Introduction
Processen med clathrin-medieret endocytose (CME) er afhængig af den vel-timede ankomst af de mange komponenter i clathrin-medieret endocytiske maskiner at samle gods og manipulere plasmamembranen i vesiklerne 1-3. CME initieres ved membran deformere og fragt-adapter proteiner, der kommer sammen på spirende steder endocytose 1. Disse proteiner rekruttere kappeprotein clathrin, som samler i en bur-lignende struktur, der danner clathrin-coated pit (CCP) 4. Når CCP er samlet i en kugleform, membran spaltning, primært gennem indsats af det store GTPase, dynamin, genererer gratis clathrin-coatede vesikler (CCVS) 5,6. Denne internalisering udløser hurtig afmontering af clathrin frakke, så komponenter, der skal genbruges til flere runder af CME.
Opdagelsen og karakterisering af de involverede i CME-proteiner er blevet forankret i traditionel Biochemical, genetiske og mikroskopiteknikker 4-6,8. Disse analyser har belyst roller og interaktion punkter i disse endocytiske komponenter. Selvom meget nyttige til at fastlægge væsentlige dele af maskiner menneskehandel, er disse analyser stærkt begrænset i at opfange dynamiske opførsel CME komponenter eller koncentration last. Dette er et kritisk begrænsning, idet CME drives af koreograferede samling af sæt af protein moduler i definerede trin, og da små ændringer i dynamikken i enkelte endocytiske begivenheder kan have store kumulative konsekvenser for endocytose. Endvidere seneste data viser, at enkelte CCP'er kan variere både i sammensætning og i adfærd, hvilket tyder på, at den fysiologiske regulering af denne proces er yderst rumligt og tidsligt begrænset 9-14. Visualisere individuelle endocytiske begivenheder, derfor er vigtigt at forstå, hvorfor der er flere overflødige proteiner involveret i CME, og hvordan disse proteiner kan styres By fysiologiske signaler at regulere last internalisering.
Her beskriver vi brugen af total intern refleksion Fluorescens mikroskopi (TIRFM) for at observere CME på niveauet af dynamikken i de enkelte CCP'er i levende celler. TIRFM afhængig af forskellen i brydningsindeks mellem dækglas og det flydende celler 15,16. Når excitationslys er rettet mod cellerne ved mere end den kritiske vinkel, er det internt reflekteret, hvilket skaber en kortvarig bølge, der opretholder et tyndt område af belysning strækker ca. 100 nm over dækglasset. Dette sikrer, at kun de fluorescerende molekyler inden for dette snævre område er spændt. I praksis tillader dette excitation af fluorescerende molekyler på eller i nærheden af plasmamembranen, og minimerer fluorescens fra de indre dele af cellen. Dette giver en signifikant højere signal-støj-forholdet og z-aksen beslutning at visualisere events på plasmamembranen, compared til mere almindeligt anvendte transportformer såsom konventionel epifluorescens eller konfokal fluorescens mikroskopi. Vi beskriver også, ved en indledende og praktisk niveau, at anvendelsen af et almindeligt anvendt billedanalyse platform analysere og kvantificere simple morfologiske træk og dynamikken i de enkelte last endocytiske begivenheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Angivelse af Fluorescerende Tagged CME Komponenter i dyrkede celler
HEK293 celler er nyttig model celler, der er blevet brugt i udstrakt grad til at studere GPCR biologi og endocytose, og derfor anvendes som modeller i denne protokol. Brug en transfektionsprotokol giver en ensartet udtryk uden overekspression og lav cytotoksicitet.
- Håndtere alle cellekultur i en steril laminær strømning. Fyld 4 brønde i en plade med 12 brønde med 1 ml Dulbeccos modificerede essentielle medier (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS). Fra et sammenflydende T25 kolbe HEK293-celler fortyndet 1:50, 01:25, 01:16, 01:10 henholdsvis til hver af de fire brønde.
- Alternativt frø celler til en multi-brønds plade af den ønskede størrelse, ifølge producentens anvisninger. Seed 0,4-2 x 10 4 celler i en 12-brønds plade. Dyrk cellerne natten over i et sterilt 37 ° C med 5% CO2 og 95% fugtighed.
BEMÆRK: I betragtning af, at væksten rAtes varierer afhængigt af de betingelser og cellelinjer, kan det være at foretrække, at frø af flere brønde for at sikre ideel konfluens til transfektion næste dag eller mulighed for at udføre transfektioner i to eksemplarer.
- Alternativt frø celler til en multi-brønds plade af den ønskede størrelse, ifølge producentens anvisninger. Seed 0,4-2 x 10 4 celler i en 12-brønds plade. Dyrk cellerne natten over i et sterilt 37 ° C med 5% CO2 og 95% fugtighed.
- Den næste morgen, vælge en brønd, der er ~ 70% sammenflydende til transfektion (se figur 1B). Hvis der ikke godt har nået denne tilstand, skal du vente en anden dag.
