Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Nutrient verordening door continue toevoer voor grootschalige uitbreiding van zoogdiercellen in sferoïden

Published: September 25, 2016 doi: 10.3791/52224
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 2, 2, 2, 4, 2
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Introduction

Om grote aantallen levensvatbare en functionele humane cellen voor transplantatie genereren regeling van de kweekomstandigheden is noodzakelijk. Uitputting van voedingsstoffen, samen met de opbouw van metabole afval zijn belangrijke bijdrage aan de veroudering en metabole veranderingen die de kwaliteit van de cel product 1 te verminderen - 3. Deze procedure wordt een methode om niercellenkweek zoogdieren in sferoïden met een geroerde bioreactor gecombineerd met een aangepaste snelheid perfusie toevoersysteem om glucose in een fysiologisch bereik 4 regelt de duur van de kweek. Ten behoeve van deze onderzoeken, werd het fysiologische bereik gedefinieerd tussen 100 en 200 mg / dl. Dezelfde werkwijzen kunnen worden gebruikt om andere voedingsstoffen en metabole afvalstoffen zoals lactaat reguleren.

Statische kweken in kleine hoeveelheden (1-30 ml) worden gewoonlijk gebruikt in de laboratorium omgeving te onderhouden en te differentiëren cellijnen experimental doeleinden. Cel passage wordt uitgevoerd met volledig medium gewenste wijzigingen regelmatig. Meest "klassieke" kweekmedium heeft een hoge glucoseconcentratie (450 mg / dl voor DMEM die in deze studies) om minder frequent mediumveranderingen zonder het risico van nutriënten beperkingen. Echter, deze batch-feeding werkwijze vereist nog steeds frequent manipulatie introduceert variabiliteit in de celomgeving, en verhoogt het risico van besmetting 5-9. Geroerde suspensie bioreactoren (SSB) zorgen voor een betere menging en verminderde de behandeling van 3,10 - 20, maar net als statische culturen, vereisen handmatige medium veranderingen die bijdragen aan potentieel schadelijke schommelingen in de voedings- en afvalproduct niveaus. Perfusie voederen van SSB culturen vermindert deze problemen door continue infusie en verwijdering van medium, maar grote veranderingen in nutriënten als gevolg van de celgroei een probleem blijven. Het gebruik van een aangepaste voeding rate uit berekeningen van nutriënten gebruik op basis van geschatte cel eisen kan de stabiele cel milieu nodig is om levensvatbaarheid van de cellen te optimaliseren te bieden en te functioneren 21-24.

Er is een grote hoeveelheid literatuur beschrijft werkwijzen voor schaalbare SSB kweken van zoogdiercellen specifiek voor kweek en groei van pluripotente cellen 25 - 32, met andere gericht op islet (beta) cellen 17,33,34 of productie van biologische producten 24, 35-38. Veel van deze onderzochte celtypen kunnen worden gekweekt in bolvormige culturen en specifieke procedures voor het celtype wordt gebruikt, moet voorafgaand aan de uitvoering van een continue toevoer systeem worden geoptimaliseerd. In deze demonstratie, werd een perfusie voederen methode die wordt gebruikt om een beta cellijn gegroeid als bolletjes in een geroerde bioreactor 39 uit te breiden - 43. De werkwijze hierin beschreven is, eeneenvoudige uitvoering van het voeden van tariefaanpassingen gebaseerd op off-line glucose metingen om gerichte cultuur omstandigheden te bereiken. Aanpassen van de voeding met deze methode om handhaven van een fysiologische glucose-niveau wordt aangetoond dat het verhoogt cel opbrengsten. Zoogdiercellen afhankelijk van een belangrijke voedingsstof, glucose, energieproductie, zodat het gebruik van deze cellijn is een voorbeeld voor veel gekweekte zoogdiercellen 44. Bovendien is deze lijn een voorbeeld van de verdere complexiteit van beta-cellen, die gevoelig zijn voor chronische hoge glucose 45 zijn. Voor deze studie werden β-TC6 cellen mogen sferoïden in de cultuur te vormen om de gemiddelde grootte van de eilandjes van Langerhans in vivo benaderen. De perfusie bioreactorsysteem 17 - 19,21,46 met een voeding aangepast aan het verbruik glucose, resulteerde in het handhaven van fysiologische omstandigheden en hogere opbrengsten cel zonder veranderingen in de levensvatbaarheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Line en onderhoud

  1. Verkrijgen van β-TC6 cellen (of andere gewenste hechtende zoogdiercellijn). Ter voorbereiding van de studie, cultuur, passage, worden ingevroren cellen volgens de instructies provider.

2. Monteer de Continuous voersysteem

LET OP: De continue voersysteem ontwerp in de onderstaande methode is gebaseerd op vergelijkbare systemen in de literatuur 17 beschreven - 19,21,47 - 49. Assemblage van het hier gebruikte systeem is beschreven in een eerdere publicatie 3.

