Summary
Энтомопатогенные нематоды в почве обитающих круглые черви, которые паразитируют широкий спектр насекомых. Мы демонстрируем методы отбора проб, используемые для выделения этих нематод из почвы с помощью двух методов: насекомое травли и модифицированный Белый ловушки, для восстановления нематод из проб почвы и инфицированных трупов насекомых, соответственно.
Abstract
Энтомопатогенные нематоды (ака EPN) представляют собой группу почвенных обитающих нематод, паразитирующих широкий спектр насекомых. Эти нематоды относятся к двум семействам: Steinernematidae и Heterorhabditidae. До сих пор, более 70 видов не были описаны в Steinernematidae и есть около 20 видов в Heterorhabditidae. Нематоды имеют мутуалистических партнерство с Enterobacteriaceae бактерий и вместе они действуют как мощный инсектицидных комплекса, который убивает широкий спектр видов насекомых.
При этом мы ориентируемся на наиболее распространенных методов, рассмотренных для сбора EPN из почвы. Вторая часть этой презентации основное внимание уделяется технике насекомых-травля, широко используемого подхода для выделения EPN из проб почвы и технике модифицированного Белый ловушки, которая используется для восстановления этих нематод от инфицированных насекомых. Эти методы и способы являются ключевыми шагами для успешного создания EPN культаОЭС в лаборатории, а также стать основой для других биопробы, которые считают эти нематоды в качестве модельных организмов для исследований в других биологических дисциплин. Методы, приведенные в настоящей презентации соответствуют тем, которые выполняются и / или разработаны членами SP фондовой лаборатории, а также те, которые описаны различными авторами.
Introduction
Многие нематоды связаны с насекомыми, и принимающими их взаимодействия в диапазоне от выгодно ущерб. При этом мы ориентируемся на группу нематод, которые возбудители насекомых, также известный как энтомопатогенных нематод (или EPN). Две семьи нематод принадлежат к этой группе нематод: Steinernematidae и Heterorhabditidae 11,13. Их патогенный эффект, на самом деле, предоставляемой их взаимодействия с факультативно-анаэробных кишечных бактерий (Xenorhabdus бактерии связать с steinernematids и Photorhabdus бактерий связывают с heterorhabditids) 2. Бактерии векторением от одного хозяина насекомых к другому единственной стадии свободной жизни нематод, третьей ступени инфекционного несовершеннолетних (также известный как DauER несовершеннолетнего, инфекционного несовершеннолетнего или IJ), который живет в почве. Оказавшись внутри насекомого, нематоды освободить бактерии в гемолимфе насекомого, которые убивают хозяина насекомых массивными септицемии. Бактерии такжеухудшить ткани насекомого и стать источником пищи нематоды », что позволяет им развиваться и размножаться. Как правило, один или два поколения взрослых нематод производятся внутри трупа насекомых. Потомство последние повторно ассоциирует поколения взрослых с нескольких бактериальных клеток в более специализируются манеру, чем их предыдущий питательной отношений, и развивать эти клетки в кишечнике, как они двигаются из насекомых туши в почву, где они будет ждать еще один насекомое паразитировать 6,11,14 (рис. 1).
Со времени их открытия в 1927, EPN были рассмотрены ценные альтернативы химических пестицидов, поскольку они могут паразитировать широкий спектр насекомых, которые вредителей сельского хозяйства 3,4,5. Тем не менее, в течение последних двух десятилетий, эти нематоды и их симбиотические бактерии были признаны как податливый модельной системы для изучения биологических, экологических и эволюционных аспектов хост-микроба ВЗАИМОДЕЙСТВИЕнс 14.
Целью данной презентации является показать методы и приемы наиболее часто используемые для отбора проб почвы и изоляции EPN. Разнообразные инструменты доступен и может быть использован для сбора образцов грунта в том числе: почвы пробоотборников, мастерки, пост-луночное старателей, шнеки, отбор проб труб, ручные лопаты, среди прочих (рис. 2).
В зависимости от цели исследования, две стратегии выборки можно считать: а) расслаиваются, б) случайная выборка (рис. 3). Стратифицированная выборка обычно используется как часть интенсивного изучения в конкретном или демаркированы области за данный период времени. В общем, разрез в демаркированы и образцы почвы берутся в предусмотренных интервалами в разрезе в течение периода времени (фиг.3А) 15. Случайная выборка обычно используется при фокусировке на обширной территории. Эта стратегия выборки был использован для изучения разнообразия EPN ером большие географические области или региона (рис. 3В) 12. Ряд факторов может рассматриваться в зависимости от направленности исследования в том числе разнообразных фасады, почвы текстур и мест обитания (например., Возделанные поля, леса, пастбища, парки, морские побережья, прибрежные районы, и т.д.).
Мы показываем технику насекомых травля, которая была первоначально описанный Постельные принадлежности и Akhurst 1 и представляет собой простое и избирательное альтернативу для восстановления EPN из образцов почвы. Это отборочной процедурой, которая основана на предпосылке, что нематоды (И.Я. этап) будут привлечены к хосту насекомых и паразитировать его. Этот метод также может рассматриваться для выделения других насекомых патогенов, таких как грибов и бактерий 8,10.
Мы также демонстрируют технику модифицированный белый ловушки, которая используется для извлечения нематод потомство от зараженных насекомых хостов 7,14. Это усилий встретилсяХод, который предлагает преимущество получения "чистой" нематод потомство должно быть мусора от унизительных трупов насекомых.
Наконец, способы, описанные и показанные в этой статье соответствуют тем, которые задумал и / или выполняются в нашей лаборатории, а также те, которые описаны различные коллегами и сотрудниками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Почва Коллекция Образец
- Рассмотрим охватывающих площадь не менее 2 - 4 м 2 для каждого места отбора.
- Сбор образцов почвы на глубине не менее 15 см (рис. 4).
- Возьмем по крайней мере 5 случайных выборок в пределах этой области.
- Принимать 3 подвыборки на образец. В зависимости от цели исследования, либо объединить подвыборки или держать их отдельно.
- Поместите каждый образец в полиэтиленовый пакет. Рассмотрим двойной упаковки в пакеты, чтобы избежать утечки образцов (рис. 4).
- Образцы этикеток с водонепроницаемой маркера. Укажите следующую информацию от каждого места отбора: Информация сайта (включая местонахождение / область / имя сайта и GPS координат информацию), дате, среды обитания, связанные растительности, температуры, высоты и т.д.
Примечание: Если необходимо, собирать и / или записи на наличие насекомых или других беспозвоночных, собранных с образцом для последующей идентификации. Они могут представлять потенциальную Натураль EPN хозяева. - Чистые инструменты накопительные между образцами, тщательно промывают водой и / или дезинфекции их с 70% этанола или 0,5%-ного раствора хлорной извести.
- Держите образцы в более прохладное (8 - 15 ° С) во время транспортировки в лабораторию.
- Возьмите часть образца грунта для анализа, чтобы получить информацию о составе почвы, текстуры, влаги, электропроводности или других желаемых параметров почвы.
. 2 нематода Изоляция от почвенных образцов: насекомых-травля Техника
- Удалите весь мусор (т.е.., Скалы, куски дерева или коры, листьев и т.д..) Собраны с вашим образцам, чтобы избежать загрязнения с сапробиотических микроорганизмов.
- Добавьте воду, чтобы увлажнить почву и облегчить движение нематод.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте распылитель, чтобы постепенно увеличивать уровень влаги в почве. - Поместите приблизительно от 200 до 250 мл влажной почвы в чистом пластиковом контейнере с крышкой.
- Добавить приманки насекомых. Рассмотрим 5 до 10 насекомых на поверхность почвы каждого образца (рис. 5).
- Накройте емкость крышкой и включить контейнеры с ног на голову.
- Поддерживайте контейнеры в темноте и при комнатной температуре (обычно 22 - 25 ° C).
- Проверьте контейнеры каждые 2 - 3 дня и удаления погибших насекомых.
ПРИМЕЧАНИЕ: добавить дополнительные здоровые насекомых к каждому контейнеру для дальнейшего травле образца грунта. - Удалить мертвых насекомых из контейнеров. ПРИМЕЧАНИЕ: Трупы с коричневой или охры окраски обычно паразитирует steinernematids, а кирпично-красный до темно-фиолетового трупов паразитирует на heterorhabditids.
- Промыть трупы в стерильной воде.
- Наведите трупы в модифицированном Белого ловушки для восстановления нематод потомства (см. процедуру ниже).
. 3 нематода Восстановление инфицированных трупов: изменения Белый Ловушка
- Поместите верхнюю часть 50 (или 60) мм в диаметре. Чашка Петри внутри большего блюдо (100 мм).
- Установите один грехGLE круговой фильтровальная бумага (ватман № 1) внутри меньшего блюдо.
- Место трупы на фильтровальную бумагу меньшего блюдо убедившись трупы не соприкасаются друг с другом, чтобы избежать загрязнения.
- Заполните внешнюю (увеличить) чашку Петри с ок. 20 мл стерильной дистиллированной воды. Не добавляйте воду в чашке, которая держит трупы.
- Накройте большой чашки Петри и его содержимое с крышкой (рис. 6).
- Этикетка блюда соответственно. Добавить следующую информацию: нематода имя (виды / изолят), дату инфекции (дата инфекция был установлен) и дату ловушки (это дата ловушка устанавливается).
- Держите ловушку при комнатной температуре, пока не произойдет появление инфекционных несовершеннолетних этапов (IJS). Этот процесс может занять от 10 - 25 дней в зависимости от вида нематод и / или деформации считается.
- Урожай вода с IJS, удалив большую блюдо ловушку и лить воду с нематодами в стакан.
- Разрешить нематоды переливать в нижней части BИкер. Этот процесс может занять несколько минут.
- Налейте тщательно водой так, чтобы нематоды остаются в нижней части стакана.
- Промыть нематод, добавив больше воды и позволяет нематоды сцеживать. Этот шаг может быть повторен 2 - 3 раза, пока вода не станет чистой.
- Наведите нематод подвеску в колбу с тканевой культурой (250 мл). Держите концентрацию суспензии до 1000 - 3000 нематоды / мл.
- Магазин колбу с нематодами подвески в холодном помещении или в инкубаторе между 10 - 20 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: периодически проверять хранящиеся колбы, как срок годности EPN является переменной. Обычно steinernematids могут храниться в течение 6 - 12 месяцев без необходимости субкультивирования, в то время как heterorhabditids может потребоваться больше периодические осмотры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Почва Коллекция Образец
Третьей ступени инфекционные молодь EPN единственные свободные жилые этапы этих нематод жизненного цикла, которые проживают в почве (рис. 1). Поэтому, собирая образцы грунта является очень эффективным методом для восстановления этих нематод. Рисунок 4 показывает профиль почвы, показывающее глубину, на которой образцы должны быть приняты. Сохранение влаги в образце является ключевым фактором для выживания нематод. Следовательно, важно, чтобы держать образцы почвы в пластиковые пакеты и поддерживать их на низких температур во время транспортировки в лабораторию (рис. 4).
Нематоды восстановления
В природе, шансы найти насекомых, естественно, паразитирует EPN менее чем на 3%, если не будет эпидемия и более крупная выборка из насекомых с EPN заражения встречается. Поэтому травля образцов почвы с насекомыми является удобным октренере для активизации восстановления EPN из их естественной среде обитания. Рисунок 5 изображает технику травли почвы. В этом случае была использована 250 мл пластиковый контейнер с завинчивающейся крышкой. Приблизительно 250 г почвы помещали в контейнер и 5 - 10 Дж. MELLONELLA личинки были добавлены на поверхности почвы (рис. 5 справа). Через 5 дней, контейнер был открыт для получения мертвых насекомых с признаками EPN инфекции. Обратите внимание, нематод-инфицированных личинок с красной окраски (рис. 5 слева).
Фиг.6А показывает схематическое представление модифицированного Белый ловушку. Фиг.6В демонстрирует настройку ловушки. Обратите внимание, что EPN инфицированных трупов не соприкасаются друг с другом, и что фильтровальную бумагу в небольшую чашку Петри остается сухой. Фиг.6С показывает IJs выходит из трупов. Обратите внимание на "тропы" нематод (IJS), которые образуются на чашку Петри, как они двигаются, чтобыподопечные воду. Время для IJ выхода из трупов варьируется в зависимости от вида и нематод также зависит от температуры и влажности, при которой белый ловушка сохраняется. Рисунок 6D показывает IJs уже в воде большего блюдо из этой ловушки. Заметим, что нематоды в воде выглядят чистыми и свободными от тканей насекомых.
Рисунок 1. Жизненный цикл энтомопатогенных нематод.
Рисунок 2. Лопаты и другие устройства, используемые для сбора образцов грунта. (А) Классический точка-лопатой. (B) рука лопата. (С) Слева направо: Viehmeyer трубка, шпатель, Oakfield трубы, почва пробоотборников.
Рисунок 3. Стратегии отбора проб почвы. (A) Стратифицированная. (В) Случайные.
Рисунок 4. Схематическое изображение стратегии отбора проб почвы. Изображение слева показывает почвенный профиль, указывающий нужную глубину, на которой образцы должны быть приняты. Изображение справа показывает образец почвы в пластиковом пакете с соответствующей маркировкой.
3/52083fig5highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 5. Bating образцов почвы с личинками насекомых. Изображение справа показывает здоровый личинок, в то время как изображение слева показывает мертвых личинок после 5-дневного травли период.
Рисунок 6. Схематическое представление (А) и фотографии (BD) из модифицированной Белый ловушку. (В) Ловушка настроить; (С) крупным планом зараженного трупа показывая IJ появление; (Г) крупным планом показывая массивный появление IJS от трупов в воду.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта демонстрация является первым из двух презентаций, описывающих ряд методов, которые обычно используются для изучения EPN и их симбиотические бактерии. Эти методы представляют собой ключевые шаги для успешного создания EPN культур в лаборатории, а также стать основой для других биопробы, которые используют EPN в качестве модельных организмов для исследований.
Различные исследования почвы из EPN показали, что их обилие и распределение может варьироваться в зависимости от сезонов, мест обитания и географических регионах 4, 5,9,15. Такие факторы, как текстура почвы, влажности и температуры, а также наличие принимающей могут играть ключевую роль в их распределении. Поэтому очень важно, чтобы через предварительные данные по обследования. После отбора проб, важно они обрабатываются как можно скорее. Однако, если это не возможность, они должны храниться в холодном помещении или другим соответствующим регулированием температуры устройства. Различные температуры могут бытьсчитается для хранения насекомых контейнеры травля в зависимости от происхождения образцов. Как правило, более низкие температуры (например,., 15 ° C) считаются для умеренных образцов и для образцов из тропических регионов, повышение температуры (например,., 30 ° C) предназначены для рассматривается.
Методика насекомое травля является наиболее широко используемый метод для восстановления EPN из образцов почвы. Это удобный стратегия, которая позволяет извлекать EPN в лаборатории. Последний возрастной стадии личинки большей восковой моли, Галерея MELLONELLA (Lepidoptera: Pyralidae) обычно рассматриваются; Однако других насекомых хозяева (т.е. сверчки, мучные черви, личинки жука, и т.д.) и / или подходящие ступени могут быть рассмотрены и рекомендованы для использования. Несколько исследований показали, что один цикл экстракции методом Galleria-приманки часто недостаточно для определения присутствия EPN в конкретном образце или для извлечения все EPN из образца почвыS 15. Как правило, темпы восстановления варьируются от 20 - 40% 12,15.
Альтернативой травли почвенных образцов в лаборатории является рассмотрение травля на месте. Это размещение приманок насекомых в месте отбора проб. В этом случае насекомые помещают в клетки (обычно изготовленных из металлической или пластмассовой сеткой) и оставляют в демаркированы сайтов в исследуемой области за данный период времени. Клетки с насекомыми затем извлечены и исследованы на EPN инфекции. Однако такой подход является трудоемким и занимает много времени 15.
Техника захвата нематода была первоначально разработана Белом 10, а затем изменена Кая и складе 6. Методика использует привлечение нематод в воду (то есть, положительный hygrotropism) и успешно восстанавливает инфекционные этапы EPN бесплатно тканей и / или остатков насекомых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить бывших членов Фондовой лаборатории: Сэм-Кю Ким, Кэтрин Plichta и Виктория Миранда-Томпсон за их вклад в улучшение многие из этих протоколов. Мы признаем поддержку Национального научного фонда (гранты IOS-0840932 и IOS-0724978) в SP складе.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
- Bedding, R. A., Akhurst, R. J. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21, 109-110 (1975).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, N.Y. 473-488 (2007).
- Gaugler, R. Entomopathogenic Nematology. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2002).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. (1990).
- Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Lacey, L. A. Manual of techniques in invertebrate pathology. , Academic Press. London. (2012).
- McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae). Biological Control. 19, 182-190 (2000).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).
- Poinar, G. O. Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , CRC Press. Boca Raton. 23-61 (1990).
- Stock, S. P., Gress, J. C. Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona. Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).
- Stock, S. P., Hunt, D. J. Nematode morphology and systematics. Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. , CAB International Publishing. Wallingford, UK. 3-43 (2005).
- Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
- Stuart, R. J., Gaugler, R.
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