BEMÆRK: 70% konfluens er ideel til HEK293 celler. Transfektion af celler, der er mere sparsomme resultater i celledød og toksicitet. Transfektion i konfluente celler resulterer i dårlig ekspression. - Tilføj 60 pi buffer EF (fra transfektion kit) 400 ng plasmider, der koder mærkede GPCR'er og / eller komponenter af clathrin maskiner, og 2,4 pi Enhancer ind i 1,5 ml mikrocentrifugerør, som beskrevet i producentens protokol. Vortex 2 sek for at sikre tilstrækkelig blanding, og spin i en mikrofuge ved 2.000 xg i 2 sekunder for at opsamle væsken ved bunden.
- Tilføj6 pi Effectene som beskrevet i producentens protokol. Vortex i 2 sekunder, og centrifugering ved 2.000 x g i 2 sekunder i en mikrocentrifuge for at opsamle væsken ved bunden. Vent i 20 minutter for at tillade dannelse af transfektionsreagenser komplekse miceller.
- Aspirer medier fra brønden, der skal transficeres. Forsigtigt tilsættes 0,8 ml DMEM med 10% FBS til transfektionsreagens blandingen og blandes ved pipettering op og ned langsomt at reducere bryde micellerne. Tilsæt medier og transfektion blanding til brønden meget langsomt fra siden. Tilføj resterende transfektion blandingen fra mikrocentrifugerøret til brønden ved hjælp af en mikropipette.
BEMÆRK: Eventuelt tilføje ekstra 0,5 ml DMEM med 10% FBS til den transficerede godt at give cellerne ekstra næring resulterer i blidere transfektion og lavere forbigående ekspression. - Retur cellerne til 37 ° C inkubator i 5 timer.
- Aspirer medier indeholdende transfektionsblandingen. Udskift med 1 ml DMEM med 10% FBS. Tilladcellerne til at vokse natten over.
- Den næste dag, passerer cellerne til coatede dækglas, der tidligere er steriliseret ved autoklavering.
- Tilsæt 0,5 ml phosphatpufret saltopløsning (PBS) med 1 mM EDTA til hver brønd. Alternativt kan du bruge 0,5 ml 0,05% trypsin-EDTA. Lad i inkubatoren i 1 min.
- Placer 3 runde, sterile 25 mm dækglas i separate brønde i en 6-brønds plade. Fyld hver brønd med 2 ml medier. Skub forsigtigt dækglasset ned til bunden af brønden for at forhindre celler i at vokse på bunden af dækglasset.
- Agitere manuelt godt at løfte cellerne fra bunden af brønden. Der tilsættes 1 ml DMEM med 10% FBS at resuspendere. Fordel de løftede celler fra 1 brønd i en plade med 12 brønde ligeligt mellem de 3 dækglas. Alternativt plade celler på 3 glasbund retter.
- Lad cellerne til at vokse på dækglassene i mindst 48 timer før billeddannelse. Sørg for, at cellerne er spredt ud og flad.
2.Imaging CCP og Cargo Dynamics Brug TIRFM
- Konjugat M1 anti-FLAG-antistoffer med Alexa-farvestoffer hjælp Alexa Fluor Protein Labeling kit ifølge fremstilling protokol. Alternativt kan præ-konjugerede antistoffer købes.
- Præinkuberes cellerne med antistofferne i en 1: 1000 fortynding i 1 ml forvarmet Leibovitz medium med 10% FBS, eller Opti-MEM med 50 mM HEPES, pH 7,4, og 10% FBS i 10 min ved 37 ° C (billeddannelse medium), at mærke FLAG-mærkede GPCR'er på celleoverfladen. Springe disse trin, hvis genetisk indkodede fluorescerende proteiner, såsom GFP, anvendes som tags (se diskussionen for detaljer).
- Overfør dækglasset til en live-cell imaging kammer. Alternativt til glas-bund retter, aspiratprøver antistof-mærkning af medier og tilsæt 700 ul forvarmet billeddannende medium.
- Brug en pincet og bøj spidsen af en 25 gauge nål i en krog.
- Hold en pincet i den dominerende hånd. Hold bøjet nål i othis. Drej nålen, indtil krogen kurver ned mod glasset. Træk forsigtigt nålen, krogen nedad, på tværs af bunden af en 6-brønds plade, indtil det kroge på dækglasset. Pas på ikke at ridse overfladen på dækglasset, da det vil frigøre celler. Forsigtigt løfte dækglasset op fra bunden af brønden. Balance dækglasset mod væggen af godt for støtte.
- Brug pincet til at gribe nær kanten af dækglasset og flytte dækglasset celle opad til billedbehandling kammer, og samle kammeret. Tilføj 700 ul (eller passende mængde) i forvarmet billeddannende medium. Håndter dækglas forsigtigt, uden pres for at forhindre revner eller brud.
- Overfør kammeret på mikroskop og holde temperaturen af cellerne ved 37 ° C under anvendelse af en scene varmelegeme eller en lukket inkubator.
- Bring celler i fokus ved hjælp af en 100X eller 60X TIRF olieimmersionsobjektiv (1,45 NA eller ovenfor). Billede cellerne i konventionel epifluorescens eller confokale former for belysning (dvs. ikke TIRFM) for at identificere celler, der udtrykker de relevante konstruktioner. Out-of-fokus celler er næsten usynlige i den tynde dybde TIRF belysning gør det svært at finde brændplanet og celler.