  1. Het verzamelen van de componenten die nodig zijn voor het voederen systeem dat bestaat uit vijf primaire componenten: een medium reservoir, peristaltische pomp, geroerde bioreactor, afvalreservoir, en op maat ontworpen slang / sampling set.
    1. Bepaal het medium reservoir met behulp van een 1 liter glazen fles, het afvalreservoir met behulp van een 2 L glazen fles, en de stirred bioreactor met behulp van een 250 ml volume glazen reactor (off the shelf-versie).
    2. Gebruik een digitale peristaltische pomp of dergelijke pomp met een 8 kanaals opvoerhoogte tot medium-uitwisseling te controleren.
    3. Fabricage het reservoir en gewijzigde bioreactor deksels van de harde en autoclaveerbaar plastic met roestvrij stalen buis pass-through-poorten aan ventilatie door steriele filters, en zorgen voor middelgrote overdracht tussen reservoirs en bioreactoren. Als alternatief, de aankoop van gespecialiseerde deksels met stroom havens van verschillende leveranciers.
      LET OP: De bioreactor deksel kan extra doorwerking poorten voor optionele instrumentatie en monitoring sondes (bijvoorbeeld zuurstof monitor) bevatten.
    4. Bevestig een uitstroombuis (OT) vervaardigd uit poreuze glazen beluchting buizen met een gemiddelde poriegrootte van 40 urn tot 60 urn en een poriedichtheid van 40% voor het gemodificeerde SSB deksel. U kunt ook kiezen voor een ander uitstroom buis op basis van de specifieke eisen van de cultuur.
      LET OP: Kies deOT poriegrootte om enige medium en celresten te verwijderen, waardoor de cel aggregaten in de cultuur (zoals beschreven in hoofdstuk 6 en publicatie 3 voor meer informatie).
  2. Monteer autoclaveerbaar perfusieslang sets van polyvinylideenfluoride (PVDF) slangconnectoren en duurzaam pompslangen. De lengte van de sectie is afhankelijk van de afstand tussen de verschillende componenten.
    LET OP: Wees extra voorzichtig bij het selecteren van buizen verscheidenheid aan duurzaamheid en betrouwbaarheid voor de lange termijn experimenten te garanderen.
  3. Monteer de set uit drie delen buis: een toevoerleiding, een verspilling lijn, en een monster lijn.
    1. Monteer de toevoerleiding met behulp van twee buizen diameters (L / S 14 en L / S 13). Gebruik de L / S 14 voor het primaire buizenstelsel dat de afstand van de bioreactor aan het medium reservoir uitstrekken, en plaats een kort stuk L / S 13 in het midden van de buislengte van het pompgedeelte met de juiste PVDF adapters.
    2. Gebruik Standard PVDF-slang weerhaken Tubing adapters twee stukken van L / S 14 buis mee aan weerszijden van de kortere pompsectie (L / S 13) buizen.
      Opmerking: Als alternatief kan de gehele buislengte kunnen kleinere diameter L / S 13 buizen, en de gehele buislengte kan worden vervangen als de pomp-gedeelte integriteit is betrokken.
  4. Monteer de tweede buis sectie voor afvalverwijdering gebruik van grotere diameter (L / S 16) buizen en plaats een kort gedeelte van L / S 14 slang in het midden voor het verpompen sectie. Dit gebeurt op dezelfde manier als de toevoerleiding samenstel behulp PVDF-slang weerhaken adapters of alternatief toepassing van een continue lengte van de pompslang gewenste grootte en vervangen indien nodig.
    LET OP: Als dezelfde pomp en de kop van de pomp worden gebruikt voor de voeding circuit en het afval circuit, moet het pompgedeelte van de afvalverwijdering buis lijnen een grotere diameter dan het pompgedeelte van de voeding lijn. Dit zorgt ervoor dat de verwijdering pompsnelheid sneller is dan de toevoersnelheid en de krachtige voorkomenIal voor grote veranderingen in het kweekvolume, en het risico van overstroming te verminderen.
  5. Monteer het laatste onderdeel van de buis set: een monster collectie montage.
    1. Deze procedure beschrijft een aangepaste samengestelde bemonstering poort systeem; alternatief kan een steriele bemonsteringspoort verkrijgbaar van verschillende leveranciers.
    2. Construct de set van drie korte (~ 6 cm) L / S 14 buisstukken onderling verbonden met een T-type PVDF connector en twee kleine slangklemmen op twee van de buisstukken.
    3. Bevestig een steriel gasfilter gas ventileren één van de geklemde lengte, en de andere wordt gebruikt voor het aansluiten van een steriele bemonstering injectiespuit (steriel gasfilters moet in een biologische veiligheidskast worden toegevoegd na sterilisatie zoveel steriele filters zijn niet autoclaveerbaar).
    4. Sluit het derde uiteinde aan een roestvrij stalen monster connector bevestigd aan het deksel van de bioreactor.
    5. Autoclaaf de bemonstering assemblage terwijl verbonden met de bioreactor voorafgaand aan het beginhet experiment (zie onderstaande stap 3).
    6. Gebruik deze assemblage tot steriele monsters te verzamelen van de bioreactor als nodig is, zonder verstoring van de continuous feed proces.

3. autoclaaf Alle Materialen

  1. Bereid alle bioreactor componenten autoclaaf sterilisatie.
  2. Verzamel individuele componenten voor sterilisatie. Medium en afval reservoirs (samengesteld uit stap 2.1.1), 250 ml centrifugekolf (samengesteld uit 2.1.1), nodig aangepast deksels (samengesteld uit 2.1.3), uitstroom buis (in 2.1.4 beschreven), drie slangen sets ( geassembleerd in secties 2.2 through2.5), uitstroom buis (als dat nodig is voor continue voeding).
    1. Monteer centrifugekolf met alle onderdelen en zorg ervoor dat de uitstroom buis stevig bevestigd in de spinner fles (beschreven in paragraaf 2.1.4), en bevestig de aangepaste geassembleerde bemonsteringspoort (paragraaf 2.5), of andere bemonstering poort naar de top van het deksel .
    2. Wikkel de gehele spinner kolf assemblage met autoclave wrap materiaal, en de autoclaaf met vermelding van tape. Zorg ervoor dat de wrap luchtdicht. OPMERKING: aluminiumfolie of soortgelijk materiaal kan worden gebruikt om de individuele einden van elke toegangsopening in de bioreactor deksel betrekking tot steriliteit van de connector behouden / eindigt wanneer uitpakken en wanneer niet aangesloten op de slangensets in de couveuse.
    3. Monteer de gewijzigde deksels van het medium en afval reservoirs en vervolgens hechten aan de respectievelijke glazen flessen. Bedek ze met behulp van aluminiumfolie en autoclaaf aangeeft tape.
    4. Individueel wikkel de buis sets (sectie 2,2-2,5) met autoclaaf wrap en tape om te helpen bij de eindmontage. Aluminiumfolie of soortgelijk materiaal kan worden gebruikt om de individuele einden van elke set op steriliteit van de connector behouden slanghoes / eindigt wanneer uitpakken.
    5. Autoclaaf allemaal verpakt items met behulp van een standaard droge autoclaaf cyclus (bijv, "Gravity" instelling met ~ 15 psi bij 121 ° C gedurende 30 minuten of meer).
      LET OP: Wees niet steriel hechtenfilters voorafgaand aan autoclaveren uitdrukkelijke bevestiging te autoclaaf veilig.

