Introduction
Processen att clathrin medierad endocytos (CME) är beroende av läglig ankomst av de många komponenterna i clathrin medierad endocytiska maskiner för att samla last och manipulera plasmamembranet i vesiklarna 1-3. CME initieras av membran deformerar och last adaptorproteiner som kommer tillsammans vid begynnande platser av endocytos 1. Dessa proteiner rekrytera pälsen protein clathrin, som sätter ihop i en bur-liknande struktur som bildar clathrin belagda grop (KKP) 4. När KKP är helt monteras till en sfärisk form, membran splittring, främst genom åtgärder av det stora GTPase, dynamin, genererar fria clathrin belagda vesiklar (CCVS) 5,6. Denna interna utlöser en snabb demontering av clathrin päls, vilket gör komponenter som ska återanvändas för flera omgångar av CME.
Upptäckten och karakterisering av de proteiner som är involverade i CME har sina rötter i traditionell Biochemical, genetiska och mikroskopitekniker 4-6,8. Dessa analyser har klar roller och interaktionspunkter dessa endocytic komponenter. Även mycket användbart för att definiera viktiga komponenter för människohandel maskiner, är dessa analyser starkt begränsad i att fånga det dynamiska beteendet hos CME komponenter eller last koncentration. Detta är en kritisk begränsning, eftersom CME drivs av koreograferad montering av uppsättningar av protein moduler i definierade steg, och eftersom små förändringar i dynamiken i enskilda endocytic händelser kan få stora kumulativa konsekvenser för endocytos. Vidare senaste uppgifterna tyder på att enskilda centrala motparter kan skilja både sammansättning och beteende, vilket tyder på att den fysiologiska regleringen av denna process är mycket rumsligt och tidsmässigt begränsade 9-14. Visualisera enskilda endocytic händelser är därför viktigt att förstå varför det finns flera redundanta proteiner involverade i CME och hur dessa proteiner kan styras by fysiologiska signaler för att reglera last intemalisering.
Här beskriver vi användningen av total intern reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM) att observera CME på nivån för dynamiken i enskilda centrala motparter i levande celler. TIRFM förlitar sig på skillnaden i brytningsindex mellan glastäckglas och den vätskemiljö av celler 15,16. När excitationsljus riktas mot cellerna vid mer än den kritiska vinkeln, det reflekteras internt, vilket skapar en evanescent våg som upprätthåller ett tunt område av belysning sträcker sig ungefär 100 nm ovanför täckglas. Detta säkerställer att endast de fluorescerande molekyler inom denna smala område är glada. Praktiskt, medger detta att excitation av fluorescerande molekyler på eller nära plasmamembranet, och minimerar fluorescens från de inre delarna av cellen. Detta tillhandahåller ett signifikant högre signal-till-brusförhållande och z-axeln upplösning för att visualisera händelser på plasmamembranet, compared till mer vanligen använda lägen som konventionell epifluorescens eller konfokal fluorescensmikroskopi. Vi beskriver också, till introduktions och praktisk nivå, till användning av ett vanligt förekommande bildanalysplattform analysera och kvantifiera enkla morfologiska egenskaper och dynamik enskilda last endocytic händelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Redovisning av fluorescerande taggade CME Komponenter i odlade celler
HEK293 celler är användbara modell celler som har använts i stor omfattning för att studera GPCR biologi och endocytos och därför används som modeller i detta protokoll. Använd någon transfektionsprotokoll ger enhetligt uttryck utan överuttryck och låg cytotoxicitet.
- Hantera alla cellodling i en steril laminärt flöde huva. Fyll fyra brunnar i en 12-brunnsplatta med en ml Dulbeccos Modified Essential Media (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS). Från ett sammanflytande T25 kolv med HEK293 celler späd 1:50, 1:25, 1:16, 1:10 respektive i var och en av de fyra brunnarna.
- Alternativt ympa celler till en multi-brunnplatta av önskad storlek, enligt tillverkarens instruktioner. Seed 0,4-2 x 10 4 celler i en 12-brunnar. Odla cellerna över natten i en steril 37 ° C med 5% CO2 och 95% fuktighet.
OBS: Med tanke på att tillväxten rates varierar beroende på de villkor och cellinjer, kan det vara att föredra att ympa flera brunnar för att garantera perfekt sammanflyt för transfektion nästa dag eller möjligheten att utföra transfektioner i två exemplar.
- Alternativt ympa celler till en multi-brunnplatta av önskad storlek, enligt tillverkarens instruktioner. Seed 0,4-2 x 10 4 celler i en 12-brunnar. Odla cellerna över natten i en steril 37 ° C med 5% CO2 och 95% fuktighet.
- Nästa morgon, väljer en brunn som är ~ 70% sammanflytande för transfektion (se Figur 1B). Om ingen väl har nått detta tillstånd, vänta en dag.