Bemærk: Nogle systemer bruger de samme lasere til TIRFM til billedet i konventionel epifluorescens, ved at flytte indfaldsvinklen af laseren over den kritiske vinkel. Som en vigtig sikkerhedsforanstaltning, altid være opmærksom på vinklen af laserstrålen, og altid lede det væk fra iagttageren. - Fokus ned til den nederste overflade af en udtrykkende celle indtil omridset af plasmamembranen omkring cellen forsvinder, og centrum af cellen vises. Dette er mest tydeligt med en plasmamembran lokaliseret last protein, såsom μ-opioid-receptor (se figur 2A).
- Skift til TIRF billeddannelse.
- Hvis der anvendes de samme lasere til billeddannelse i konventionelt epifluorescens øge indfaldsvinklen aflaser indtil ud-af-fokus fluorescens i cellens indre forsvinder, og ingen skitse plasmamembran omkring cellen ses. (Sammenlign figur 2C til figur 2A og 2B)
BEMÆRK: I TIRFM, flytte brændplanet får billedet til at gå helt ud af fokus og / eller dæmpet, og de overordnede niveauer af fluorescens mindskes som følge af den mindre dybde af belysning. Derfor, at en alternativ metode skifte til TIRFM belysning er først at fokusere på midten af cellen i konfokal / konventionel epifluorescens, og derefter hæve indfaldsvinklen indtil du taber det meste af fluorescens, og derefter fokusere ned til plasmamembranen. - Når du er i TIRFM, sikre excitation laser reflekterer tilbage gennem mål, og er ikke synlig over mål. Bekræft dette ved at undersøge, om laserpunktet er synlig.
BEMÆRK: I konventionelle epifluorescens eller konfokale tilstande, laser belysning er synlig over målet,såsom på loftet. - Forfine fokus for at få et skarpt billede. De vigtigste komponenter i endocytiske maskiner, såsom clathrin, vil være synlig i puncta. Juster fokus på fine, så puncta er så runde som muligt.
BEMÆRK: membran-lokaliserede fragt, justere finfokuseringen indtil filopodia synes forskellige. - Brug en erhvervelse program til at gemme alle de billeddannende parametre såsom spejle og TIRF vinkel. Gør dette for alle nødvendige bølgelængder.
- Hvis der anvendes de samme lasere til billeddannelse i konventionelt epifluorescens øge indfaldsvinklen aflaser indtil ud-af-fokus fluorescens i cellens indre forsvinder, og ingen skitse plasmamembran omkring cellen ses. (Sammenlign figur 2C til figur 2A og 2B)
- Scan omkring dækglasset for at finde celler, der udtrykker alle de ønskede endocytiske markører: den μ-opioid-receptoren og adapter β-arrestin i vist i figur 3A eksempel. Vælg celler, der udtrykker, men ikke over-udtrykkende. Se diskussionen for detaljer.
- Når celler identificeres erhverve billeder hver 3 sek i 10 min. Dette er tilstrækkeligt til at fange den levetid en CCP, da den gennemsnitlige levetid for en CCP i HEK293 celler afbildes under disse betingelser er around 40 sek 10-11. Dette giver omkring 12-14 frames at observere CCP. For eksempel se Movie 1. Gentag alle trin til billedet yderligere celler.
3. Analyse af Endocytic Dynamics ved manuel bekræftelse
Selvom en manuel kontrol af CCP livstider er stærkt begrænset af antallet af CCP'er, der kan registreres, er det stadig en præcis metode til påvisning ufortrødent med globale ændringer i billedet og afsløring artefakter. Se diskussionen for detaljer.
- Åbn filen i ImageJ. Billeder gemmes som en enkelt stak af TIFF-filer med sammenflettede kanaler. Konvertere billeder til hyperstacks. Gå til Image> Hyperstacks> stakken for at Hyperstack. Indtast antallet af kanaler, der er erhvervet (dvs. hvis billeddannende β-arrestin og μ-opioid receptor, tast 2), indtast 1 for z stak (TIRFM er et enkelt plan), og antallet af frames i filmen (dvs. en 10 min film på 1 ramme hver 3 sek Is 200) i pop-up vindue.
- Den hyperstack formatet giver et vindue med to rullepaneler. Brug den øverste bjælke til at bevæge sig gennem de kanaler, og bunden til at bevæge sig gennem tiden. Rulle til den kanal af protein, hvis liv vil blive analyseret.
- Flyt til ramme 10 eller 15 af filmen for at reducere optagelsen af allerede eksisterende CCP'er, hvis hele varigheder er ikke synlige. Tegn en ROI boks omkring en plet tilfældigt valgt.
- Tæl antallet af rammer en plet er synlig.
BEMÆRK: Se figur 3B og 3C for eksempler på tre morfologiske kategorier af endocytiske begivenheder 10,11,16-19.