4. Sferoïde Formation

OPMERKING: Deze techniek is vergelijkbaar met die in de literatuur 17 beschreven - 19,21,50 - 52 andere zoogdierlijke celkweken. Alle procedures na sterilisatie worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap en met steriele handschoenen steriele omstandigheden voor celkweek handhaven.

  1. Voor alle omstandigheden, de cultuur en uit te breiden β-TC6 cellen in standaard hechtende culturen (beschreven door vendor) totdat voldoende cel hoeveelheden worden verkregen om het gewenste aantal bioreactoren zaad.
    1. Monteer de continue toevoer bioreactor met uitlaatbuis zoals getoond in figuur 1 en punt 2 beschreven, en sluit bemonsteringspoort steekproeven deksel. LET OP: De uitstroom buis en bemonstering poort assemblage moeten worden toegevoegd aan de bioreactof continue toevoer vóór sferoïde vorming en worden uitgerukt uit het kweekmedium tot continue toediening wordt gestart.
    2. Steriliseer de gewijzigde SSB montage door autoclaaf (beschreven in hoofdstuk 3).
    3. Bevestig steriele vents (0,22 pm of kleiner steriele filters) naar de juiste locaties op de deksels van de spinner kolf, en middelgrote en afval vaten.
      Opmerking: Dit is belangrijk dampblokkering voorkomen en gasuitwisseling tussen de incubator (5% CO2) omgeving en de bioreactor mogelijk. De gasuitwisseling is noodzakelijk om de juiste pH te handhaven bij het gebruik van bicarbonaat gebufferde media.
  2. Verzamel de cellen door behandeling met trypsine zachte behulp 0,25% (w / v) trypsine 0,53 mM EDTA oplossing bij kamertemperatuur geholpen door mechanisch roeren gedurende 2-3 min, en zaden in bioreactoren met een dichtheid van ongeveer 1,3 x 10 6 cellen / ml in 200 ml kweekmedium.
    1. Verplaats aangewezen kolven uit de incubator enin een Bio-Safety kast.
      OPMERKING: Alle celkweek en manipulaties moet worden gedaan in een Bio-Safety kabinet met de juiste steriele techniek.
    2. Verwijder kweekmedium uit kolven door opzuigen.
    3. Was de cellen door pipetteren 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (zonder Ca ++ en Mg ++), in kolf en spoel in de cellen op het oppervlak, en zuig het PBS.
    4. Voeg 3 ml trypsine-EDTA oplossing aan elke kolf die wordt verzameld (typisch ongeveer 10 x 175 cm2 T-kolven).
    5. Sta geoogste cellen te incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 min in biologische veiligheidskast.
    6. Schud voorzichtig met de hand om cellen los te maken van het oppervlak kolf en laat cellen door toevoeging van 6 ml kweekmedium (met serum) aan de kolf, en breng de cellen om een ​​50 ml buis. Wanneer een 50 ml buis vol, gebruik een andere 50 ml buis totdat alle benodigde cellen werden verzameld (ongeveer een 50 ml buis nodig voor elke 5 T-175 kolvenverzameld).
    7. Voorzichtig centrifuge (ongeveer 50 x zwaartekracht) de verzamelde celsuspensies om de cellen te pelleteren.
    8. Zuig het medium waardoor de resterende pellet intact.
    9. Verzamel alle cellen in een enkele buis door het opnieuw suspenderen van de pellets in kweekmedium (met serum) met een pipet, en de overdracht van deze korrels in dezelfde buis.
    10. Tel de celdichtheid met een standaard hemocytometer met trypan blauw kleuring zoals beschreven in de literatuur 53.
    11. Voeg gewenste totale aantal cellen om steriele SSB voor elke aandoening (1,3 x 10 6 cellen / ml was de beoogde start celdichtheden voor deze demonstratie).
    12. voeg medium (met de gewenste glucoseconcentratie, in dit geval gebruik gemaakt medium glucoseniveaus in het fysiologische bereik) SSB met een pipet om de gewenste totale kweekvolume (200 ml cultuurvolume werd gebruikt voor deze studie) te bereiken.
      LET OP: Voor deze continu gevoed SSB bestudeert de cu ltures werden geënt met een aangepaste "laag glucosegehalte" versie van het kweekmedium (100 mg / dl). Hierdoor konden de kweken beginnen bij het gewenste doel glucoseconcentratie dan beginnen met een "hoog glucosegehalte" medium en wachten op de glucose consumptie de glucoseniveaus afvoeren in het fysiologische bereik voeding te beginnen. Alle andere drager voor het toevoeren van deze studies gebruikt de standaard "hoog glucosegehalte" medium (500 mg / dl).
    13. Beweeg SSB met cellen aan een roer plaat in een celkweek incubator.
  3. Kweekcellen in de bioreactoren zonder voeding voor 3 dagen bij 37 ° C met 5% CO2, 100% relatieve vochtigheid, en een roersnelheid van 70 rpm om sferoïden te vormen.
    LET OP: Geen significante proliferatie moet gedurende de drie dagen bolvormige formatie worden ingelast.
  4. Na sferoïde formatie, verdeel sferoïden onder bioreactoren met de gewenste kweekomstandigheden.
le "> 5. continue toevoer Cultuur en Adjusted Feed Rate

