Ratti, C. Arterial stiffness in chronic kidney disease: the usefulness of a marker of vascular damage. Int J Nephrol. 2011, (2011).
  8. vander Zee, S., Baber, U., Elmariah, S., Winston, J., Fuster, V. Cardiovascular risk factors in patients with chronic kidney disease. Nat Rev Cardiol. 6, 580-589 (2009).
  9. Malyszko, J. Mechanism of endothelial dysfunction in chronic kidney disease. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 411, 1412-1420 (2010).
  10. Lakatta, E. G., Levy, D. Arterial and cardiac aging: major shareholders in cardiovascular disease enterprises: Part I: aging arteries: a "set up" for vascular disease. Circulation. 107, 139-146 (2003).
  11. Seals, D. R., Jablonski, K. L., Donato, A. J. Aging and vascular endothelial function in humans. Clin Sci (Lond). 120, 357-375 (2011).
  12. Jablonski, K. L., et al. Dietary sodium restriction reverses vascular endothelial dysfunction in middle-aged/older adults with moderately elevated systolic blood pressure. J Am Coll Cardiol. 61, 335-343 (2013).
  13. Briet, M., et al. Arterial stiffness and enlargement in mild-to-moderate chronic kidney disease. Kidney Int. 69, 350-357 (2006).
  14. Thambyrajah, J., et al. Abnormalities of endothelial function in patients with predialysis renal failure. Heart. 83, 205-209 (2000).
  15. Ghiadoni, L., et al. Effect of acute blood pressure reduction on endothelial function in the brachial artery of patients with essential hypertension. J Hypertens. 19, 547-551 (2001).
  16. Yilmaz, M. I., et al. The determinants of endothelial dysfunction in CKD: oxidative stress and asymmetric dimethylarginine. Am J Kidney Dis. 47, 42-50 (2006).
  17. Wang, M. C., Tsai, W. C., Chen, J. Y., Huang, J. J. Stepwise increase in arterial stiffness corresponding with the stages of chronic kidney disease. Am J Kidney Dis. 45, 494-501 (2005).
  18. Shinohara, K., et al. Arterial stiffness in predialysis patients with uremia. Kidney Int. 65, 936-943 (2004).
  19. Karras, A., et al. Large artery stiffening and remodeling are independently associated with all-cause mortality and cardiovascular events in chronic kidney disease. Hypertension. 60, 1451-1457 (2012).
  20. Pannier, B., Guerin, A. P., Marchais, S. J., Safar, M. E., London, G. M. Stiffness of capacitive and conduit arteries: prognostic significance for end-stage renal disease patients. Hypertension. 45, 592-596 (2005).
  21. Yilmaz, M. I., et al. Vascular health, systemic inflammation and progressive reduction in kidney function; clinical determinants and impact on cardiovascular outcomes. Neprhol Dial Transplant. 26, 3537-3543 (2011).
  22. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated aortic pulse wave velocity, a marker of arterial stiffness, predicts cardiovascular events in well-functioning older adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  23. Tanaka, H., DeSouza, C. A., Seals, D. R. Absence of age-related increase in central arterial stiffness in physically active women. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18, 127-132 (1998).
  24. Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events: the Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  25. Yeboah, J., Crouse, J. R., Hsu, F. C., Burke, G. L., Herrington, D. M. Brachial flow-mediated dilation predicts incident cardiovascular events in older adults: the Cardiovascular Health Study. Circulation. 115, 2390-2397 (2007).
  26. Shechter, M., et al. Long-term association of brachial artery flow-mediated vasodilation and cardiovascular events in middle-aged subjects with no apparent heart disease. Int J Cardiol. 134, 52-58 (2009).
  27. Baylis, C. Nitric oxide deficiency in chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 294, (2008).
  28. Wever, R., et al. Nitric oxide production is reduced in patients with chronic renal failure. Arterioscler Thromb Vasc. 19, 1168-1172 (1999).
  29. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. J Am Soc Nephrol. 15, 1983-1992 (2004).
  30. Hasdan, G., et al. Endothelial dysfunction and hypertension in 5/6 nephrectomized rats are mediated by vascular superoxide. Kidney Int. 61, 586-590 (2002).
  31. Chue, C. D., Townend, J. N., Steeds, R. P., Ferro, C. J. Arterial stiffness in chronic kidney disease: causes and consequences. Heart. 96, 817-823 (2010).
  32. Dupont, J. J., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. Ascorbic acid or L-arginine improves cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. J Appl Physiol. 111, (2011).
  33. Oberg, B. P., et al. Increased prevalence of oxidant stress and inflammation in patients with moderate to severe chronic kidney disease. Kidney Int. 65, 1009-1016 (2004).
  34. Cachofeiro, V., et al. Oxidative stress and inflammation, a link between chronic kidney disease and cardiovascular disease. Kidney Int Suppl. (111), (2008).
  35. Vila, E., Salaices, M. Cytokines and vascular reactivity in resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, (2005).
  36. Perticone, F., et al. Endothelial dysfunction and subsequent decline in glomerular filtration rate in hypertensive patients. Circulation. 122, 379-384 (2010).
  37. Zatz, R., Baylis, C. Chronic nitric oxide inhibition model six years on. Hypertension. 32, 958-964 (1998).
  38. Nakagawa, T., Johnson, R. J. Endothelial nitric oxide synthase. Contrib Nephrol. 170, 93-101 (2011).
  39. Muller, V., Tain, Y. L., Croker, B., Baylis, C. Chronic nitric oxide deficiency and progression of kidney disease after renal mass reduction in the C57Bl6 mouse. Am J Nephrol. 32, 575-580 (2010).
  40. Colombo, P. C., et al. Biopsy coupled to quantitative immunofluorescence: a new method to study the human vascular endothelium. J Appl Physiol. 92, 1331-1338 (2002).
  41. Donato, A. J., Black, A. D., Jablonski, K. L., Gano, L. B., Seals, D. R. Aging is associated with greater nuclear NFkappaB, reduced IkappaBalpha, and increased expression of proinflammatory cytokines in vascular endothelial cells of healthy humans. Aging Cell. 7, 805-812 (2008).
  42. Donato, A. J., et al. Direct evidence of endothelial oxidative stress with aging in humans: relation to impaired endothelium-dependent dilation and upregulation of nuclear factor-kappaB. Circ Res. 100, 1659-1666 (2007).
  43. Jablonski, K. L., Chonchol, M., Pierce, G. L., Walker, A. E., Seals, D. R. 25-Hydroxyvitamin D deficiency is associated with inflammation-linked vascular endothelial dysfunction in middle-aged and older adults. Hypertension. 57, 63-69 (2011).
  44. Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
  45. Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S. Ultrasound assessment of flow-mediated dilation. Hypertension. 55, 1075-1085 (2010).
  46. Donald, A. E., et al. Methodological approaches to optimize reproducibility and power in clinical studies of flow-mediated dilation. J Am Coll Cardiol. 51, 1959-1964 (2008).
  47. Widlansky, M. E. Shear stress and flow-mediated dilation: all shear responses are not created equally. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 296, (2009).
  48. Stewart, A. D., Millasseau, S. C., Kearney, M. T., Ritter, J. M., Chowienczyk, P. J. Effects of inhibition of basal nitric oxide synthesis on carotid-femoral pulse wave velocity and augmentation index in humans. Hypertension. 42, 915-918 (2003).
  49. Lantelme, P., Mestre, C., Lievre, M., Gressard, A., Milon, H. Heart rate: an important confounder of pulse wave velocity assessment. Hypertension. 39, 1083-1087 (2002).
  50. Jablonski, K. L., Seals, D. R., Eskurza, I., Monahan, K. D., Donato, A. J. High-dose ascorbic acid infusion abolishes chronic vasoconstriction and restores resting leg blood flow in healthy older men. J Appl Physiol. 103, 1715-1721 (2007).

Tags

Geneeskunde chronische nierziekte endotheelcellen flow-gemedieerde dilatatie immunofluorescentie oxidatieve stress pulse-wave velocity
Evaluatie van de vaatfunctie bij patiënten met chronische nierziekte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jablonski, K. L., Decker, E.,… More

Jablonski, K. L., Decker, E., Perrenoud, L., Kendrick, J., Chonchol, M., Seals, D. R., Jalal, D. Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease. J. Vis. Exp. (88), e51478, doi:10.3791/51478 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter