Summary
Nematodos entomopatógenos son gusanos redondos habitan en el suelo que parasitan una amplia gama de insectos. Demostramos métodos de muestreo utilizados para el aislamiento de estos nematodos del suelo mediante dos técnicas: la de cebado de insectos y la trampa de Blanco modificada, para la recuperación de nematodos de muestras de suelo y cadáveres de insecto infectadas, respectivamente.
Abstract
Nematodos entomopatógenos (también conocido como EPN) representan un grupo de nematodos que habitan el suelo que parasitan una amplia gama de insectos. Estos nematodos pertenecen a dos familias: Steinernematidae y Heterorhabditidae. Hasta ahora, más de 70 especies han sido descritas en la Steinernematidae y hay cerca de 20 especies en el Heterorhabditidae. Los nematodos tienen una asociación mutualista con bacterias Enterobacteriaceae y juntos actúan como un complejo insecticida que mata a una amplia gama de especies de insectos.
Aquí, nos centramos en las técnicas más comunes que se consideran para la recogida de EPN del suelo. La segunda parte de esta presentación se centra en la técnica de los insectos-cebo, un enfoque ampliamente utilizado para el aislamiento de EPN a partir de muestras de suelo, y la técnica de trampa Blanco modificada que se utiliza para la recuperación de estos nematodos de los insectos infectados. Estos métodos y técnicas son pasos clave para el éxito del establecimiento de EPN cultodas en el laboratorio y también forman la base para otros bioensayos que consideran estos nematodos como organismos modelo para la investigación en otras disciplinas biológicas. Las técnicas mostradas en esta presentación corresponden a las realizadas y / o diseñado por los miembros de SP Stock de laboratorio, así como los descritos por diversos autores.
Introduction
Muchos nematodos están asociadas con los insectos, y sus interacciones huésped ser beneficiosos o perjudiciales. Aquí, nos centramos en un grupo de nematodos que son patógenos de insectos, también conocido como nematodos entomopatógenos (o EPN). Dos familias de nematodos pertenecen a este grupo de nematodos: Steinernematidae y Heterorhabditidae 11,13. Su efecto patógeno es, de hecho, conferida por su interacción con las bacterias entéricas bacterias anaerobias facultativas (Xenorhabdus se asocian con steinernematids y bacterias Photorhabdus asociar con heterorhabditids) 2. Las bacterias se vectored de un insecto huésped a otro por la única etapa de nematodos de vida libre, la infectivo juvenil de tercera etapa (también conocida como juvenil dauer, infectivo juvenil o IJ), que vive en el suelo. Una vez dentro del insecto, los nemátodos liberan las bacterias en la hemolinfa del insecto, que matan el insecto huésped por septicemia masiva. Las bacterias tambiéndegradar los tejidos del insecto y se convierten en fuente de alimento de los nematodos ', lo que les permite madurar y se multiplican. Por lo general, una o dos generaciones de nematodos adultos se producen dentro del cadáver del insecto. La progenie de los últimos reasocia generación adulto con unas pocas células bacterianas en un más especializarse de manera que su relación nutricional anterior, y cultivar estas células en sus intestinos a medida que se mueven hacia fuera de la carcasa de insectos en el suelo donde esperarán otro insecto para parasitar 6,11,14 (Figura 1).
Desde su descubrimiento en 1927, EPN se han considerado alternativas valiosas a los plaguicidas químicos, ya que pueden parasitar una amplia gama de insectos que son plagas agrícolas 3,4,5. Sin embargo, en las últimas dos décadas, estos nematodos y sus bacterias simbióticas se han reconocido como un sistema modelo para el estudio maleable aspectos biológicos, ecológicos y evolutivos de INTERACCIÓ host-microbions 14.
El objetivo de esta presentación es mostrar los métodos y técnicas más comúnmente utilizadas para el muestreo de suelos y el aislamiento de EPN. Una variedad de herramientas está disponible y se puede utilizar para la recogida de muestras de suelo, incluyendo: corers suelo, paletas, excavadoras post-hole, sinfines, tubos de muestreo, palas de mano, entre otros (Figura 2).
Dependiendo del propósito del estudio, dos estrategias de muestreo pueden ser considerados: a) estratificado, b) el muestreo aleatorio (Figura 3). El muestreo estratificado se utiliza por lo general como parte de un estudio intensivo en un área específica o demarcada durante un período determinado de tiempo. En general, un transecto está demarcada y muestras de suelo se toman a intervalos estipulados en el transecto en un período de tiempo (Figura 3) 15. El muestreo aleatorio se emplea generalmente cuando se centra en un área extensa. Esta estrategia de muestreo ha sido utilizado para el estudio de la diversidad de EPN fesde una gran área geográfica o región (Figura 3 B) 12. Una serie de factores se puede considerar en función del objetivo del estudio que incluye una amplia gama de elevaciones, texturas de suelo y los hábitats (por ejemplo., Campos de cultivo, bosques, pastizales, parques, playas, áreas ribereñas, etc.)
Se demuestra la técnica de los insectos-cebo, que fue descrito originalmente por ropa de cama y Akhurst 1 y representa una alternativa sencilla y selectiva para la recuperación de la EPN de muestras de suelo. Este es un procedimiento selectivo que se basa en la premisa de que los nematodos (estadio IJ) se sentirán atraídos por un huésped de insectos y parásitos de ella. Esta técnica también se puede considerar para el aislamiento de otros patógenos de insecto tales como hongos, bacterias y 8,10.
También demuestran la técnica de trampa Blanco modificada que se utiliza para la recuperación de la progenie de nematodos a partir de huéspedes de insecto infectadas 7,14. Este es un esfuerzo conocidohod que ofrece la ventaja de la recuperación de una "limpia" progenie de nematodos libres de residuos de los cadáveres de insectos degradantes.
Por último, las técnicas descritas y mostradas en este artículo corresponden a los concebidos y / o realizado en nuestro laboratorio, así como los descritos por diversos colegas y colaboradores.
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Protocol
1. Toma de Muestras de Suelos
- Considere cubrir una superficie mínima de 2 a 4 m 2 por cada sitio de muestreo.
- Recoger muestras de suelo a una profundidad de al menos 15 cm (Figura 4).
- Tomar por lo menos 5 muestras aleatorias dentro de esta área.
- Tomar 3 submuestras por muestra. Dependiendo del objetivo del estudio, ya sea combinan las submuestras o mantenerlas separadas.
- Colocar cada muestra en una bolsa de plástico. Considere la posibilidad de doble embolsado para evitar fugas de las muestras (Figura 4).
- Muestras de la etiqueta con un marcador indeleble. Incluya la siguiente información de cada sitio de muestreo: Información del sitio (incluyendo localidad / área / nombre del sitio y el GPS las coordenadas información), la fecha, el hábitat, la vegetación asociada, temperatura, altitud, etc
NOTA: Si es aplicable, obtener y / o registrar la presencia de insectos u otros invertebrados recolectados con la muestra para su posterior identificación. Pueden representar potencial naturhosts al EPN. - Herramientas de recogida Limpiar a fondo entre las muestras de lavado con agua y / o desinfección de ellos con etanol al 70% o una solución de cloro al 0,5%.
- Mantener las muestras en un refrigerador (8-15 ° C) durante el transporte al laboratorio.
- Tome una porción de la muestra de suelo para el análisis para obtener información sobre la composición del suelo, la textura, la humedad, conductividad eléctrica o de otros parámetros del suelo deseadas.
. 2 Aislamiento de nematodos de muestras de suelo: Insect-cebo Técnica
- Elimine todos los residuos (es decir., Rocas, trozos de madera o la corteza, las hojas, etc.) Recogidos con sus muestras para evitar la contaminación con microorganismos saprobic.
- Añadir agua para humedecer el suelo y facilitar la circulación de los nematodos.
NOTA: Utilice una botella de spray para aumentar poco a poco el nivel de humedad del suelo. - Coloque aproximadamente 200 a 250 ml de suelo húmedo en un recipiente de plástico limpio con tapa.
- Añadir cebos de insectos. Considere la posibilidad de 5 a 10 insectos a la superficie del suelo de cada muestra (Figura 5).
- Cubra el recipiente con una tapa y voltee los contenedores que al revés.
- Mantener los contenedores en la oscuridad y a temperatura ambiente (generalmente 22-25 ° C).
- Compruebe contenedores cada 2 - 3 días y quitar los insectos muertos.
NOTA: agregar insectos sanos adicionales para cada recipiente para su posterior cebo de la muestra de suelo. - Quite los insectos muertos de los contenedores. NOTA: Los cadáveres con un marrón o coloración ocre son generalmente parasitados por steinernematids, mientras que los de ladrillo rojo a púrpura oscuro cadáveres son parasitados por heterorhabditids.
- Enjuague cadáveres en agua estéril.
- Coloque cadáveres en una trampa Blanco modificada para la recuperación de la progenie nematodo (consulte el siguiente procedimiento).
. 3 Nematodo La recuperación de cadáveres infectados: Modificado Trampa Blanco
- Coloque la parte superior de un diámetro de 50 (o 60) mm. Placa de Petri dentro de un plato más grande (100 mm).
- Establecer un pecadopapel de filtro circular gle (Whatman # 1) en el interior del plato más pequeño.
- Coloque los cadáveres sobre el papel de filtro del plato más pequeño asegurarse de que los cadáveres no se toquen entre sí para evitar cualquier contaminación.
- Llene el exterior (grande) caja de Petri con ca. 20 ml de agua destilada estéril. No agregue agua en el plato que contiene los cadáveres.
- Cubrir la placa de Petri grande y su contenido con la tapa (Figura 6).
- Etiqueta de platos en consecuencia. Agregue la siguiente información: nombre del nematodo (especie / cepa), la fecha de la infección (infección se estableció la fecha) y la fecha de la trampa (esta es la fecha en que la trampa está configurado).
- Mantenga trampa a TA hasta que se produce la emergencia de estados juveniles infectivos (IJs). Este proceso puede tardar entre 10 - 25 días, dependiendo de la especie y / o cepa considerada nematodos.
- Cosecha de agua con JIs mediante la eliminación de la plato más grande de la trampa y vertido de agua con los nematodos en un vaso de precipitados.
- Permitir nematodos decantar a la parte inferior de la bEAKER. Este proceso puede tardar unos minutos.
- Verter el agua cuidadosamente, asegurándose de que los nematodos se mantienen en la parte inferior del vaso de precipitados.
- Enjuague nematodos añadiendo más agua y permitiendo que los nematodos decantar. Este paso se puede repetir 2 - 3 veces hasta que el agua esté limpia.
- Coloque suspensión de nematodos en un matraz de cultivo de tejidos (250 ml). Mantener la concentración de la suspensión a 1.000 - 3.000 nemátodos / ml.
- Frasco tienda con suspensión de nematodos en una habitación fría o en incubadora entre 10 a 20 ° C.
NOTA: compruebe frascos almacenados periódicamente a medida que la vida útil de EPN es variable. Por lo general steinernematids se pueden almacenar durante 6 - 12 meses, sin la necesidad de subcultivos, mientras que heterorhabditids pueden requerir más revisiones periódicas.
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Representative Results
Recogida de muestras de suelo
Tercera etapa juveniles infectivos de EPN son los únicos estadios de vida libre en el ciclo de vida de estos nematodos 'que se encuentran en el suelo (Figura 1). Por lo tanto, la recolección de muestras de suelo es un método muy eficiente para recuperarse de estos nematodos. Figura 4 muestra un perfil de suelo que indica la profundidad a la que se deben tomar las muestras. Preservar la humedad de una muestra es un factor clave para la supervivencia de los nematodos. En consecuencia, es importante para mantener las muestras de suelo en bolsas de plástico y mantener a temperaturas frías durante el transporte al laboratorio (Figura 4).
Nematodo de Recuperación
En la naturaleza, las posibilidades de encontrar insectos naturalmente parasitados por EPN son menos del 3%, a menos que haya una epidemia y una muestra más grande de insectos con infestación EPN se encuentra. Por lo tanto, el hostigamiento de las muestras de suelo con los insectos es un aprox convenienteoach para mejorar la recuperación de la EPN de su hábitat natural. Figura 5 representa la técnica de cebado del suelo. En este caso, se utilizó un recipiente de plástico de 250 ml con un tapón de rosca. Aproximadamente 250 g de suelo se coloca en el recipiente y 5 - 10 G. larvas mellonella se añadieron en la superficie del suelo (Figura 5 a la derecha). Después de 5 días, el contenedor se abre para recuperar insectos muertos con signos de infección EPN. Observe las larvas de nematodos infectados con coloración roja (Figura 5 a la izquierda).
La Figura 6A muestra una representación esquemática de la trampa Blanco modificada. Figura 6B demuestra la puesta a punto de la trampa. Tenga en cuenta que los cadáveres infectados EPN no se tocan entre sí y que el papel de filtro en la pequeña placa de Petri se mantiene seco. Figura 6C muestra JIs emergente de cadáveres. Tenga en cuenta los 'caminos' de nematodos (IJs) que se forman en la placa de Petri como se mueven aWards el agua. El tiempo para la IJ aparición de cadáveres es variable dependiendo de las especies de nematodos y depende también de la temperatura y la humedad a la que se mantiene la trampa Blanco. Figura 6D muestra JIs ya en el agua del plato más grande de esta trampa. Observe que los nematodos en el agua un aspecto limpio y libre de tejidos de insectos.
Figura 1. Ciclo de vida de los nematodos entomopatógenos.
Figura 2. Palas y otros dispositivos utilizados para la recogida de muestras de suelo. (A) punto pala Classic. (B) la pala de mano. (C) De izquierda a derecha: tubo Viehmeyer, paleta, tubos Oakfield, corers suelo.
Figura 3. Estrategias de muestreo de suelos. (A) estratificado. (B) Random.
Figura 4. Representación esquemática de la estrategia de muestreo de suelos. Imagen de la izquierda muestra un perfil de suelo que indica la profundidad deseada en la que se deben tomar las muestras. Imagen de la derecha muestra una muestra de suelo en una bolsa de plástico con un etiquetado adecuado.
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Figura 5. Rendido de muestras de suelo con larvas de insectos. Imagen de la derecha muestra las larvas sanas, mientras que la imagen de la izquierda muestra las larvas muertas después de un periodo de cebo de 5 días.
Figura 6. Representación esquemática (A) y fotografías (BD) de una trampa Blanco modificada. (B) Trampa creó; (C) cerca de un cadáver infectado que muestra IJ emergencia; (D) que muestra de cerca la aparición masiva de JIs de cadáveres en el agua.
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Discussion
Esta demostración es la primera de dos presentaciones que describen una serie de técnicas que se utilizan comúnmente para el estudio de la EPN y sus bacterias simbióticas. Estas técnicas representan pasos fundamentales para el establecimiento exitoso de las culturas EPN en el laboratorio y también constituyen la base para otros bioensayos que emplean EPN como organismos modelo para la investigación.
Varios estudios de suelos de EPN han demostrado que su abundancia y distribución pueden variar a través de las estaciones, los hábitats y regiones geográficas 4, 5,9,15. Factores tales como la textura del suelo, contenido de humedad y la temperatura, así como la disponibilidad de acogida pueden desempeñar un papel clave en su distribución. Por lo tanto, es fundamental que un conjunto de datos preliminares sobre la encuesta. Una vez que se toman las muestras, es importante que se procesan tan pronto como sea posible. Sin embargo, si esto no es una posibilidad, que deben ser almacenados en una habitación fría u otra unidad de control de temperatura apropiado. Diferentes temperaturas pueden serconsiderado para el almacenamiento de contenedores de cebo de insectos en función del origen de las muestras. Por lo general, las temperaturas más bajas (por ejemplo., 15 ° C) se consideran para las muestras templadas y para las muestras de las regiones tropicales, las temperaturas más cálidas (p. ej., 30 ° C) son para contemplado.
La técnica de cebado de insectos es el método más comúnmente utilizado para la recuperación de la EPN de muestras de suelo. Es una estrategia conveniente que permite la recuperación de la EPN en el laboratorio. Última estadio las larvas de la polilla mayor de la cera, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) son generalmente considerados; Sin embargo, se recomiendan otros insectos huésped (es decir, grillos, gusanos de la harina, larvas de escarabajos, etc) y / o las etapas adecuadas se puedan considerar y utilizar. Unos pocos estudios han demostrado que un solo ciclo de extracción del método Galleria-cebo es a menudo insuficiente para determinar la presencia de la EPN en una muestra particular o para la extracción de la totalidad de la EPN de muestra de suelos 15. Por lo general, las tasas de recuperación varían entre 20 - 40% 12,15.
Una alternativa al hostigamiento de las muestras de suelo en el laboratorio es la consideración de cebo in situ. Esta es la colocación de cebos de insecto en el sitio de muestreo. En este caso, los insectos se colocaron en jaulas (generalmente de un metal o malla de plástico) y se dejan en sitios demarcada en el área de estudio durante un período de tiempo dado. Las jaulas con los insectos son luego recuperados y examinados para la infección por EPN. Sin embargo, este enfoque es mucha mano de obra y consume mucho tiempo 15.
La técnica de captura de nematodos fue diseñado originalmente por White 10 y posteriormente modificado por Kaya y Stock 6. La técnica utiliza la atracción de los nematodos al agua (es decir, hygrotropism positivo) y se recupera con éxito etapas infectivas de EPN libres de los tejidos y / o de residuos de insectos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros anteriores de la Bolsa de laboratorio: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta y Victoria Miranda-Thompson por su contribución a la mejora de muchos de estos protocolos. Queremos agradecer el apoyo de la Fundación Nacional para la Ciencia (subvenciones IOS-0.840.932 e iOS-0724978) a SP Stock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
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