  1. Autoclaaf of gas steriliseren alle componenten en assembleren in een biologisch veiligheidskabinet met behulp van steriele technieken (stappen 2-4).
  2. Na sferoïde formatie, verwijder de SSB uit de incubator en monteren van de componenten voor de continue voersysteem in een biologisch veiligheidskabinet.
    1. Vul eerst de verse medium reservoir met de gewenste cultuur medium, en sluit vervolgens aan één zijde van de toevoerleiding. Ook voor zorgen dat het vers medium reservoir goed geventileerd met een steriele filter.
    2. Sluit het ene uiteinde van de toevoerleiding naar de voeding inlaatpoort van de bioreactor in een steriele wijze. Een steriele filter moet worden geïnstalleerd tussen de toevoerleiding en de bioreactor inlaatpoort om het medium te filteren voordat het de bioreactor binnendringt.
    3. Sluit het afval lijn naar de bioreactor uitstroom buis en de medium afvalreservoir, en ervoor te zorgen dat het afval reservoir goed geventileerd met een sterielee filter.
  3. Verplaats de montage uit de biologische veiligheid kabinet (dit zal waarschijnlijk twee mensen voor nodig zijn om alle schepen en leidingen te dragen), en zet alle onderdelen uit voor de lange termijn cultuur.
    1. Zet de SSB op het roer plaat in de incubator met dezelfde kweek parameters sferoïde formatie (37 ° C, 5% CO2, 100% vochtigheid en 70 rpm). Opmerking: Het kan nodig zijn de buissegmenten van de bioreactor tijdelijk los als de lijnen moet lopen door gaten in de zijkant van de incubator plaats via de afdichting van de deur. Dit kan op een aseptische wijze worden uitgevoerd door het wikkelen van de uiteinden van de buis toestellen met aluminiumfolie voorafgaand aan autoclavering (stap 3) en wachten om de bioreactor zijde van de aan- en afvoersysteem buissecties bevestigen totdat de bioreactor in de couveuse. De metrolijnen kunnen worden ingevoerd, en de aluminium folie kan worden verwijderd in de couveuse en snel aan de bioreactor.
    2. Run resterende uiteinden van de slang sets (die niet is aangesloten op de bioreactor deksel) via de incubator toegangspoort (pass-through), of door middel van een inkeping in de incubator deur pakking.
    3. Buiten de incubator (in een nabijgelegen bioveiligheid kast indien mogelijk), snel verbinding van de toevoerleiding naar de vers medium reservoir, en het afval lijn naar het medium afvalreservoir, en ervoor te zorgen dat het afval reservoir goed geventileerd met een steriele filter. LET OP: Om dit te doen in een aseptische wijze, verwijder het aluminium folie van de slangen en vat op en sluit aan de respectieve schepen zo snel mogelijk (vooral als dit verband moet worden gedaan buiten de bioveiligheid kast).
    4. Zet vers medium reservoir (gevuld met de gewenste toevoer medium) in de omgeving van mini-koelkast. Controleer of de aan- en afvoersysteem lijnen kunnen de incubator verlaten en de koelkast zonder dat dit de deuren op elke van sluiten. Het is ook van cruciaal belang dat het diervoeder lines worden niet geknepen gesloten door de deuren van zowel de koelkast of de couveuse.
      OPMERKING: Het medium gebruikt voor deze studies was de standaard hoog glucosegehalte (500 mg / dl) kweekmedium aanbevolen door de leverancier voor dit celtype. Elke hoge glucose medium gebruikt kan worden op basis van de specifieke behoeften van het celtype wordt gekweekt. De glucoseconcentratie van het voedingsmedium redelijkerwijs hoger (2x of meer) dan de gewenste concentratie in de cultuur als het voersysteem gebaseerd op een toename van de toevoersnelheid van hoge glucosemedium adequate glucose in de kweken handhaven bij redelijke toevoersnelheden .
    5. Vervolgens kan het afval medium reservoir op de bank top worden geplaatst buiten de incubator op een gunstige locatie.
    6. Plaats vervolgens de 'pomp gedeelte "van de voeding en afval lijnen in de pomp kop zorgen voor de juiste richting, zodat de voerlijnen medium zal pompen uit de verse medium reservoir in de SSB, en het afval lijnenzal medium van de SSB en de afval medium reservoir pompen.
  4. Schakel de pomp op de gewenste aanzet.
    1. Bereken de voeding met de aangepaste voeding vergelijking in de literatuur 3 en de ontvangen representatieve resultaten hieronder beschreven.
    2. Met de meest recente informatie cellen (procedure beschreven in stap 5) samen met de groei voorspelling, en het medium glucose metingen om de voedingssnelheid die nodig is om de gewenste glucoseconcentratie in de kweek te handhaven schatten.
      LET OP: De celgroei tarieven en glucose verbruik tarieven zullen moeten voorafgaand aan het doen van deze procedures te verkrijgen.
    3. Stel de pompsnelheid op basis van de berekende aanzet.
  5. Herhaal de aanzet berekening en pas de pompsnelheid voor elk bemonsteringspunt (om de drie dagen voor de beschreven methode).