4. Analyse af Endocytic Dynamics af mål Anerkendelse
Formål anerkendelse muliggør påvisning af næsten alle de afbildede CCPer i en celle, men kan være tilbøjelige til fejl på grund af falsk detektering af fejlagtige strukturer. Se diskussionen for detaljer vejer fordele og ulemper ved each metode. Flere programmer, herunder specialbyggede algoritmer, kan anvendes til objektivt at påvise CCP'er. Denne protokol beskriver objektiv anerkendelse af CCP'er anvender Imaris, et billede-analyse software (se Materialer).
- Til at begynde, skal du åbne den rå billedfil i billede-analyse software. Som standard vises en fusioneret farvebillede. Brug "Display Adjustment" vinduet for at justere lysstyrken på en kanal. Klik på navnet på en kanal for at ændre den viste farve. Fjern markeringen i feltet ud for den kanal, for at forhindre dens display (se figur 4A).
- Opret "Steder" ved at klikke på ikonet med orange pletter. Se figur 4B. Vælg et område af interesse (ROI) omkring cellen. Se figur 4C. Brug en ROI til at udelukke områder, der fejlagtigt registrerer lyse forkanter og plaques. Analyser flere celler med forskellige ekspressionsniveauer separat.
- Mål diameteren af et sted at bestemde første skøn for algoritmen. Skift til "Udsnit" mode, og klik på polære ender af et sted at måle dens diameter. Se figur 4E. Gør dette for 4 eller 5 runde pletter, der ser tegn på en CCP på højden af sin stabilitet, efter dannelse og før opdeling. Brug disse målinger til at beregne gennemsnitlig diameter ned til nærmeste tiendedel mikrometer.
- Detect Steder. Retur til "Surpass" mode. Vælg den rette kanal til detektion. Indtast den gennemsnitlige målte diameter, sædvanligvis 0,3 eller 0,4 um. Klik på den blå pil-frem at kvantificere Steder. Se figur 4E. Hvis diameteren Steder er undervurderet, vil falske punkter fluorescens identificeres som Steder. Hvis diameteren er for stor, vil sande Steder blive ignoreret. Ved tvivl, anslår en lille smule lavere, og filtrere de forkerte detektioner senere.
- Filtrer Steder efter Kvalitet. Juster filteret til at fange så mange steder som muligt uden rygjorden. Quality valgt filter som standard 20. Se figur 4F.
- Brug "Kvalitet" kurve som en guide til at fastsætte en passende tærskel. Flyt den nederste grænse af filteret med venstre museknap for at denne første dukkert i kurven. Det er et godt udgangspunkt for filteret, da denne position sædvanligvis forfiner påvisning kun synlige pletter. Se figur 4F.
- Fundne pletter på filmen som kugler eller center pixels. Brug fanebladet "Farver", justere farven af pletterne på en kontrasterende farve for at gøre det lettere at se dem. Rul gennem filmen at gennemgå de steder i hver ramme. Målet er at opdage så mange steder som muligt for hele deres levetid.
- Eliminer dimmer Steder eller manuelt at tilslutte dem i kontinuerlige spor senere, da de ikke er opdaget godt gennem løbet af deres levetid.
- Fjern lyse plaques med et "Intensitet" filter, hvis det kræves. Klik på det grønne plustegn for at tilføje et nyt filter. Se figur 4F. Opret en Intensitet filter til at filtrere ind eller ud Steder af en given fluorescenssignaler. Brug den genererede Intensitet kurven (svarende til Kvalitet Curve diskuteres i 4.5) for at indstille tærsklen. Brug venstre museknap til at fjerne det yderste venstre ende af kurven, der repræsenterer de dygtigste Steder.
BEMÆRK: Store plaque strukturer er normalt blandt de lyseste elementer i cellen, og de er let udelukket med dette filter. - Rul gennem filmen at sikre, at CCP'er påvises som pletter og de lyseste plaques ikke længere detekteres. Figur 3D viser en celle, hvor påvisning af CCP'er (forsynet med hvide kugler) blev optimeret med kvaliteten filter og plaques blev udelukket med kvaliteten filteret.
- Reducer lyse celle kanter med kvaliteten filteret. Stadig skal fjernes manuelt, på det næste trin lyse objekter. Fortsæt med den blåpil.
- Fjern afvigende Spots i skærmen Steder Rediger. Skift til "Vælg" mode. Klik på stedet. Det bliver gul. Klik på "Slet". Klik på den blå pil for at fortsætte med at bygge algoritmen. Se figur 4G.
- Mål spor. Sæt spor til "Brownsk bevægelse". CCP'en bør ikke udvise nogen rettet bevægelse, kun minimal drivende over plasmamembranen. Denne algoritme er mest hensigtsmæssigt for at bevægelse. Se figur 4H.
- Indstil Max Afstand til en lille værdi som 0,7 um. Se figur 4H.
Bemærk: Indstilling af en lille afstand minimerer tilslutning af tilstødende steder og stadig giver mulighed for fortsat at spore en celle plet gennem CCP eller celle bevægelse. - Set Max Gap Størrelse til 1. Dette giver en vej til at fortsætte, hvis der kun er én ramme mangler i træk. Klik på den blå pil til at beregne spor. Se figur 4H.
BEMÆRK: Gap størrelser af mere end 3 årsager forskellige spor at være forkert koblet sammen. - Skift spor visning til "Dragon Tail". Rul gennem filmen observere kvalitet detektion. Hvis tilstødende Steder bliver tilsluttet, mindske Max Afstand under 0,7 um. Hvis Steder bliver brudt op for hurtigt, øge Max Gap størrelse. Klik på den blå pil til at skabe spor. Dette fører til skærmbilledet filter spor. Se figur 4H.
- Indstil Max Afstand til en lille værdi som 0,7 um. Se figur 4H.
- Filter tracks og eksportere data. Brug en "Intensitet" filter til at fjerne yderligere lyse plaques. Brug en "Displacement" filter til at fjerne endosomer som trænger ind i TIRF felt. Udvis forsigtighed, da længere Steder vil få længere forskydninger så godt. Klik på den grønne dobbeltpil at færdiggøre protokollen. Se figur 4I.
- Brug fanen Rediger tracks, med ikonet blyant, til at fjerne falske positive påvisninger af Spor, der ikke kunne fjernes ved filtre. Check for discontinuities eller falske forbindelser. Hvis du vil tilslutte to spor, skal du vælge dem med Ctrl-venstre-klik, klik derefter på "Connect" i boksen Rediger Numre. For at afbryde spor i separate pletter, skal du vælge et spor og tryk på "Afbryd". Vælg flere Steder med Ctrl + Venstre-klik, og klik på "Connect" for at oprette et nyt spor. Metoden er den samme for redigering Steder, der er beskrevet i 4.5.7. Se figur 4J.
- At eksportere data, gå til fanen statistik. Klik på enkelt ikon diskette til at eksportere den valgte statistik. Klik på ikonet, der ligner en serie af disketter at eksportere alle statistikker. Den "Lyt Varighed" statistik indeholder længden af de endocytiske spor. Se figur 4K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af levende celle TIRF Mikroskopi vi har optaget endocytiske dynamik μ-opioid-receptoren (MOR), en G-protein-koblet receptor (GPCR) og endocytisk adapter protein β-arrestin. Den β-arrestin-konstruktion blev transient transficeret ind i en stabilt udtrykker MOR cellelinje under anvendelse af protokollen beskrevet i figur 1, og afbildes 96 timer senere. MOR i den stabile cellelinje er N-terminalt mærket med en pH-følsom GFP. Dette fluorescerende protein kun fluorescerer i den neutrale ekstracellulære væske. Også kun MOR endocytoses engang aktiveres af en agonist, og forbliver ellers jævnt fordelt over plasmamembranen. Fokus på det vedhængende plasmamembranen, der sidder på låget-glas i konfokale tilstand resulterer i en celle, der er udfyldt med en dim fluorescens. Dette er forskelligt fra en fokusering på midten af cellen, hvor plasmamembranen kun ses som en ring af fluorescens omkring cellen. Sammenlign venstreog højre paneler i figur 2A. Skift til konventionel epifluorescens eller TIRF med en forkert vinkel bevirker ud af fokus fluorescens at blive synlige i de samme celler som vist i figur 2B. Når TIRF vinkel er korrekt plasmamembranen er meget skarpe, klare og lyse og ud af fokus fluorescens ikke længere forstyrrer billedet. Sammenlign figur 2C til fig 2A og 2B.
Billedet er klart og skarpt, fordi MOR er på klæbende plasmamembran, hvilket stort set inden for TIRF området. I modsætning hertil forbliver β-arrestin i en cytosolisk pulje, når endnu ikke rekrutteret til endocytiske puncta og synes uklar og ude af fokus, fordi det ikke er i TIRF område. Når MOR aktiveres af en agonist, er β-arrestin rekrutteret til plasmamembranen, og begge β-arrestin og receptoren omfordele CCP'er (figur 3A og Movie 1 , Β-arrestin i grøn, MOR i rød, overlay er gul).
Levetider af disse klynger kan kvantificeres manuelt ved hjælp af tre parametre for afsluttet endocytose som vist i figur 3B. Pletterne betegner CCP'er kan enten forsvinde helt (se også figur 3C), "blinke" til og fra eller "klemme off" en større struktur. De to sidstnævnte betingelser udgør begivenheder, der er rumligt for tæt på hinanden, der skal løses som separate hændelser. Spot detekteringsalgoritme i Imaris er også nyttigt til at kvantificere CCP'er, som skitseret i figur 4. Figur 3D betegner CCP'er detekteres ved anvendelse af Imaris, efter filtrering for at fjerne ikke-dynamiske plaque strukturer. Overlejret hvide kugler betegne opdaget pletter. Dimmer pletter, der ikke kunne påvises for hele deres levetid blev også udelukket med "Kvalitet"-filter.
">
Figur 1: Diagram af transfektionsprocedure. (A) For det første frø forskellige fortyndinger (1:50, 1:25, 1:16, 1:10) på en 12-brønds plade. Tillad celler til at vokse natten over. Den næste dag, kigge efter en brønd, der er omkring 70% sammenflydende, og jævnt fordelt, som afbildet. Dette er godt, der vil blive transficeret. (B) Tilsæt 60 ul EF-buffer og 400 ng DNA i et mikrocentrifugerør. Vortex i 10 sek og spin væsken til bunden af røret. Tilføj 2.4 pi Enhancer. Vortex i 2 sekunder og spin væsken til bunden af røret. Inkuber ved stuetemperatur i 3 minutter. Tilsæt 6 ul Effectene. Vortex i 2 sekunder og spin væsken til bunden af røret. Inkuber ved stuetemperatur i 20 min. (C) langsomt blandes 0,8 ml DMEM med 10% FBS med transfektion. Tilføj til celler i tidligere valgte godt. Cellerne inkuberes i 5 timer ved 37 ° C. Erstat med friskDMEM med 10% FBS.
Figur 2: at finde den TIRFM området. (A) plasmamembranen afbildet i konfokal. Det venstre panel viser celler i konfokal med fokus på midten af cellen. Plasmamembranen kun ses som en "ring" omkring cellen. Fokusering ned til den basale plasmamembran, der støder op til dækglasset forårsager cellen, der skal udfyldes med en dim fluorescens. Plasmamembranen "ring" må ikke være synlige i den tyndere TIRF felt. (B) Den basale plasma-membran med en fladere TIRF vinkel producerer konventionel epifluorescensbelysning gennem prøven. Dette belyser hele cellen og meget ude af fokus fluorescens fra toppen af cellen er til stede. (C) at plasmamembranen i TIRF. Fokus på filopodia hjælper med at finde denne planet. Bemærk, at det eren glat enkelt plan. Skalapanelerne er 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Visualisering og Kvantificering endocytisk begivenheder i TIRF. (A) en celle, der udtrykker den μ-opioid-receptor (MOR) og β-arrestin før og efter tilsætning af en agonist, der inducerer endocytose. Agonisten bevirker omfordeling af begge proteiner til endocytiske puncta. Målestokken er 10 um. (B) Tre typer af endocytiske begivenheder, set ved at visualisere arrestinpositive dynamik, i overensstemmelse med tidligere beskrevne morfologier. "Steady", en konstant signal, der hurtigt forsvinder. Dette er den vigtigste type, hvilket indikerer, at CCP'en har okulerede og forlod TIRF felt. "Blinke", et signal, der blinker til et lavere signal og igen på det samme sted som følge af montering af en anden CCP på det samme sted. "Knib off", en rørformet fremspring kommer ud et sted, hvor to CCP'er er for tæt på hinanden til at blive løst som adskilte pletter, og en endocytoseres. Boksen er 2 x 2 um. (C) Visualisere clathrin endocytose af MOR på enkelt-begivenhed opløsning. To eksempler, der repræsenterer den største del af MOR endocytiske hændelser vises. Rammer er hver 3 sek. Boksen er 2 x 2 um. (D) sporing af individuelle endocytiske begivenheder ved hjælp af Imaris. Hvide kugler betegne CCP'er detekteret som Steder. Spot afsløring blev optimeret ved hjælp af et "Kvalitet"-filter. Dimmer pletter, der ikke kunne påvises for hele deres levetid blev også udelukket med kvaliteten filteret. Store plak strukturer, der er vist som værende uopdaget blev udeladt ved hjælp af en "Intensitet" filter.ig3large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Mål Anerkendelse af dynamikken i endocytisk begivenheder ved hjælp Imaris. (A) Justering af display-vinduet, bruges til at justere visningen af billedet som beskrevet i trin 4.1. (B) Åbning af "Steder" algoritme bygherre. Bygherren vises i vinduet nedenfor. (C) Det første trin af pletterne algoritme bygherre. Check "Spor Steder (over tid)." Check "Segment kun et område af interesse," hvis det er nødvendigt. Skærm (D) valg ROI. Se Trin 4.2 for yderligere oplysninger. (E) De mange vinduer, der er nødvendige for at definere diameteren af en målt Spot. Paneler repræsenterer: skifte fra Surpass til Slice tilstand ved hjælp af Navigelse Bar på toppen, klikke på de polære ender et sted, hvor den målte diameter vises typisk på den yderste højre side, hvor man kan indtaste den målte diameter. Se trin 4,3-4,4. (F) plet Kvalitet Filter beskrevet i 4.5-4.5.3. (G) Rediger pletter vindue beskrevet i 4.5.7. (H) måler spor og har set spor vinduer, der er beskrevet i 4.6. (I) Filter Tracks vindue er beskrevet i 4.7. (J) Rediger spor vindue beskrevet i 4.7.1. (K) Gem data skærmbillede, som beskrevet i 4.7.2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi brugen af TIRFM at visualisere clathrin endocytose (CME) på niveau med enkelte CCP'er i levende celler i realtid. CME er en hurtig og meget dynamisk begivenhed medieret af den kumulative virkning af mange rumligt og tidsligt adskilte enkelte arrangementer. De fleste analyser, der i øjeblikket bruges, såsom biokemiske målinger af internalisering ved hjælp af overflade biotinylering eller ligand binding, flow-cytometri eller fikserede celler assays måler mængden af internaliserede proteiner eller elektronmikroskopisk lokalisering af proteiner, overvåge ensemble ændringer i protein-lokalisering til faste tidspunkter . De eksisterende metoder har været meget nyttige til at identificere proteiner, der er nødvendige for CME, men mangler den rumlige og tidsmæssige opløsning, der matcher de fysiologiske skalaer CME eller andre processer dynamisk membran menneskehandel. Dette er vigtigt, da nye oplysninger tyder på, at CCP'er er heterogene i deres proteinsammensætning og dynamik 9-12, og som CME sandsynligvis hurtigt reguleres i et rumligt diskret måde. Levende celler TIRFM giver mulighed for at analysere CME på niveau med rumligt adskilt enkelt CCP'er i realtid, i levende celler.
Vellykket anvendelse af denne kraftfulde analyse bygger på to vigtige faktorer: godt helbred af cellerne og grundig analyse af de parametre CME. For den førstnævnte, ordentlig udtryk af mærkede proteiner og mikroskopiteknikker minimerer fototoxicitet er kritiske. Cellelinjer stabilt-udtrykkende proteinerne af interesse er ideel, da ekspressionsniveauerne kan skønnes pålideligt. Vi tagge receptorerne med enten N-terminale Flag epitop eller SPH-tags 21-25. Selv om det ikke er strengt nødvendigt, begge mærkningssystemer lette TIRFM CME fordi receptorer selektivt kan detekteres på plasmamembranen ved starten af forsøget. De ønskede yderligere endocytiske bestanddele kan også transficeres forbigående ind i disse stabile cellelinier. Transfection protokol her bemærkes er optimeret til billeddannelse CME hjælp TIRFM. For det første er det skræddersyet til selv og moderate niveauer af ekspression. Dårlig udtryk nødvendiggør højere laser magt til påvisning og øger risikoen for både fototoksicitet og fotoblegning. Yderligere, da dette assay registrerer forsvinden puncta som internaliserede CCP'er lave signaler og fotoblegning er også skadelige for analyse. Vi foreslår, at under disse omstændigheder, den samlede varighed og / eller hyppigheden af billeddannelse reduceres. Andet kort inkubation af transfektionsreagenser på cellerne, intervallet mellem transfektion og eksperiment, og det friske passage af transficerede celler på dækglas før billeddannelse, alle sikre, at de afbildede celler er i optimal sundhed. For det tredje, dette sikrer, at størstedelen af clathrin strukturer er CCP'er, og ikke flade plader af clathrin eller clathrin plaques. For det fjerde, denne protokol minimerer overekspression af transficerede CME komponenter, som har været udstillingn til at ændre CME dynamik 20,26.
Til billeddannelse med lav fototoksicitet, er det vigtigt at optimere imaging system for optimal opløsning og maksimal følsomhed. Forstørrelsen af målet og kameraet detektor størrelse bør modsvares at minimere under- eller oversampling og tom forstørrelse. En høj numerisk apertur (1,45 eller derover) TIRF mål bør bruges til at indsamle den maksimale lys muligt. Vi optage billeder med en elektron-multiplicere ladningskoblet kamera til høj kvante effektivitet, eksponeringstider lave, og hurtig udlæsning hastigheder. Derudover, for at sikre sundhed af cellerne, er de afbildes i Leibovitz medier, som er pufret uafhængigt af CO 2, og er suppleret med 10% FBS, i et lukket kammer indstillet til 37 ° C. Fordi TIRFM er meget følsom, og de høje mål blændetal anvendte kan afsløre selv minimale omgivende lys, er det vigtigt at skabe et lukket billedbehandlingsmiljø gratisfra ekstern lys og vibrationer, der kan forstyrre den fine fokalplan.
Det er vigtigt at bemærke, at de absolutte levetider og dynamikken i de fleste dele af CME varierer stærkt afhængigt af celletyper, ekspressionsniveauer af proteiner, temperatur, dage efter udpladning og andre variationer i dyrkningsbetingelser 7,10,14,17,20, 25,27. Dette afspejles i de store variationer i de frister og fordelinger observeret mellem forskellige grupper, der benytter denne teknik, en klar begrænsning af denne analyse. Endvidere er det muligt at CCP'er på den nederste overflade af cellen, afbildes i TIRFM, opfører sig forskelligt fra den øverste overflade 23,25. Selv om det kan diskuteres, hvilken overflade præcist udgør en "typisk" celle omgivet af ekstracellulære matrixkomponenter i et væv, fortolkninger af CCP dynamik set af denne teknik nødt til at overveje dette potentiale forskel. Den sande styrke af assayet, ligger derfor i at sammenligne ændringer i dynamics af CCP'er, i de samme celler under identiske dyrkningsbetingelser, efter akutte manipulationer, herunder gruppering af lastmolekyler såsom GPCR'er i respons på aktivering. Denne sammenligning giver mulighed for normalisering af ændringerne i samme celle, derved at styre for alle de ovennævnte, der kan fremkalde variationer i CCP adfærd parametre.
Vi anvender typisk både manuelle og automatiserede analyser, der er beskrevet ovenfor, til at analysere varigheden af endocytiske begivenheder: manuel kontrol og objektiv indregning ved brug af Imaris billede analyse software. Manuel kontrol er laborato- og tidskrævende, da det er begrænset af antallet af CCP'er en bruger kan tælle, men det er nok den mest præcise teknik til rådighed. En uddannet menneskelige øje kan nemt fortsætte med at spore en CCP gennem celle bevægelse, og ændringer i form eller fokus, nøjagtigt undtagen plaques og defekte pixels. Det kan også opdage morfologiske ændringer i CCP indikerer afsluttet eveNTS, som vist er 3B og 3C. Det er bydende nødvendigt, dog, at analysen bliver objektiv som muligt inden for disse begrænsninger. Dette kræver definitionen af specifikke kriterier, der anvendes konsekvent på tværs af alle datasæt. Desuden har vi typisk analysere billeder i en dobbelt-blind måde, hvor billedet navne er krypteret, således at betingelserne forbliver ukendte for den person, analysere billederne. Automatiseret påvisning, fx ved hjælp af "Steder" og "Lyt Varighed" algoritmer i Imaris, kan bruges til at registrere de fleste af de endocytiske pletter i en given film, genererer et højt antal stikprøver. Mens mange muligheder, herunder meget komplicerede skræddersyede algoritmer 3,14,23,26,27, der bliver genereret, pålideligheden af disse metoder opdage korrekte endocytiske begivenheder samtidig undgå falske afsløring stadig den største bekymring. For eksempel i Imaris, cellebevægelse skabe lyse forkanter, plader, og ud affokusrammer kan let kaste spot-detekteringsalgoritme, da det har en tendens til at detektere lyse strukturer er sammensat fuldstændigt af pletter. For at undgå, at disse steder bliver forbundet i et spor, skal de alle fjernes. Single afvigende Steder, der ikke er i store strukturer såsom plaques kan fjernes med Rediger pletter fane, mens Steder forbundet kan fjernes senere med fanen Rediger Tracks. De afvigende pletter kan også fjernes med brugerdefinerede filtre. For eksempel, figur 3D viser en intensitet filter, der anvendes til at begrænse undgå herunder plaques i CCP detektion. Quality filter er en anden meget nyttig filter til at slette fejlagtige pletter. "Kvalitet" er en kumulativ måling af lysstyrke og form findes ved at tage fluorescensintensiteten på stedet og gaussisk filtrering med ¾ af længden af stedet radius på 20. Quality kurven er fundet under de valgte filtre. Det viser antallet af pletter (y) detekteresnår kvaliteten er en vis værdi (x). Jo lavere kvalitet, flere pletter detekteret. Hvis kvaliteten filteret er for lav, vil pletterne detekteres, når der er ingen synlig fluorescens omvendt, hvis kvaliteten filteret er for høj, er det kun de lyseste pletter vil blive registreret. Følg langs kurve mod højere værdier (x); antallet af pletter detekteret (y) vil typisk falde drastisk. Flyt nederste grænse til dette punkt. Dette er den mindste punkt at placere bunden tærskel. Andre større bidragydere til falske pletter i TIRF felt er endosomer der flytter til periferien af cellen og ind i TIRF felt. En robust kriterium for at fjerne disse er mobilitet pletter, dvs forskydning af pletter over tid. CCP'er bevæge sig meget lidt, medmindre som en del af bevægelsen af hele cellen, mens endosomer udviser hurtig Brownske eller rettet bevægelse. Nyere algoritmer, mens væsentligt forbedret, stadig bliver forfinet og optimeret 3,14,23,26,27. Da disse opfyldthods bliver mere sofistikerede og pålidelige, kan vi analysere hundredvis eller tusindvis af pletter, uden manuelt at kontrollere dem ved hvert punkt. I øjeblikket dog foreslår vi, at disse to analyser bruges sammen til at supplere hinanden for nøjagtighed.
Protokollen vi har beskrevet kan let tilpasses til at besvare mange spørgsmål vedrørende fragt endocytose. Det kan bruges til at udføre simple co-lokalisering af laster med CME-komponenter, og bruges til at vise ændringer på specifikke dele af endocytiske maskiner på grund bestemte stimuli. Den analyse kan også nemt tilpasses til enhver endocytisk proces, såsom caveolae 28, der viser diskrete koncentrationer af fragt og pels komponenter, og til studiet af disse grundlæggende processer i specialiserede celletyper. I fremtiden som genom-redigering bliver mere mainstream 20,29,30, forventer vi, at det vil blive den foretrukne metode til tagging komponenter, og at dynamikken og adfærd of forskellige komponenter vil blive finjusteret yderligere. I betragtning af at vores forståelse af cellulære processer er i høj grad drevet af identifikation af gener, protein modifikationer og interactomes, analysen beskrev vi her repræsenterer en af de kommende grænser undersøgelsesudvalg, nemlig. definitionen af spatiotemporale dynamik i disse processer og mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 mm coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
- Ungewickell, E., Branton, D.
- Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
- Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
- Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
- Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
- Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
- Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
- Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
- Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
- Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
- Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
- Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
- Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
- Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
- Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
- Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
- Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
- Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
- Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
- Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G.
- Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
- Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