OBS: 70% konfluens är idealisk för HEK293-celler. Transfektera celler som är mer glesa resultat i celldöd och toxicitet. Transfektering översammanflytande celler resulterar i dålig uttryck. - Lägg 60 | il buffert EG (från transfektion kit), 400 ng av plasmiderna som kodar tagged GPCR och / eller komponenter i clathrin maskineriet och 2,4 | il av Enhancer in i 1,5 ml mikrocentrifugrör, såsom beskrivs i tillverkarens protokoll. Vortexa i 2 sek för att säkerställa tillräcklig blandning, och snurra i en mikrofug vid 2000 xg under 2 sek för att samla upp vätska vid botten.
- Lägg6 pl Effectene som beskrivs i tillverkarens protokoll. Vortex 2 sekunder, och snurra vid 2000 xg under 2 sekunder i en mikro att samla upp vätskan i botten. Vänta 20 min för att medge bildning av transfektion komplexa miceller.
- Aspirera media från brunnen som ska transfekteras. Försiktigt till 0,8 ml DMEM med 10% FBS till transfektion reagensblandningen och blanda genom att pipettera upp och ned långsamt för att minska bryta micellema. Lägg media och transfektionsblandningen till brunnen mycket långsamt från sidan. Lägg eventuellt återstående transfektionsblandning från mikrocentrifugrör till brunnen med hjälp av en mikropipett.
OBS: Eventuellt extra till 0,5 ml DMEM med 10% FBS till transfekterade väl för att ge cellerna extra näring som resulterar i mjukare transfektion och lägre gående uttryck. - Återgå cellerna till 37 ° C inkubator under 5 tim.
- Aspirera media innehållande transfektionsblandningen. Ersätt med 1 ml DMEM med 10% FBS. Tillåtcellerna att växa över natten.
- Nästa dag, passerar cellerna att obelagda täckglas, som tidigare steriliserats genom autoklavering.
- Lägg 0,5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 1 mM EDTA till varje brunn. Alternativt kan du använda 0,5 ml 0,05% trypsin-EDTA. Låt i inkubatorn under 1 min.
- Placera 3 runda, sterila 25 mm täckglas i separata brunnar i en 6-brunnar. Fyll varje brunn med 2 ml media. Tryck försiktigt täck ner till botten av brunnen för att förhindra att celler från att växa på undersidan av täckglaset.
- Agitera manuellt brunnen för att lyfta bort cellerna från botten av brunnen. Tillsätt 1 ml DMEM med 10% FBS att resuspendera. Fördela de lyfta cellerna från 1 brunn på en 12-brunnar jämnt bland de 3 täckglas. Alternativt, tallrik celler på 3 glasbottnade rätter.
- Låt cellerna att växa på täckglas i minst 48 timmar innan avbildning. Se till att cellerna är utspridda och platt.
2.Imaging CCP och Cargo Dynamics Använda TIRFM
- Konjugat M1 anti-FLAG-antikroppar med Alexa-färgämnen med hjälp av Alexa Fluor Protein Labeling kit enligt tillverkarens protokoll. Alternativt kan för-konjugerade antikroppar köpas.
- Pre-inkubera cellerna med antikropparna vid en 1: 1000 utspädning i 1 ml förvärmda Leibovitz-medium med 10% FBS, eller Opti-MEM med 50 mM HEPES pH 7,4 och 10% FBS under 10 minuter vid 37 ° C (imaging medium), för att märka FLAG-märkt GPCR på cellytan. Hoppa dessa steg om genetiskt kodade fluorescerande proteiner, såsom GFP, används som taggar (se diskussion för detaljer).
- Överför täckglas till en live-cell imaging kammaren. Alternativt, för glas botten rätter, aspirat antikropps märkning media och tillsätt 700 l av förvärmda bildalstringsmedium.
- Använd en pincett och böj spetsen av en 25 gauge nål i en krok.
- Håll en pincett i den dominerande handen. Håll den böjda nålen i other. Vrid nålen tills haken kurvorna ner mot glaset. Dra försiktigt nålen, kroksidan nedåt, längst ner på en 6-brunnar tills den hakar på täckglas. Var noga med att inte skrapa på ytan av täckglas, eftersom det kommer att lossna celler. Lyft försiktigt täck upp från botten av brunnen. Balansera täck mot väggen i brunnen för support.
- Använd pincett för att ta tag nära kanten av täckglaset och flytta täckcellsidan upp till avbildning kammaren, och montera kammaren. Lägg 700 l (eller lämplig mängd) förvärmda bildalstringsmedium. Hantera täckglasen försiktigt utan tryck för att förhindra sprickbildning eller brott.
- Överför kammaren på mikroskop och hålla temperaturen av cellerna vid 37 ° C med användning av en scen värmare eller en innesluten inkubator.
- Ta med celler i fokus med hjälp av en 100X eller 60X TIRF oljeimmersionsobjektiv (1,45 NA eller högre). Bild cellerna i konventionella epifluorescens eller konbrännsätt belysning (dvs. inte TIRFM) för att identifiera celler som uttrycker lämpliga konstruktioner. Out-of-fokus celler är nästan osynlig i den tunna djupet av TIRF belysning gör det svårt att hitta fokalplanet och celler.
OBS: Vissa system använder samma laser för TIRFM till bild i konventionell epifluorescens, genom att flytta infallsvinkel lasern över den kritiska vinkeln. Som en viktig säkerhetsåtgärd, alltid medveten om vinkeln på laserstrålen, och alltid rikta den bort från betraktaren. - Fokus ner till bottenytan av en uttryckande cell till konturerna av plasmamembranet kring cellen försvinner och centrum av cellen visas. Detta är tydligast med en plasmamembran lokaliserad last protein såsom μ-opioid receptorn (se figur 2A).
- Växla till TIRF avbildning.
- Om du använder samma laser för avbildning i konventionell epifluorescens, öka infallsvinkel pålasern tills ur-fokus-fluorescens i det inre av cellen försvinner, och ingen beskrivning av plasmamembranet kring cellen ses. (Jämför figur 2C till figurerna 2A och 2B)
OBS: I TIRFM, flytta fokalplanet gör att bilden för att gå helt ur fokus och / eller svag, och de totala fluorescens nivåerna minskar på grund av den mindre djup av belysning. Därför att en alternativ metod byta till TIRFM belysning är att först fokusera på mitten av cellen i konfokala / konventionell epifluorescens, sedan öka infallsvinkeln tills du förlorar det mesta av fluorescens, och sedan fokusera ner till plasmamembranet. - En gång i TIRFM, se till excitation lasern reflekterar tillbaka genom objektiv och inte är synlig ovanför målet. Bekräfta detta genom att kontrollera om laserpunkten är synlig.
OBS: I konventionella epifluorescens eller konfokala lägen, är laserbelysning synlig ovanför målet,till exempel i taket. - Förfina fokus för att få en skarp bild. Huvudkomponenterna i den endocytiska maskiner, såsom clathrin, kommer att synas i puncta. Justera fokus på fina, så puncta är så runda som möjligt.
OBS: För membran lokaliserad last, vrida finjusteringen tills filopodia verkar distinkta. - Använd en förvärvsprogram för att spara alla bildparametrar som speglar och TIRF vinkel. Gör detta för alla nödvändiga våglängder.
- Om du använder samma laser för avbildning i konventionell epifluorescens, öka infallsvinkel pålasern tills ur-fokus-fluorescens i det inre av cellen försvinner, och ingen beskrivning av plasmamembranet kring cellen ses. (Jämför figur 2C till figurerna 2A och 2B)
- Scanna runt täckglas för att finna celler som uttrycker alla önskade endocytiska markörer: den μ-opioidreceptorn och adaptern β-arrestin i läget visat i figur 3A exempel. Markera celler som uttrycker men inte över-uttrycker. Se diskussionen för detaljer.
- När celler identifieras, skaffa bilder varje 3 sekund under 10 minuter. Detta är tillräckligt för att fånga livstiden för en central motpart, eftersom den genomsnittliga livslängden för en central motpart i HEK293-celler avbildas under dessa förhållanden är around 40 sek 10-11. Detta gör att cirka 12-14 bildrutor att observera KKP. Till exempel se film 1. Upprepa alla steg för att bild ytterligare celler.
3 Analys av endocytisk Dynamics med manuell verifiering
Även manuell kontroll av KKP livstider är kraftigt begränsad av antalet centrala motparter som kan upptäckas, det är fortfarande en korrekt sätt att upptäcka avskräckas av globala förändringar i bilden och detektions artefakter. Se diskussionen för detaljer.
- Öppna filen i ImageJ. Bilderna lagras som en enda stapel av TIFF-filer med interfolierade kanaler. Konvertera bilder till hyperstacks. Gå till Bild> Hyperstacks> Stack till Hypers. Ange antalet kanaler som köps (dvs. om avbildnings β-arrestin och μ-opioid receptor anger 2), Enter 1 för Z stacken (TIRFM är ett enda plan), och antalet bildrutor i filmen (det vill säga en 10 min film på 1 bildruta var 3 sek is 200) i popup-fönster.
- Den Hypers formatet ger ett fönster med två rullningslister. Använd det översta fältet för att gå igenom kanalerna och botten att gå genom tiden. Bläddra till kanalen för protein vars livstider kommer att analyseras.
- Flytta till ram 10 eller 15 i filmen för att minska införandet av redan existerande centrala motparter vars hela löptider är inte synliga. Rita en ROI ruta runt en plats som valts ut slumpvis.
- Räkna antalet bilder per plats är synlig.
OBS: Se figur 3B och 3C för exempel på tre morfologiska kategorier av endocytic händelser 10,11,16-19.
4 Analys av endocytisk Dynamics av mål erkännande
Mål erkännande tillåter detektion av nästan alla de avbildade centrala motparter i en cell, men kan vara risk för fel på grund av falsk detektering av felaktiga strukturer. Se diskussionen för detaljer som väger fördelar och nackdelar med each metod. Flera program, däribland skräddarsydda algoritmer, kan användas för att objektivt identifiera centrala motparter. Detta protokoll beskriver objektivt erkännande av centrala motparter använder Imaris, en bild-analysmjukvara (se Material).
- Till att börja öppna raw bildfilen i bilden-analysprogram. Som standard visas en sammanslagen färgbild. Använd "Display Justering" fönstret för att justera ljusstyrkan för en kanal. Klicka på namnet på en kanal för att ändra den visade färgen. Avmarkera rutan bredvid kanalen för att förhindra att dess display (Se Figur 4A).
- Skapa "Spots" genom att klicka på ikonen med orange fläckar. Se fig 4B. Välj ett område av intresse (ROI) runt cellen. Se Figur 4C. Använd en ROI för att utesluta områden som felaktigt kommer att upptäcka ljusa framkanter och plack. Analysera flera celler med olika expressionsnivåer separat.
- Mät diametern på en plats för att bestämde ursprungliga beräkningarna för algoritmen. Växla till "Slice"-läge, och klicka på polära ändar av en plats för att mäta dess diameter. Se figur 4E. Gör detta för fyra eller fem runda fläckar som ser tecken på en central motpart på höjden av sin stabilitet, efter bildning och före uppdelning. Använd dessa mätningar för att beräkna medeldiameter ned till närmaste tiondel av en mikron.
- Identifiera Spots. Återgå till "Surpass"-läge. Välj lämplig kanal för detektion. Ange den genomsnittliga uppmätta diametern, vanligen 0,3 eller 0,4 nm. Klicka på den blå framåtpilen för att kvantifiera Spots. Se figur 4E. Om diametern på Spots underskattas, kommer falska punkter fluorescens identifieras som Spots. Om diametern är för stor, kommer sanna Ställen ignoreras. Vid osäkerhet, uppskatta lite lägre, och filtrera bort de felaktiga upptäckter senare.
- Filtrera Spots av kvalitet. Justera filter för att fånga så många punkter som möjligt utan ryggmarken. Kvalitets filter är valda som standard 20. Se figur 4F.
- Använd "Kvalitet" kurva som en guide för att ställa in en lämplig tröskel. Flytta den nedre tröskeln till filtret med vänster musknapp till denna första dopp i kurvan. Detta är en bra utgångspunkt för filtret, eftersom denna position förädlar oftast upptäckt att endast synliga fläckar. Se figur 4F.
- Upptäckta fläckar på filmen som sfärer eller mittpunkter. Använda fliken "Colors", justera färgen på de fläckar till en kontrasterande färg för att göra det lättare att se dem. Bläddra igenom filmen för att se över fläckar i varje bildruta. Målet är att upptäcka så många punkter som möjligt för hela sin livstid.
- Eliminera dimmer Spots eller manuellt koppla dem till kontinuerliga spår senare, eftersom de inte upptäcks väl genom loppet av sin livstid.
- Ta bort ljusa plack med "Intensity" filter, om så erfordras. Klicka på den gröna plustecknet för att lägga till ett nytt filter. Se figur 4F. Skapa ett Intensitet filter för att filtrera in eller ut Spots av en viss fluorescens signaler. Använd den genererade Intensitet kurvan, (analogt med kvalitet Curve diskuteras i 4.5) för att ställa in tröskeln. Använd vänster musknapp för att ta bort den yttersta vänstra änden av kurvan som representerar de ljusaste fläckar.
OBS: Stora plackstrukturer är oftast bland de ljusaste delarna i cellen, och de är lätt uteslutna med detta filter. - Bläddra igenom filmen för att se till att centrala motparter detekteras som fläckar och de ljusaste placken inte längre detekteras. Figur 3D visar en cell där detektering av centrala motparter (betecknas med vita kulor) optimerades med kvaliteten filter och plack uteslöts med kvaliteten filter.
- Minska ljusa cellkanter med kvalitetsfilter. Ljusa objekt kan fortfarande behöva tas bort för hand, i nästa steg. Fortsätt med det blåpil.
- Ta bort avvikande ställen i Edit Spots skärmen. Växla till "Välj"-läge. Klicka på plats. Det kommer att bli gula. Klicka på "Ta bort". Klicka på den blå pilen för att fortsätta bygga algoritmen. Se Figur 4G.
- Mät spår. Ställ låtar till "Brownsk rörelse." Partiet bör inte uppvisa någon riktad rörelse, endast minimal drivande över plasmamembranet. Denna algoritm är mest lämplig för den rörelsen. Se figur 4H.
- Ställ Max avstånd till ett litet värde som 0,7 um. Se figur 4H.
OBS: Ställa ett litet avstånd minimerar anslutning av angränsande fläckar och fortfarande gör för fortsatt spårning av en cell plats via CCP eller cellrörelse. - Ställ Max Gap storlek till 1 Detta tillåter ett spår för att fortsätta om det bara finns en ram som saknas i följd. Klicka på den blå pilen för att beräkna spår. Se figur 4H.
OBS: Gap storlekar av mer än 3 orsakar olika spår som felaktigt kopplas samman. - Byt spår visning till "Dragon Tail." Bläddra i filmen observera kvalitetsdetektering. Om intilliggande fläckar är att vara ansluten, minska Max distans under 0,7 um. Om Spots bryts upp för lätt, öka Max Gap storlek. Klicka på den blå pilen för att skapa spår. Detta leder till skärmen för filterspår. Se figur 4H.
- Ställ Max avstånd till ett litet värde som 0,7 um. Se figur 4H.
- Filter Spår och exportera data. Använd ett "Intensity" filter för att ta bort ytterligare ljusa plack. Använd en "Displacement" filter för att ta bort endosomer som kommer in i TIRF fältet. Var försiktig, eftersom längre fläckar kommer att ha längre förskjutningar också. Klicka på den gröna dubbelpilen för att slutföra protokollet. Se figur 4I.
- Använd fliken Redigera spår, med pennikonen, för att ta bort falska positiva upptäckter av spår som inte kunde avlägsnas med filter. Kontrollera om discontinuities eller falska anslutningar. Om du vill ansluta två spår, markera dem med Ctrl-vänster-klicka, klicka sedan på "Connect" i rutan Redigera spår. För att koppla spår i separata fläckar, välj ett spår och tryck "Disconnect". Markera flera fläckar med Ctrl + Vänsterklicka och klicka på "Anslut" för att skapa ett nytt spår. Metoden är densamma för att editera Ställen, som beskrivs i 4.5.7. Se figur 4J.
- För att exportera data, gå till fliken statistik. Klicka på den enda diskett ikonen för att exportera den valda statistiken. Klicka på ikonen som ser ut som en serie av disketter för att exportera all statistik. Den "Låt Längd" statistik innehåller längden på endocytiska spår. Se figur 4K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av levande celler TIRF Mikroskopi vi har spelat in de endocytiska dynamiken i μ-opioid-receptor (MOR), en G-proteinkopplad receptor (GPCR) och dess endocytic adapter protein β-arrestin. Den β-arrestin konstruktet transfekterades transient in i ett stabilt uttrycker MOR cellinje med användning av det protokoll som beskrivs i figur 1, och avbildas 96 h senare. Den MOR i stabil cellinje är N-terminalt märkt med ett pH-känsligt GFP. Detta fluorescerande proteinet fluorescerar endast i den neutrala extracellulära vätskan. Även MOR endocytoses bara en gång aktiveras av en agonist, och förblir i övrigt jämnt fördelade över plasmamembranet. Med fokus på den vidhäftande plasmamembranet som sitter på locket-glas i konfokala läget blir en cell som fylls i med en svag fluorescens. Detta skiljer sig från en fokusering på centrum av cellen, där plasmamembranet är endast ses som en ring av fluorescens kring cellen. Jämför den vänstraoch höger sida i figur 2A. Byta till konventionella epifluorescens eller TIRF med en felaktig vinkel orsakar oskarp fluorescens för att visa sig i samma celler som visas i figur 2B. När TIRF vinkeln är korrekt plasmamembranet är mycket skarp, klar och ljus och ofokuserad fluorescens inte längre stör bilden. Jämför figur 2C till figurerna 2A och 2B.
Bilden är klar och skarp eftersom MOR är på vidhäftande plasmamembranet, vilket till stor del inom TIRF fältet. I motsats härtill förblir β-arrestin i ett cytosoliskt pool när ännu inte rekryterats till endocytiska puncta, och verkar disiga och ofokuserad eftersom den inte är i TIRF fältet. När MOR aktiveras av en agonist, är β-arrestin rekryteras till plasmamembranet, och både β-arrestin och receptorn omfördela till centrala motparter (figur 3A och Film 1 Är gul β-arrestin i grönt, MOR i rött, overlay).
De livstider av dessa kluster kan kvantifieras manuellt med de tre parametrarna för färdig endocytos som visas i figur 3B. Fläckarna betecknar centrala motparter kan antingen försvinna helt (även se Figur 3C), "blinkar" på och av eller "nypa bort" en större struktur. De två sistnämnda villkoren representerar händelser som rumsligt är för nära varandra att lösa som separata händelser. The Spot detekteringsalgoritmen i Imaris är också användbar för att kvantifiera centrala motparter, som skisseras i Figur 4. Figur 3D betecknar centrala motparter detekteras med användning Imaris, efter filtrering för att avlägsna icke-dynamiska plack strukturer. Överdrog vita kulor betecknar upptäckta fläckar. Dimmer fläckar som inte kunde upptäckas för hela sin livstid var också uteslutna med "Kvalitet" filter.
">
Figur 1: Flödesschema för transfektionsförfarandet. (A) Först ympa en mängd olika spädningar (1:50, 01:25, 01:16, 01:10) på en 12-brunnars platta. Låt cellerna att växa över natten. Nästa dag, leta efter en brunn som är ca 70% sammanflytande, och jämnt fördelade, som avbildas. Detta är den väl som ska transfekteras. (B) Lägg till 60 pl av EG-buffert och 400 ng av DNA i ett mikrocentrifugrör. Vortexa i 10 sek och snurra vätska till botten av röret. Lägg 2.4 l av Enhancer. Vortex 2 sekunder och snurra vätskan till botten av röret. Inkubera vid rumstemperatur under 3 min. Lägg 6 l av Effectene. Vortex 2 sekunder och snurra vätskan till botten av röret. Inkubera vid rumstemperatur i 20 min. (C) långsamt blanda 0,8 ml DMEM med 10% FBS med transfektion. Lägg till celler i tidigare valda väl. Inkubera cellerna under 5 h vid 37 ° C. Ersätt med färskDMEM med 10% FBS.
Figur 2: Att hitta TIRFM fältet. (A) Den plasmamembranet avbildas i konfokal. Den vänstra panelen visar celler i konfokala med fokus på mitten av cellen. Plasmamembranet är endast ses som en "ring" runt cellen. Fokusering ner till basala plasmamembranet, i anslutning till täck gör att cellen ska fyllas i med en svag fluorescens. Plasmamembranet "ring" ska inte synas i tunnare TIRF fältet. (B) Den basala plasmamembranet med en grundare TIRF vinkel producerar konventionell epifluorescens belysning genom provet. Detta belyser hela cellen och mycket ofokuserad fluorescens från toppen av cellen är närvarande. (C) Den plasmamembranet i TIRF. Med fokus på filopodia hjälper till att hitta detta plan. Lägg märke till att det ären slät enda plan. Skala barer är 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Visualisering och kvantifiera endocytic händelser i TIRF. (A) en cell som uttrycker den μ-opioid-receptorn (MOR) och β-arrestin före och efter tillsats av en agonist som inducerar endocytos. Den agonist orsakar omfördelning av båda proteinerna till endocytic puncta. Skala bar är 10 mikrometer. (B) Tre typer av endocytic händelser, sett genom att visualisera arrestin dynamik, i linje med tidigare beskrivna morfologier. "Steady", en fast signal, som snabbt försvinner. Detta är den vanligaste typen, vilket indikerar att KKP har ympade och lämnade TIRF fältet. "Blink", en signal som blinkar till en lägre signal och återkommer på samma ställe på grund av montering av en andra central motpart på samma ställe. "Nyp off", en rörformad projektion kommer från en plats, när två centrala motpart är för nära varandra för att lösas så skilda ställen, och en är endocyteras. Lådan är 2 x 2 pm. (C) Visualisera clathrin medierad endocytos av MOR vid enstaka förlopp upplösning. Två exempel som representerar den största delen av MOR endocytic händelser visas. Ramar är varje 3 sek. Lådan är 2 x 2 pm. (D) Upptäckt av enskilda endocytic händelser med hjälp Imaris. Vita sfärer betecknar centrala motparter upptäckts som fläckar. Spot upptäckt optimerades med hjälp av en "kvalitet" filter. Dimmer fläckar som inte kunde upptäckas för hela sin livstid var också uteslutna med kvaliteten filtret. Stora plack strukturer som visas som att oupptäckt utelämnades med hjälp av en "Intensity" filter.ig3large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mål Erkännande av dynamiken i endocytic Events använder Imaris. (A) Displayen justeringsfönstret, som används för att justera bilden av bilden som beskrivs i steg 4.1. (B) Öppna "Spots" algoritm byggare. Byggaren visas i fönstret nedan. (C) Det första steget i Spots algoritmen byggaren. Kontrollera "Track fläckar (över tid)." Check "Segment endast ett område av intresse," om det behövs. (D) ROI ny skärm. Se steg 4.2 för detaljer. (E) De flera fönster som behövs för att definiera diametern på en uppmätt Spot. Paneler representerar: byte från Surpass till Slice läge med Naviningen fältet längst upp, klicka på de polära ändarna av en plats, där den uppmätta diametern visas normalt längst till höger sida, var att skriva in den uppmätta diametern. Se steg från 4,3 till 4,4. (F) Spotkvalitets Filter beskrivs i 4.5-4.5.3. (G) Edit fläckar fönster som beskrivs i 4.5.7. (H) Mät spår och tittar spår fönster, som beskrivs i 4.6. (I) Filter Tracks fönster som beskrivs i 4.7. (J) Redigera spår fönster som beskrivs i 4.7.1. (K) Spara uppgifter skärm som beskrivs i 4.7.2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi användandet av TIRFM att visualisera clathrin medierad endocytos (CME) på nivån för enskilda centrala motparter i levande celler i realtid. CME är en snabb och mycket dynamisk händelse förmedlas av den ackumulerade effekten av många rumsligt och tidsmässigt separata enskilda händelser. De flesta analyser som för närvarande används, såsom biokemiska mätningar av interna använder ytan biotinylering eller ligand bindande, flödescytometri eller fasta celler analyser som mäter mängden interna proteiner eller elektronmikroskop lokalisering av proteiner, övervaka ensemble förändringar i protein lokalisering vid fasta tidpunkter . Dessa befintliga metoder har varit mycket användbara för att identifiera proteiner som är nödvändiga för CME, men saknar den rumsliga och tidsupplösning som matchar de fysiologiska skalor av CME eller andra dynamiska membran människohandel processer. Detta är viktigt, eftersom nyare uppgifter tyder på att centrala motparter är heterogen i sin proteinsammansättning och dynamik 9-12, och som CME är sannolikt snabbt regleras i ett rumsligt diskret sätt. Live cell TIRFM ger möjlighet att analysera CME på samma nivå som rumsligt separerade enda centrala motparter, i realtid, i levande celler.
Framgångsrik tillämpning av denna kraftfulla analys bygger på två viktiga faktorer: god hälsa av cellerna och grundlig analys av de parametrar för CME. För de förstnämnda, korrekt uttryck av taggade proteiner och mikroskopitekniker minimerar fototoxicitet är kritiska. Cellinjer som stabilt, uttrycker proteiner av intresse är idealiska eftersom de uttrycksnivåer kan beräknas på ett tillförlitligt. Vi märka receptorerna med antingen N-terminal Flag epitop eller sph taggar 21-25. Även om det inte är absolut nödvändigt, både märkningssystem underlättar TIRFM av CME, eftersom receptorer kan selektivt upptäckas på plasmamembranet i början av experimentet. De önskade ytterligare endocytic komponenter kan även transient in i dessa stabila cellinjer. Den transfection protokollet noteras här är optimerad för avbildning CME använder TIRFM. För det första är det skräddarsytt för jämna och måttliga nivåer av uttryck. Dålig uttryck kräver högre lasereffekt för att upptäcka och ökar risken för både fototoxicitet och fotoblekning. Vidare, eftersom denna analys registrerar försvinnande puncta som internaliserade centrala motparter, låga signaler och fotoblekning är skadliga även för analys. Vi föreslår att, under dessa omständigheter, skall den totala varaktigheten och / eller frekvensen av bild minskas. För det andra, den korta inkubation av transfektionsreagens på cellerna, intervallet mellan transfektion och experimentet, och den friska passagen av transfekterade celler till täck före bildbehandling, allt se till att de avbildade cellerna är i optimal hälsa. Tredje, säkerställer detta att majoriteten av clathrin strukturer är centrala motparter, och inte plana ark av clathrin eller clathrin plack. Fjärde, minimerar detta protokoll överuttryck av transfekterade CME komponenter, som har shown att ändra CME dynamik 20,26.
För avbildning med låg fototoxicitet är det viktigt att optimera bildsystem för optimal upplösning och maximal känslighet. Förstoringen av målet och kameradetektor storlek ska matchas för att minimera under-eller översampling och tomma förstoring. En hög numerisk apertur (1.45 eller högre) TIRF mål bör användas för att samla största möjliga ljus. Vi få bilder med en elektron multiplicera laddningskopplad enhet kamera för hög kvanteffektivitet, låga exponeringstider och snabb avläsning hastigheter. Dessutom, för att säkerställa hälsa av cellerna, de avbildas i Leibovitz media, som är buffrat oberoende av CO2, och kompletteras med 10% FBS, i en helt sluten kammare inställd på 37 ° C. Eftersom TIRFM är mycket känslig och de höga numeriska mål bländare som används kan upptäcka även minimala omgivande ljus, är det viktigt att skapa en sluten avbildning miljö frifrån extern ljus och vibrationer som kan störa den fina fokalplanet.
Det är viktigt att notera att de absoluta livstider och dynamiken i de flesta komponenter i CME varierar starkt beroende på celltyper, uttrycksnivåer av proteiner, temperatur, dagar efter plätering, och andra variationer i odlingsbetingelser 7,10,14,17,20, 25,27. Detta återspeglas i de stora variationerna i de tidsramar och fördelningar som observerats mellan olika grupper som använder denna teknik, en tydlig begränsning av denna analys. Vidare är det möjligt att CCP på den undre ytan av cellen, avbildas i TIRFM, beter sig annorlunda från den övre ytan 23,25. Även om det kan diskuteras om vilken yta exakt innebär en "typisk" cell omgiven av extracellulära matrixkomponenter i en vävnad, tolkningar av KKP dynamik ses med denna teknik behöver överväga denna potentialskillnad. Den verkliga styrkan i analysen, därför ligger i att jämföra förändringar i dynamics av centrala motparter, i samma celler under identiska odlingsförhållanden, efter akuta manipulationer, inbegripet klusterbildning av last molekyler såsom GPCRs i svar på aktivering. Denna jämförelse gör det möjligt för normalisering av ändringar i samma cell och därigenom styra alla de parametrar som nämns ovan som kan framkalla variationer i CCP beteende.
Vi använder oftast både manuella och automatiserade analyser, som beskrivits ovan, för att analysera hur länge endocytic händelser: manuell kontroll och objektivt erkännande med hjälp av Imaris bildanalysprogram. Manuell kontroll är labor- och tidskrävande, eftersom den begränsas av antalet centrala motparter en användare kan räkna, men det är utan tvekan den mest exakta tekniken som finns tillgänglig. En utbildad mänskliga ögat kan enkelt fortsätta att spåra en central motpart genom cellrörelse och förändringar i form eller inriktning, exakt exklusive plack och defekta pixlar. Det kan också upptäcka morfologiska förändringar i KKP indikerar färdig events, som visas är figur 3B och 3C. Det är absolut nödvändigt, dock att analysen förblir objektiv som möjligt inom dessa begränsningar. Detta kräver en definition av särskilda kriterier som används genomgående i alla datamängder. Dessutom analyserar vi vanligtvis bilder i en dubbelblind sätt, där de bildnamnen blandas så att förutsättningarna förblir okända för den som analyserar bilderna. Automatiserad upptäckt, t ex med hjälp av "Spots" och "Låt Längd" algoritmer i Imaris, kan användas för att identifiera de flesta endocytiska fläckar i en viss film, genererar en hög provnummer. Medan många alternativ, bland mycket komplexa skräddarsydda algoritmer 3,14,23,26,27 är genereras, tillförlitlighet av dessa metoder upptäcka korrekta endocytic händelser samtidigt undvika falsk detektion fortfarande den största oro. Till exempel i Imaris, cellrörelse skapar ljusa framkanter, plack, och frånfokus kan lätt kasta av spot-detekteringsalgoritm, eftersom den har en tendens att upptäcka ljusa strukturer som bestående helt av fläckar. För att förhindra att dessa fläckar från att vara ansluten till ett spår, måste de alla tas bort. Enstaka avvikande fläckar som inte är i stora strukturer såsom plack kan tas bort med Edit Spots fliken, medan fläckar anslutna kan tas bort senare med hjälp av Edit Tracks fliken. De avvikande fläckar kan också tas bort med egna filter. Till exempel visar fig 3D en intensitet filter används för att begränsa avoid inklusive plack i CCP detektering. Kvalitets filtret är en annan mycket användbar filter för att ta bort felaktiga fläckar. "Quality" är en kumulativ mätning av ljushet och form som hittas genom att ta fluorescensintensiteten hos fläcken och Gaussisk filtrering av tre fjärdedelar av längden av fläcken radie 20. Kvalitetskurvan hittas under de valda filter. Den visar att antalet prickar (y) detekteradenär kvaliteten är ett visst värde (x). Ju lägre kvalitet, upptäcks desto fler fläckar. Om kvaliteten filtret är för låg, kommer fläckarna detekteras när det inte finns någon synlig fluorescens, omvänt, om kvaliteten filtret är för hög, endast de ljusaste fläckarna kommer att detekteras. Följ längs kurvan mot högre värden (x); antalet fläckar detekteras (y) kommer typiskt att sjunka dramatiskt. Flytta den nedre tröskeln till denna punkt. Detta är den lägsta punkten för att placera den nedre tröskeln. Andra stora bidragsgivare till falska fläckar i TIRF fältet är endosomer som flyttar till periferin av cellen och in i TIRF fältet. En robust kriterium för att ta bort dessa är rörlighet fläckar, dvs förskjutningen av fläckar över tiden. Centrala motparter flytta mycket lite, om inte som en del av rörelsen av hela cellen, medan endosomer uppvisar snabb Brownsk eller riktad rörelse. Nyare algoritmer, samtidigt avsevärt förbättras, att finslipa och optimerad 3,14,23,26,27. Eftersom dessa uppfyllstoder blivit mer sofistikerade och tillförlitliga, kan vi analysera hundratals eller tusentals punkter, utan att manuellt kontrollera dem vid varje punkt. Men för närvarande föreslår vi att dessa två analyser användas tillsammans för att komplettera varandra för noggrannhet.
Protokollet vi har beskrivit kan enkelt anpassas för att svara på många frågor om last endocytos. Den kan användas för att utföra enkla samlokalisering av laster med CME komponenter, och används för att visa förändringar på särskilda delar i endocytic maskiner på grund av vissa stimuli. Analysen kan också enkelt anpassas för varje endocytic process, såsom caveolae 28, som visar diskreta koncentrationer av gods och päls komponenter, samt studier av dessa fundamentala processer i specialiserade celltyper. I framtiden som genomredigering blir mer mainstream 20,29,30, räknar vi med att det kommer att bli den bästa metoden för att tagga komponenter, och att dynamiken och beteenden of olika komponenter kommer att förfinas ytterligare. Med tanke på att vår förståelse av cellulära processer har till stor del driven av en identifiering av gener, protein modifieringar och interactomes, analysen vi beskrivs här representerar en av de följande gränser undersökning, nämligen. Definitionen av Spatiotemporal dynamiken av dessa processer och mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 mm coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
- Ungewickell, E., Branton, D.
- Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
- Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
- Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
- Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
- Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
- Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
- Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
- Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
- Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
- Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
- Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
- Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
- Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
- Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
- Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
- Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
- Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
- Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
- Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G.
- Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
- Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