6. Cel Tellingen, levensvatbaarheid en glucoseconcentratie Metingen

<ol>
  • Verzamelen monsters van drie dagen, of naar wens elke bioreactor.
  • Neem kweekmonsters van SSB continu kweken met de gespecialiseerde bemonsteringspoort hierboven beschreven.
    1. Het verlaten van de continu gevoed SSB in de bioreactor, bevestig een steriele injectiespuit (5 ml volume spuit werd gebruikt voor deze studies) to-un gefilterd aansluiting van de bemonstering poort.
    2. Verplaats de monsterbuis naar beneden in het kweekmedium.
    3. Ontspanschakelaars de buis gedeelte gaat naar de spuit, en de gewenste totale steekproef te trekken.
    4. Beweeg de bemonstering buis, zodat het niet meer wordt ondergedompeld in de cultuur, en blijven de spuit totdat de lucht is verwijderd.
    5. Klem de buis die de spuit-feeds en maak de spuit met het monster, en zet apart.
    6. Pre-laden van een tweede verse steriele spuit met lucht, en hechten aan de steriele filter kant van de bemonstering poort.
    7. Ontspanschakelaars de buis naar de spuit-filter kant vande bemonstering poort en zuiveren de bemonsteringspoort door voorzichtig het verdrijven van de lucht in de spuit door het steriele filter. Dit zorgt ervoor dat de bemonsteringspoort vrij van resten van het medium zal zijn.
    8. Re-klem de buis naar het filter, koppelt de steriele spuit en gooi deze weg.
  • Neem de spuit die de cel monster van de cultuur bevat, en verdrijven het in een 10 ml buis. Sub-monsters van bekende volumes kan direct vanaf deze buis worden genomen.
  • Voor celtellingen, verwijderen van een bekend volume van cellen en overbrengen naar een micro-centrifugebuis en centrifugeer zachtjes 1-2 min (ongeveer 50 x de zwaartekracht).
  • Breng de bovenstaande vloeistof over in een afzonderlijke buis voor glucosemetingen en resuspendeer de pellet met hetzelfde volume trypsine-EDTA-oplossing (0,25% (w / v) trypsine, 0,53 mM EDTA), en tel in drievoud met een standaard hemocytometer met trypan blauw kleuring zoals beschreven in de literatuur 53.
    1. medium (met serum) toe te voegen aanhet monster voor verdunning nodig.
    2. Tel de cellen en het berekenen van de levensvatbaarheid van de cellen door het opnemen van live (onbesmet) cellen, en dood (gekleurd) cellen onafhankelijk (levensvatbaarheid% = levende cellen / totaal cellen).
  • Meet medium glucose in drievoud met behulp van een bloedglucosemeter en single use test-strips.
    1. Neem glucose metingen zoals beschreven in de instructies glucose meter substitueren het kweekmedium voor bloed.
    2. Dompel de teststrip in het medium te testen (verzameld van telling monsters hierboven), en herhaal voor het gewenste aantal herhalingen (drie herhalingen wordt aanbevolen).
    3. Test zowel de vers medium en afval medium voor glucose concentraties.
      OPMERKING: Bij sommige meters metingen lager dan 20 mg / dl (detecteerbare drempel van de meter) kan worden waargenomen als een fout in de meter output.

    • 7. Sferoïde bezinkingssnelheid Metingen

    1. Dat CEL waarborgenl clusters worden niet verwijderd door het continu voeden systeem, het meten van de afwikkeling snelheid van β-TC6 bolletjes door het observeren van hun sedimentatie in een grote diameter plastic pipet.
    2. Cultuur β-TC6 cellen SSB bioreactoren tot sferoïden gevormd zoals hierboven beschreven.
    3. Na 3 dagen van cultuur, neem 30 ml monsters van de bolvormige schorsing en plaats in een 50 ml buis.
    4. Voorzichtig pipet op en neer met een brede diameter 25 ml pipet gelijkmatig in suspensie te verdelen, dan stoppen pipetteren met de suspensie bij een bekend niveau in de pipet (bijvoorbeeld 20 ml mark), en tekent een keer voor de sferoïden te vestigen 5 cm.
    5. Herhaal deze procedure vaak genoeg om statistische betrouwbaarheid te bereiken (meestal n> 3).
      LET OP: Voor biologische studies, ap waarde van minder dan 0,05 wordt als statistisch significant te zijn bij het vergelijken van de metingen. De standaardafwijking van het gemiddelde werd gebruikt voor de rapportage fouten, en de tweezijdige-un gepaarde student-t-testwerd gebruikt om de omstandigheden voor de gepresenteerde gegevens te vergelijken.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Medium Glucose Levels en schommelingen beperken celexpansie in Standard SSB Cultures

    Glucose niveaus fluctueren in statische culturen en SSB culturen over de hele kweekperiode 3. Deze fluctuaties intensiveren met toenemend aantal cellen tijdens de 21-daagse kweekperiode en was bijna identiek in zowel statische als SSB culturen. Deze waarnemingen worden gepresenteerd in onze vorige publicatie 3. De glucose kan super-fysiologische voor de duur van de kweekperiode beide methoden. Omdat deze chronische blootstelling celgroei 54 kan remmen, werd een continue toevoer systeem ontwikkeld om glucose schommelingen en het verbeteren van voedingsstoffen controle tijdens spheroïde cultuur.

    Continu Feeding System voor Sferoïde Cultuur

    Continue toevoeging van vers medium en het verwijderen van oude medium voor de duur van de kweekperiodekunnen worden met behulp van een eenvoudig medium replenishment systeem. De in methode 2 beschreven en in figuur 1 gebruikte een pomp en slangenset continu vullen medium en een aparte afvoer buis continu medium verwijderd en voorkomt het verwijderen van sferoïden uit de kweek. De mediuminlaat was aan de andere kant van de reactor om elke mogelijkheid dat ze de goede werking van de OT minimaliseren en te zorgen voor grondig mengen. Vers medium (hoge glucose, 450 mg / dl) werd bij koelkasttemperatuur gehandhaafd stabiliteit op lange termijn te waarborgen en continu toegevoegd aan de kweek door een medium inlaat met een volledige medium vervangingsratio drie dagen om de voedingsstoffen vullen. Dit systeem beperkt de manipulaties en interventie vereist tijdens de kweekperiode door het vervangen van de handleiding batch medium vervanging proces met een continu proces 3,22,23. De koude medium ging de bioreactor in kleine volumes meer dan time (0,046 ml / min) ten opzichte van het totale kweekvolume (200 ml), waarbij elke "drop" toegevoegde medium op temperatuurveranderingen evenwicht met de omringende kweekmedium dat was bij 37 ° C. Hierdoor werd het koude medium toegevoegd veranderde de kweektemperatuur niet beperken binnen de incubator gehandhaafd. Roeren van het kweekmedium ook verhoogde warmteoverdracht efficiëntie en verbeterde gelijkmatige temperatuur in deze culturen. Temperatuurbehoud kan een probleem zijn als zeer hoog voedingen gebruikt met kleine kweekvolumes, maar deze onwaarschijnlijk omstandigheden werden niet getest voor deze studies. Het kweekvolume werd op een constant niveau in de continue voersysteem door ervoor te zorgen dat de gemiddelde medium verwijderingssnelheid gelijk is aan de toevoersnelheid was. Het systeem dat wordt gebruikt voor het daadwerkelijk verwijderd medium op een hoger debiet dan de voeding, omdat de verwijdering buis die gebruikt zijn grotere diameter buis voor het pompgedeelte deze studies. Ondanks de snellere removal rate werd de kweek volume gehandhaafd door aanpassen van het niveau van de uitlaatbuis in de reactor om de gewenste kweek volume. Continue toevoeging van vers medium aan het SSB resulteerde in een kleine toename van het medium in de reactor, en wanneer het medium het niveau van de OT bereikten, werd het medium uit de reactor in een sneller tempo verwijderd. Het medium werd verwijderd door de poreuze glas OT, waardoor de cel sferoïden in kweek tot het middenniveau onder de onderkant van de OT viel. Dit systeem vermeden de complexiteit van het gebruik ijle stroom en een volume sensoren om de pomp snelheid regelen en is de standaard voor gebruik met vele SSB gebaseerde cultuur Inrichting 47,48. De OT is ontworpen dat sferoïden niet uit de kweek door de opheffing keten werden verwijderd, en de poriëngrootte en dichtheid in de gesinterd glazen buis waren groot genoeg is (40% en 40 - 60 urn respectievelijk), zodat de lineaire stroomsnelheid was minder dan de afwikkeling koers van de sferoïden onsed voor deze cultuur studies. De lineaire stroomsnelheid werd berekend zoals beschreven 3. De gemiddelde lineaire medium snelheid door de poriën in het OT werd berekend op 0,17 cm / min en dit was veel langzamer dan de langzaamste waargenomen sferoïde neerslagsnelheid. De gemiddelde valsnelheid werd gemeten volgens methode 7 en was 2,53 ± 0,26 cm / min voor de sferoïden gebruikt in deze studies. De sferoïden werden waargenomen in omvang toenemen als de cultuur vordert, en deze grotere Steroiden vaste sneller vanwege hun grotere verhouding massa-weerstand, die de mogelijkheid van verwijdering door de OT verder afgenomen. Sommige sferoïden werden opgesloten in de lagere poriën aan de buitenranden van het OT, maar dit was vooral te wijten aan mechanische botsing als de uitstroom buis dips in het geroerde medium. Dit belette niet dat een goede werking van het OT, en niet bijdragen aan een meetbare verlies van sferoïden in de geteste culturen. De OT voor deze studies werd schoongemaakt na elk onderzoek (met gedeïoniseerd waterspoeling) en na het gebruik vervangen twee kweek studies om het risico van verminderde functie voorkomen. De OT kan worden vervangen na elke studie als sferoïden waargenomen om de poriën in een bepaald onderzoek (dit werd niet waargenomen in de gepresenteerde werkprogramma) verstoppen. Door de cyclische verwijdering drager met deze methode, het medium kweekvolume schommelde met wel 6%. De fluctuaties werden veroorzaakt door de oppervlaktespanning van het medium dat de toegestane OT wat meer medium verwijderen nadat het gemiddelde medium niveau beneden de bodem van het OT vielen.

    Het wegwerken van Nutrient Schommelingen Verbeterde celgroei in SSB Cultures

    Continu vervangen van het medium in SSB kweken met de bovenstaande kweek verhoogde opbrengsten beschreven systeem tijdens de 21-daagse kweek periode in vergelijking met de standaard SSB culturen. De aanzet werd constant gedurende de kweekperiode gehandhaafd op een tarief dat de hele cultuur volu vervangenme elke drie dagen vergelijkbaar met de ladingsgewijs gevoede SSB culturen. Waardoor de voedingsstoffen fluctuaties resulteerde in een toename in cel opbrengst (figuur 3) ondanks de hoge glucoseconcentratie 3. Sferoïde grootte werd ook gemeten aan het eind van de kweekperiode van 2D microscopische beoordeling (standaard lichtmicroscopie literatuur 3 beschreven), en de sferoïden in CF-SSB kweken waren significant groter (p <0,02, student-t test) die in statische of standaard SSB culturen in de literatuur 3. Deze waarnemingen ondersteunen de cel-count data suggereren een hogere groei in CF-SSB culturen, terwijl de levensvatbaarheid op hetzelfde hoge niveau (96,23 ± 0,85%), ongeacht cultuur aandoening werd gehandhaafd. De continu gevoed SSB (CF-SSB) kweeksysteem elimineerde de voedingsstof schommelingen in de bolvormige culturen, en verbeterde celgroei tarieven, maar de glucosewaarden bleven super-fysiologische die kunnen hebben verhinderd nog verder imp rovement in celexpansie (figuur 2). Verdere verbetering van de CF-SSB kweeksysteem, werd een algoritme gebruikt om de toevoersnelheid te passen tijdens de kweekperiode met als doel het verbeteren van de controle van glucose in SSB culturen.

    Berekening van de Adjusted Feed Rate

    Verschillende factoren kunnen worden beschouwd bij de berekening van de voedingssnelheid vaste glucoseniveaus te handhaven. De factoren van belang kan worden aangepast voor een bepaald onderzoek en voor een bepaalde cellijn. Ten behoeve van deze demonstratie hebben wij groeisnelheid en glucoseconsumptie bepaald uit vorige culturen, evenals de werkelijke glucoseniveaus bij de aanpassing 3. Aanzet aanpassingen kunnen worden gemaakt op elk interval in de tijd. Voor deze demonstratie werden monsters verzameld en de voedingssnelheid werd elke drie dagen aangepast op basis van de opeenvolgende berekeningen als volgt beschreven.

    t "> Berekening van de voorspelde groei

    Vergelijking 1 voorspelt de celgroei gedurende een bepaalde periode van cultuur met de voorspelde cellen (N2) die de verwachte totale aantal cellen in kweek op enig moment in de toekomst. Deze werkwijze gebruikt een lineaire groeisnelheid benadering waar de huidige celtelling (1 N) toegevoegd aan de geschatte groeisnelheid van de cellen in kweken bolvormige (Rg), vermenigvuldigd met de kweekperiode (t -t 2 1).

    vergelijking 1 (1)

    Berekend Baseline Feed Rate

    De basislijn voeding (RF) berekend met vergelijking 2 door schatting van het verbruikte glucose in de cultuur tijdens de kweekperiode (teller) te delen door de glucoseconcentratie in het voedingsmedium (C F 1) van het gewogen gemiddelde van N1 en N2 met vergelijking 1. Dit verbruik werd vervolgens gedeeld door de glucoseconcentratie (C F) in het voedingsmedium voor de gemiddelde medium toevoersnelheid nodig verbruikte glucose in dezelfde kweekperiode vervangen berekenen.

    vergelijking 2 (2)

    Aanpassen Feed Rate met Waargenomen glucosespiegels

    Verdere aanpassingen werden gemaakt om de basislijn aanzet om de gemeten glucosespiegels (C 1) op het gekozen tijdstip met behulp van vergelijking 3. Deze glucose aangepaste voeding (GAFR) geschikt kan worden gebruikt om op peil te houden wanneer onverwachte veranderingen in de groei of de dood plaatsvinden in de cultuur. dit equatio n verwerkt een constante controle (X) en een waarde van 0,5 werd gebruikt voor deze gegevens 3. C 1 geeft de gemeten glucoseconcentratie in het kweekmedium op het monster dag en C D de doelmedium glucoseconcentratie. De eindwaarde past de voorspelde aanzet uit de tweede berekening.

    vergelijking 3 (3)

    Figuur 1
    Figuur 1: Continuous voersysteem Diagram met Uitstroom Tube. (A) Schematische weergave van de aangetoonde systeem. (B) gefrit glas filter geplaatst op uitstroom buis om medium uit de kweek worden verwijderd zonder verlies van cellen. Figuur overgenomen met toestemming. 3

    /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
    Figuur 2:. Glucose Metingen voor SSB, CF-SSB, en aangepast CF-SSB Cultures (A) Medium glucose metingen van β-TC6 sferoïde culturen met behulp van statisch, SSB, en CF-SSB kweekmethoden en het voeden met standaard een hoge glucose medium. De continue toediening kan de glucose schommelingen, maar de gemiddelde glucose in het medium dramatisch veranderen gedurende de kweekperiode, en ver boven het fysiologische bereik (aangegeven door de grijze balk). De aangepaste voeding kan de schommelingen en handhaven de glucoseconcentraties nabij fysiologische niveaus gedurende de duur van de kweekperiode. Foutbalken voor glucose metingen te klein zijn zichtbaar op de getoonde schaal (Standard Error ≤ 4% voor alle metingen) te zijn. De gegevens van de figuren in de voorgaande publicatie met toestemming. 3


    Figuur 3: cel-tellingen van SSB, CF-SSB, en aangepast CF-SSB culturen met Growth Gecorrigeerd Feed tarieven Cell groei gerapporteerd als voudige verandering van het aantal cellen tijdens de 21-daagse kweekperiode vergelijken SSB met regelmatige medium wijzigingen tegen constante voeding. SSB culturen en aangepaste voeding SSB culturen. Error bars verslag van de standaardafwijking van het gemiddelde, en p-waarden gemeld zijn voor een niet-gepaarde tweezijdige student-t statistische toets. Overgenomen met toestemming. 3

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Genereren van zoogdiercellen voor de productie van biologische agentia en celtherapie vereist cultuur en bewaking van zoogdiercellen in grote 55-58. Verder zijn deze toepassingen vereisen gedefinieerd en gevalideerd kweekomstandigheden. Gewoon verhoging van cellen met behulp onderzoekstechnologieën niet al deze eisen voldoen. Handmatige medium veranderingen veroorzaken schommelingen in voedingsstoffen en ophoping van afvalstoffen te verminderen cel kwaliteit, leefbaarheid en de opbrengst. Het gebruik van bioreactoren is goed vastgesteld voor de commerciële kweek van microörganismen voor biofarmaceutische toepassingen, en soortgelijke strategieën zijn toegepast op zoogdiercelkweken. De complexe interactie van zoogdiercellen met hun omgeving vereist specifieke aanpassingen aan voedingsstoffen te reguleren met het oog op de cel expansie potentieel te optimaliseren.

    Om deze problemen aan te pakken, hebben we een straightforward methode om glucose op peil te houden in een specifieke gerichte bereik, de onderlinge aanpassing van fysiologische niveaus in een geroerde suspensie bioreactor met een perfusie toevoermechanisme verstelbare tarief. Hiervoor sferoïden van een bèta-cellijn werden gegenereerd in een geroerde suspensie bioreactor. Een perfusie voersysteem werd gebruikt om een ​​continue toevoer mechanisme standaard batch voeden procedures te vervangen. celgroei werden waargenomen, en gebruikt om bij benadering glucose gebruik prijzen voorspellen. Werkelijke glucosegehalten werden gemeten over de tijd in een kweek toevoersnelheden regelen bij werkelijke voedingsstoffen verbruikt en stofwisselingsproducten gedeponeerd in het medium van de cellen. Deze methode verhinderde de fluctuaties in glucosespiegels gezien met andere statische en SSB systemen 3, waar glucosespiegels fluctueerde sterk met medium verandert elke 3 dagen. Met behulp van de batch-voerstrategieën, glucose concentraties daalde maar liefst 275 mg / dl over drie dagen, in de late stadiums in de 21 dagen expansie. Deze fluctuaties in glucosespiegels beperkt cel opbrengst.

    Berekening van het medium vervangingsratio voor demonstratie van de aangepaste voedersysteem opgenomen een gevestigde groei en glucose verbruik van de cellijn, en de waargenomen (gemeten) cultuur dichtheden en glucosespiegels bij elke voeding tijdpunt. Voor verschillende celtypen, of voor meer complexe weefselkweek systemen kan deze aannames niet opgaan. Om nauwkeurigere glucose controle, het algoritme ook inclusief een feedback control systeem om rekening te houden met de variabiliteit van de individuele culturen. Beperkingen van een perfusie methode gebaseerd op de groeisnelheid alleen, inclusief het effect van heterogeniteit in glucose gebruik van cellen in de sferoïden en veranderingen in glucoseconsumptie basis van parameters zoals differentiatie stamcellen, kunnen worden verholpen door een teruggekoppeld besturingssysteem. Afhankelijk van de toepassing, cellen die Expone vertonenntial groei of complexere groeiprofiel kan worden toegepast om het algoritme te verbeteren. De veronderstellingen en waarden gebruikt voor de aanzet berekeningen kan worden gewijzigd om zich te houden aan de werkelijke kweekomstandigheden.

    De gepresenteerde methoden zijn bedoeld om cellen voor therapeutische toepassingen waarbij de expansie en kweek van sferoïden zou zijn voor een beperkte tijdsduur, en de cellen zelf zijn het product .. Het kan wenselijk zijn voor sommige onderzoekers continu vergroten of kweekcellen gebruik een soortgelijke methode, maar dit zou andere uitdagingen niet tegengekomen voor deze studies presenteren. Indien gekweekt Langdurig zou sferoïden blijven groeien in omvang en de waarde van een aantal cellen in de kern van de bolvormige kan lijden als gevolg van toenemende voedingsstoffen en zuurstof diffusie beperkingen. Deze culturen kunnen verder manipulaties vereisen grote sferoïden dissociëren om deze beperking te voorkomen wanneer langdurige kweken gewenst.Geen afname in levensvatbaarheid werd waargenomen voor sferoïden die met dit protocol, wat suggereert dat deze limiet niet gedurende de 21 dagen kweekperiode van deze studie was bereikt.

    Voor cellulaire therapie, kunnen deze technieken worden gebruikt in combinatie met andere regulerende systemen celopbrengst, functie en levensvatbaarheid verbeteren. Zo zou de SSB werkwijze worden gecombineerd met het vergemakkelijken technologieën, waaronder micro-drageroppervlak kweken van hechtende cellen celgroeisnelheden of inkapselen van cellen of sferoïden verbeteren. Verder zou meer complexe algoritmen correctie worden toegepast om strengere cultuur te verzorgen. Toevoeren aanpassing kan worden gecombineerd met een regeling van verscheidene andere parameters, zoals pH, opgeloste zuurstof, de temperatuur en injectie van reagentia verdere verbeteringen 59,60 maken. Om de resultaten in andere applicaties te verbeteren, kan deze methode worden geautomatiseerd 15,24, en diervoeders prijzen kunnen worden berekend merts of minder vaak, verdere verfijning kweekomstandigheden.

    Productieprocessen 61-63 moeten worden gedefinieerd en zorgvuldig gecontroleerde reproduceerbare biologische producten te maken. Het gebruik van continue medium vervanging kan worden gebruikt om mitigeren in kritische nutriënten waargenomen in grootschalige celproductie en waarin een regelbare voersysteem kan nog meer controle over de celomgeving te voeren, om de gewenste nutriënten te handhaven. De beschreven methode kan worden gebruikt met andere zoogdiercellen zowel cellulaire en geneesmiddelen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    β TC-6 Cells ATCC, Manassas, VA CRL-11506 Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)
    DPBS No Ca, No Mg Invitrogen, Carlsbad, CA 14190-144 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles Medium Invitrogen, Carlsbad, CA See below for product numbers 
    DMEM High Glucose (500 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11965-092 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11885-084 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)
    L-glutamine Invitrogen, Carlsbad, CA 25030081 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
    Sodium Pyruvate Invitrogen, Carlsbad, CA 11360070 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
    Heat Inactivated Porcine Serum Gibco - Life Technologies 10082147 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTA Invitrogen, Carlsbad, CA 25200056 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
    T-150 Tissue Culture Treated Flasks Corning, Corning, NY 430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    &categoryname=
    NuAire Cell culture incubator Princeton, MN US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used.
    Centrifuge Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)
    Refrigerator Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)
    1 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-1L Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    &categoryname=
    2 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-2L Any vendor could be used
    250 ml stirred bioreactors  Corning, Corning, NY 4500-250 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)
    &categoryname=
    Stir Plate Fisher Scientific 11-496-104A Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor
    Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) 1256598  Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)
    FALCON 50 ml Conical Tubes Falcon, San Jose, CA 1256598 Any vendor could be used
    Delran Plastic Used for Custom Parts McMaster Carr Various Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    Stainless Steel Pipe for custom lids McMaster Carr Various Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding Custom made Not aware of any vendors producing a similar product
    Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding Custom made Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below.
    Masterflex Digital Peristaltic Pump Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-77919-25 Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF Tubing Connectors (various) Cole Parmer, Vernon Hills, IL see link Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT Tubing L/S 16 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-16 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L/S 14 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-14 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-13 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-13
    Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) Fisher Scientific SLGP033RS Any vendor could be used
    25 ml Graduated Pipette Fisher Scientific 13-678-11 Any vendor could be used, and various sizes may be used
    Pipetter Fisher Scientific 13-681-15E Any vendor, or similar product could be used
    Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6 Any vendor, or similar product could be used
    Trypan Blue Gibco - Life Technologies 15250-061 Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Inverted Light Microscope Leica Any vendor, or similar product could be used
    One Touch Ultra Blood Glucose Meter Fisher Scientific 22-029-293 Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)
    One Touch Ultra-Strips Fisher Scientific 22-029-292  Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
    2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
    3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611 (2013).
    4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
    5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
    6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
    7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
    8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
    9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
    10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
    11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
    12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
    13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
    14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
    15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
    16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
    17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
    18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
    19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
    20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
    21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
    22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
    23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
    24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
    25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
    26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
    27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
    28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
    29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
    30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
    31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
    32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
    33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
    34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
    35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
    36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
    37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
    38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
    39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
    40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
    41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
    42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
    43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
    44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
    45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
    46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
    47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
    48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
    49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
    50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
    51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
    52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
    53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262 (2007).
    54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
    55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
    56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
    57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
    58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
    59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
    60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
    61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
    62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
    63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

    Tags

    Bioengineering glucose voedingsstoffen regelgeving continue toediening geroerde suspensie bioreactor uitbreiding sferoïde cultuur bioreactor
    Nutrient verordening door continue toevoer voor grootschalige uitbreiding van zoogdiercellen in sferoïden
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash,… More

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash, P., Carlson, A. L., Voltzke, K. J., Geng, Z., Jahani, M., Becker, B. B., Papas, K. K., Firpo, M. T. Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids. J. Vis. Exp. (115), e52224, doi:10.3791/52224 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter