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Bioengineering

Nutriente Reglamento mediante la alimentación continua de expansión a gran escala de células de mamífero en esferoides

Published: September 25, 2016 doi: 10.3791/52224
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 2, 2, 2, 4, 2
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Introduction

Con el fin de generar un gran número de células humanas viables y funcionales para el trasplante, la regulación de las condiciones de cultivo es imprescindible. El agotamiento de nutrientes, junto con la acumulación de residuos metabólicos son los principales contribuyentes a los cambios de senescencia y metabólicos que reducen la calidad del producto de células 1-3. Este procedimiento demuestra un método para células de mamíferos de cultivo en esferoides utilizando un biorreactor agitado en combinación con un sistema de alimentación de perfusión tasa ajustada para regular la glucosa en un rango fisiológico 4 durante toda la duración del cultivo. Para los fines de estos estudios, el intervalo fisiológico se definió como entre 100 y 200 mg / dl. Los mismos métodos se pueden utilizar para regular otros nutrientes y residuos metabólicos, tales como lactato.

cultivos estáticos en pequeños volúmenes (1 - 30 ml) se utilizan normalmente en el entorno de laboratorio para mantener y diferenciar líneas celulares para EXPERIMENTAL propósitos. pases de células se lleva a cabo con los cambios de medio completo, según sea necesario, a intervalos regulares. La mayor parte de medio de cultivo "convencional" tiene una alta concentración de glucosa (450 mg / dl en DMEM utilizado en estos estudios) para permitir cambios de medio de menos frecuentes, sin el riesgo de limitaciones de nutrientes. Sin embargo, este método por lotes de alimentación de aún requiere una manipulación frecuente, introduce variabilidad en el medio ambiente celular, y aumenta el riesgo de contaminación 5-9. Biorreactores suspensión agitada (SSB) proporcionan una mejor mezcla y la disminución de gastos de envío de 3,10 - 20, pero al igual que cultivos estáticos, requieren cambios manuales medianas que contribuyen a las fluctuaciones en los niveles potencialmente dañinos de productos de nutrientes y desechos. alimentación de la perfusión de las culturas SSB reduce estos problemas mediante la infusión continua y la eliminación del medio, pero los grandes cambios en los niveles de nutrientes debido al crecimiento de las células siguen siendo un problema. El uso de un RA de alimentación ajustadate de los cálculos de utilización de nutrientes sobre la base de los requisitos de células estimado puede proporcionar el entorno celular estable requerido para optimizar la viabilidad celular y la función 21 - 24.

Hay una gran cantidad de literatura que describe métodos para cultivos escalables SSB de células de mamíferos específicamente para el cultivo y expansión de células pluripotentes 25 - 32, con otros se centraron en las células de los islotes 17,33,34 (beta), o la producción de productos biológicos 24, 35-38. Muchos de estos tipos de células investigadas pueden crecer en cultivos de esferoides, y procedimientos específicos para el tipo de célula que se utiliza debe ser optimizado antes de implementar un sistema de alimentación continua. En esta demostración, se utilizó un método de alimentación de perfusión para expandir una línea de células beta crecido como esferoides en un biorreactor agitado 39-43. El método descrito en este documento proporciona unala aplicación directa de la alimentación de los ajustes del tipo basado en las mediciones de glucosa fuera de línea para lograr condiciones de cultivo específicas. Ajuste de la velocidad de alimentación con este método para mantener un nivel de glucosa fisiológica se muestra a los rendimientos celulares aumenta. Las células de mamíferos son dependientes de un nutriente clave, glucosa, para la producción de energía, por lo que el uso de esta línea celular representa un modelo para muchas células de mamífero en cultivo 44. Además, esta línea es un ejemplo de la mayor complejidad de las células beta, que son sensibles a los niveles crónicos elevados de glucosa 45. Para este estudio, se dejó que las células ß-TC6 para formar esferoides en cultivo para aproximar el tamaño medio de los islotes de Langerhans in vivo. El sistema de biorreactor de perfusión 17 - 19,21,46 con una velocidad de alimentación ajustada a la glucosa consumo, se tradujo en el mantenimiento de condiciones fisiológicas y los rendimientos celulares más altas sin cambios en la viabilidad.

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Protocol

1. Línea celular y el mantenimiento

  1. Obtener células ß-TC6 (u otra línea celular de mamíferos adherentes deseada). En preparación para el estudio, la cultura, el paso, y criopreservar las células de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

2. Montar el sistema de alimentación continua

NOTA: El diseño del sistema de alimentación continua en el método a continuación se basa en sistemas similares se describen en la literatura 17 - 19,21,47 - 49. Asamblea del sistema utilizado aquí se describe en detalle en una publicación anterior 3.

  1. Recoge los componentes necesarios para el sistema de alimentación que consta de cinco componentes principales: un contenedor de medios, la bomba peristáltica, de biorreactor agitado, depósito de residuos, y el conjunto de tubos / de muestreo de diseño personalizado.
    1. Establecer el depósito medio utilizando una botella de vidrio de 1 litro, el depósito de residuos utilizando una botella de vidrio de 2 litros, y el stirred biorreactor utilizando un reactor de vidrio de 250 ml de volumen (de la versión de la plataforma).
    2. Use una bomba peristáltica digital o bomba similar con un cabezal de la bomba de 8 canales para controlar el intercambio de soporte.
    3. Fabricación del depósito y tapas de biorreactor modificados de plástico duro y esterilizar en autoclave con tubo de acero inoxidable de paso a través de los puertos para proporcionar ventilación a través de filtros estériles, y permitir la transferencia de medio entre depósitos y biorreactores. Como alternativa, la compra de tapas especializadas con puertos de flujo de diferentes proveedores.
      NOTA: La tapa biorreactor puede contener puertos de paso a través adicionales para la instrumentación opcional y las sondas de monitoreo (por ejemplo, monitores de oxígeno).
    4. Adjuntar un tubo de salida (OT) fabricado a partir de tubos de aireación de vidrio poroso con un intervalo de tamaño medio de poro de 40 micras a 60 micras, y una densidad de poros de 40% a la tapa SSB modificado. Alternativamente, elegir otro tubo de salida sobre la base de los requisitos específicos de la cultura.
      NOTA: Elija elTamaño de poro OT para extirpar únicamente medio y los desechos celulares, dejando los agregados de células en cultivo (como se describe en la sección 6 y publicación 3 para más detalles).
  2. Montar juegos de tubos de perfusión en autoclave de fluoruro de polivinilideno (PVDF) conectores de tubo y tubería de la bomba peristáltica duradera. La longitud de la sección depende de la distancia entre los diferentes componentes.
    NOTA: Tenga especial cuidado al seleccionar la variedad de tubos para garantizar la durabilidad y fiabilidad para los experimentos a largo plazo.
  3. Montar el juego de tubos de tres partes: una línea de alimentación, una línea de residuos, y una línea de muestra.
    1. Montar la tubería de alimentación utilizando dos diámetros de tubería (L / S 14 y L / S 13). Utilice la L / S 14 para el tubo primario que cubrir la distancia desde el biorreactor al depósito de medio, e insertar una longitud corta de L / S 13 en el medio de la longitud de la tubería para la sección de la bomba utilizando los adaptadores de PVDF adecuadas.
    2. Use Standard PVDF Tubi manguera de púasadaptadores de NG para unir dos piezas de L S 14 tubos / a cada lado de la sección de la bomba más corto (S 13 / L) tubo.
      NOTA: Como alternativa, toda la longitud del tubo podría ser de menor diámetro L / S 13 tubos, y toda la longitud de la tubería podría ser reemplazada cuando la integridad de sección de la bomba está en cuestión.
  4. Montar la segunda sección de tubo para la eliminación de residuos mediante tubos de mayor diámetro (L / S 16) e insertar una sección corta de la L S 14 tubos / en el medio de la sección de bombeo. Esto se hace de la misma manera que la línea de alimentación de montaje usando adaptadores de manguera de púas-PVDF, o alternativamente usando una longitud continua del tamaño de la tubería de la bomba deseada, y la sustitución según sea necesario.
    NOTA: Si la misma bomba y la cabeza de la bomba se utilizan para el circuito de alimentación y el circuito de residuos, la sección de la bomba de las líneas de tubería de eliminación de desechos debe ser un diámetro mayor que la sección de la bomba de la línea de alimentación. Esto asegura que la velocidad de la bomba de eliminación es más rápida que la velocidad de alimentación, y evitará la potenteIal para grandes cambios en el volumen de cultivo, y reducir el riesgo de desbordamiento.
  5. Montar el componente final del conjunto de tubos: un conjunto de recogida de muestras.
    1. Este procedimiento describe una costumbre montado muestreo sistema portuario; alternativamente, un puerto de muestreo estéril se puede adquirir de varios fabricantes.
    2. Construir el conjunto de tres cortos (~ 6 cm) L S 14 longitudes / tubos conectados entre sí con un conector de PVDF de tipo T, y dos pequeñas abrazaderas de manguera en dos de las longitudes de los tubos.
    3. Adjuntar un filtro de gas estéril para el venteo de gas a una de las longitudes sujetos al suelo y el otro se utiliza para la conexión a una jeringuilla de muestreo estéril (filtros de gas estériles pueden necesitar ser añadido en una cabina de seguridad biológica después de la esterilización como muchos filtros estériles no están autoclavable).
    4. Conectar el tercero extremo a un conector de muestra de acero inoxidable adjunta en la tapa del biorreactor.
    5. Autoclave el conjunto de muestreo mientras está conectado al biorreactor antes de comenzarel experimento (ver paso 3).
    6. Utilice esta asamblea para recoger muestras estériles del biorreactor según sea necesario sin perturbar el proceso de alimentación continua.

3. Autoclave Todos los Materiales

  1. Preparar todos los componentes de biorreactores para la esterilización en autoclave.
  2. Recoger los componentes individuales para la esterilización. Medianas y residuos depósitos de agua (reunidos desde el paso 2.1.1), matraz de agitación de 250 ml (montado a partir de 2.1.1), necesarios tapas modificados (ensambladas a partir de 2.1.3), tubo de salida (descrito en 2.1.4), tres juegos de tubos ( montado en las secciones 2.2 through2.5), tubo de salida (según sea necesario para la alimentación continua).
    1. Montar matraz de agitación con todos los componentes y asegúrese de que el tubo de salida se une firmemente dentro del matraz de agitación (que se describe en la sección 2.1.4), y conecte el puerto personalizado montado muestreo (sección 2.5), u otro puerto de muestreo para la parte superior de la tapa .
    2. Envolver todo el conjunto matraz de agitación con automaterial de envoltura clave, y que indica autoclave cinta. Asegúrese de que el envoltorio hermético. NOTA: El papel de aluminio o material similar se pueden utilizar para cubrir los extremos individuales de cada puerto de acceso en la tapa del biorreactor para preservar la esterilidad del conector / termina cuando desenvolver y cuando no conectado a los juegos de tubos dentro de la incubadora.
    3. Montar las tapas modificadas de los embalses medianos y residuos y luego adjuntar a las respectivas botellas de vidrio. Cubrirlas usando papel de aluminio y autoclave indicando cinta.
    4. Individualmente envolver los juegos de tubos (sección 2.2 - 2.5) Factor con una envoltura de cinta de autoclave y para ayudar en el montaje final. El papel de aluminio o material similar se pueden utilizar para envolver los extremos individuales de cada juego de tubos para preservar la esterilidad del conector / termina cuando desenvolver.
    5. Autoclave todos los artículos envueltos utilizando un ciclo estándar de autoclave seco (por ejemplo, "Gravity" ajuste con ~ 15 psi a 121 ° C durante 30 minutos o más).
      NOTA: No conecte estérilfiltros antes de la esterilización en autoclave a menos que se confirma que es segura autoclave.

4. formación de esferoides

NOTA: Esta técnica es similar a los descritos en la literatura 17 - 19,21,50 - 52 para otros cultivos de células de mamíferos. Todos los procedimientos siguientes esterilización deben realizarse en una campana de flujo laminar y el uso de guantes estériles para mantener condiciones estériles para el cultivo de células.

  1. Para todas las condiciones, la cultura y expandir las células β-TC6 en cultivos adherentes estándar (descrito por el vendedor) hasta cantidades suficientes de células se obtienen a sembrar el número deseado de biorreactores.
    1. Montar el biorreactor alimentación continua con el tubo de flujo de salida como se muestra en la Figura 1 y descrito en la sección 2, y conectar el puerto de muestreo a la tapa de muestreo. NOTA: El tubo de salida y el muestreo de conjunto de puerto, debe añadirse a la bioreacto para la alimentación continua antes de la formación de esferoides, y debe ser levantado fuera del medio de cultivo hasta que se inicia la alimentación continua.
    2. Esterilizar el conjunto de SSB modificados por autoclave (descrito en la sección 3).
    3. Coloque rejillas de ventilación estériles (0,22 micras o más pequeñas filtros estériles) a las ubicaciones correspondientes de las tapas del matraz de agitación, y vasos medianos y residuos.
      NOTA: Esto es importante para evitar el bloqueo de vapor, y para permitir el intercambio de gases entre la incubadora (2 CO 5%) medio ambiente y el biorreactor. El intercambio de gases es necesaria para mantener el pH correcto cuando el uso de medios de bicarbonato tamponada.
  2. Recoger las células por tripsinización suave usando 0,25% (v w /) solución de tripsina EDTA 0,53 mM, a temperatura ambiente con la ayuda de agitación mecánica durante 2 - 3 minutos, y semilla en biorreactores a una densidad de aproximadamente 1,3 x 10 6 células / ml en 200 ml de medio de cultivo.
    1. Mueva frascos designados de la incubadora yen un gabinete de bioseguridad.
      Nota: Todos los cultivos celulares y manipulaciones deben realizarse en una cabina de Bio-seguridad utilizando una técnica estéril apropiada.
    2. Retire el medio de cultivo de los matraces mediante la aspiración.
    3. Lavar las células pipeteando 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (sin Ca ++ o Mg ++), en un matraz, y el aclarado a través de las células en la superficie, y luego aspirar el PBS.
    4. Añadir 3 ml de solución de tripsina-EDTA a cada matraz que será recogida (normalmente alrededor de 10x 175 cm 2 frascos T).
    5. Permiten que las células cosechadas incubar a temperatura ambiente durante 2 - 3 minutos en el gabinete de seguridad biológica.
    6. Agitar suavemente con la mano para aflojar las células de la superficie del matraz, y recoger las células mediante la adición de 6 ml de medio de cultivo (con suero) al matraz, y transferir las células a un tubo de 50 ml. Cuando uno 50 ml tubo está lleno, utilizar otro tubo de 50 ml hasta que todas las células necesarias se han recogido (aproximadamente será necesario un tubo de 50 ml por cada 5 matraces T-175recogido).
    7. Suavemente de centrífuga (aproximadamente 50 x gravedad) las suspensiones celulares recogidas para sedimentar las células.
    8. Aspirar el medio restante dejando intacto el pellet.
    9. Recoge todas las células en un único tubo de re-suspensión los gránulos en medio de cultivo (que contiene suero) usando una pipeta, y la transferencia de todas las pastillas en el mismo tubo.
    10. Contar la densidad de células usando un hemocitómetro estándar con tinción de azul de tripán como se ha descrito en la literatura 53.
    11. Añadir número deseado de células totales de SSB estéril para cada condición (1.3 x 10 6 células / ml fueron las densidades de células de partida específicas para esta demostración).
    12. Añadir medio (con la concentración de glucosa se desea, en este caso se utilizó los niveles de glucosa del medio dentro del intervalo fisiológico) para BLU utilizando una pipeta para alcanzar el volumen de cultivo total deseado (se utilizó 200 ml de volumen de cultivo para estos estudios).
      NOTA: Para estos alimentado continua SSB estudia el cu ltures se sembraron utilizando un "bajo en glucosa" versión modificada del medio de cultivo (100 mg / dl). Esto permitió que las culturas que comienzan a partir de la concentración de glucosa objetivo deseado en lugar de comenzar con una "alta glucosa" medio y esperar a que el consumo de glucosa para llevar los niveles de glucosa hacia abajo en el rango fisiológico para iniciar la alimentación. Todo otro medio para la alimentación en estos estudios utiliza el estándar de "alto-glucosa" medio (500 mg / dl).
    13. Mueva SSB con las células a una placa de agitación dentro de una incubadora de cultivo celular.
  3. Células de cultivo en los biorreactores sin alimentación durante 3 días a 37 ° C, con un 5% de CO 2, el 100% de humedad relativa, y una velocidad de agitación de 70 rpm para permitir que se formen esferoides.
    NOTA: No proliferación significativa debe ser observada durante el período de formación de esferoides de tres días.
  4. Después de la formación de esferoides, esferoides dividir entre biorreactores con condiciones de cultivo deseadas.
Le "> 5. Cultura alimentación continua y ajustado Velocidad de alimentación

  1. Autoclave ni esterilizar el gas todos los componentes, y reunir en una cabina de seguridad biológica usando técnicas estériles (los pasos 2 - 4).
  2. Después de la formación de esferoides, retire el SSB de la incubadora y ensamblar los componentes para el sistema de alimentación continua en una cabina de seguridad biológica.
    1. En primer lugar llenar el depósito de medio fresco con el medio de cultivo deseada, y luego conectarse a un lado de la línea de alimentación. También asegúrese de que el depósito de medio fresco tiene una ventilación adecuada con un filtro estéril.
    2. Conectar un lado de la línea de alimentación al puerto de entrada de la alimentación en el biorreactor de una manera estéril. Un filtro estéril debe ser instalado entre la línea de alimentación y el puerto de entrada biorreactor para filtrar el medio antes de que entre en el biorreactor.
    3. Conectar la línea de desechos al tubo de salida del biorreactor y el depósito de residuos medio, y asegúrese de que el depósito de residuos tiene una ventilación adecuada con un sterilfiltro e.
  3. Mover el conjunto fuera de la cabina de seguridad biológica (esto probablemente requerirá dos personas para llevar a todos los vasos y tubos), y poner todos los componentes fuera para el cultivo a largo plazo.
    1. Ponga la SSB en la placa de agitación en el interior de la incubadora con los mismos parámetros de cultivo para la formación de esferoides (37 ° C, 5% de CO 2, 100% de humedad y 70 rpm). NOTA: Puede ser necesario desconectar temporalmente los segmentos de tubo de la bioreactor si las líneas tienen que correr a través de agujeros en el lado de la incubadora en lugar de a través de la junta en la puerta. Esto se puede hacer de una manera aséptica envolviendo los extremos de los juegos de tubos con papel de aluminio antes de la esterilización en autoclave (paso 3), y esperando para unir el lado biorreactor de las secciones de alimentación y del tubo de residuos hasta que el biorreactor está dentro de la incubadora. Las líneas de tubo se pueden poner en su lugar, y la lámina de aluminio se pueden retirar dentro de la incubadora y rápidamente se adjuntan al biorreactor.
    2. Ejecutar extremos restantes de juegos de tubos (los que no están conectados a la tapa biorreactor) a través del puerto de acceso incubadora (pass-through), o por medio de una muesca en la junta de la puerta de la incubadora.
    3. Fuera de la incubadora (en una cabina de bioseguridad cerca si es posible), conectar rápidamente la línea de alimentación al depósito de medio fresco, y la línea de los residuos al depósito de residuos medio, y asegúrese de que el depósito de residuos tiene una ventilación adecuada con un filtro estéril. NOTA: Para hacer esto de una manera aséptica, retire el papel de aluminio a partir de los conectores de tubos y de los vasos y se conectan a los vasos respectivos tan pronto como sea posible (especialmente si esta conexión hay que hacer fuera de la cabina de bioseguridad).
    4. Ponga depósito de medio fresco (lleno de medio de alimentación deseada) en el interior cerca del mini-refrigerador. Compruebe que las líneas de alimentación y de desecho son capaces de salir de la incubadora y entrar en el refrigerador sin impedir las puertas de cada cierre. También es fundamental que la alimentación lines no queden atrapados por las puertas cerradas de el refrigerador o la incubadora.
      NOTA: El medio utilizado para estos estudios fue el medio de cultivo de alto estándar de glucosa (500 mg / dl) recomendado por el proveedor para este tipo de células. Cualquier medio-alto de glucosa podría ser utilizado en función de las necesidades específicas del tipo de célula que se está cultivando. La concentración de glucosa del medio de alimentación debe ser razonablemente alta (2x o más) que la concentración deseada en el cultivo como el sistema de alimentación se basa en el aumento de la velocidad de alimentación de medio de alto contenido de glucosa para mantener niveles adecuados de glucosa en los cultivos mientras se mantiene velocidades de alimentación razonables .
    5. A continuación, el contenedor de medios de residuos se puede poner en la mesa de trabajo fuera de la incubadora en un lugar conveniente.
    6. A continuación, coloque la "sección de la bomba" de las líneas de alimentación y de residuos en el cabezal de la bomba garantizar la orientación adecuada para que las líneas de alimentación bombearán medio desde el depósito de medio fresco en el SSB, y las líneas de residuosbombeará medio de la SSB y al depósito de medio de residuos.
  4. Encienda la bomba a la velocidad de avance deseada.
    1. Calcular la velocidad de alimentación utilizando la ecuación de velocidad de alimentación ajustada descrito en la literatura 3 y en la sección de resultados representativos se proporciona a continuación.
    2. Utilice la información más reciente recuento de células (procedimiento descrito en el paso 5), junto con la predicción de crecimiento, y las mediciones de glucosa del medio para estimar la velocidad de alimentación necesaria para mantener la concentración de glucosa en la cultura deseada.
      NOTA: Las velocidades de crecimiento celular y las tasas de consumo de glucosa tendrán que ser obtenido antes de hacer estos procedimientos.
    3. Ajuste la velocidad de la bomba en base a la velocidad de avance calculada.
  5. Repetir el cálculo de la tasa de alimentación y ajustar la velocidad de la bomba para cada punto de muestreo (cada tres días por el método descrito).

6. recuento de células, viabilidad, y Medidas de concentración de glucosa

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  • Recoger muestras de cada biorreactor cada tres días, o como se desee.
  • Tomar muestras de cultivo a partir de cultivos de SSB alimentados de forma continua utilizando el puerto de muestreo especializada se ha descrito anteriormente.
    1. Al salir de la SSB alimentada continuamente dentro del biorreactor, conecte una jeringa estéril (una jeringa de 5 ml de volumen se utilizó para estos estudios) para la conexión no-filtrada del puerto de muestreo.
    2. Mueva el tubo de muestreo hacia abajo en el medio de cultivo.
    3. Desembridar la sección del tubo que va a la jeringa, y extraer el volumen total de la muestra deseada.
    4. Mover el tubo de muestreo de modo que ya no se sumerge en la cultura, y continuar a retirar la jeringa hasta que se elimine el aire.
    5. Sujetar el tubo que alimenta la jeringa, y separar la jeringa que contiene la muestra, y dejar de lado.
    6. Pre-cargar una segunda jeringa estéril fresco con el aire, y se unen a la parte de filtro estéril del puerto de muestreo.
    7. Abra la pinza del tubo que va hacia el lado jeringa de filtro deel puerto de muestreo, y luego purgar el puerto de muestreo al expulsar suavemente el aire de la jeringa a través del filtro estéril. Esto asegura que el puerto de muestreo esté libre de cualquier medio residual.
    8. Vuelva a sujetar el tubo que va al filtro, desconecte la jeringa estéril y desprenderse de ella.
  • Tomar la jeringa que contiene la muestra de células a partir del cultivo, y expulsarlo en un tubo de 10 ml. Submuestras de volúmenes conocidos pueden ser tomadas directamente de este tubo.
  • Para el recuento de células, eliminar un volumen conocido de las células y transferir a un tubo de microcentrífuga, y se centrifuga suavemente durante 1 - 2 min (aproximadamente 50 x gravedad).
  • Transferir el sobrenadante a un tubo separado para las mediciones de glucosa, y volver a suspender el sedimento con el mismo volumen de solución de tripsina-EDTA (0,25% (v) de tripsina / w, EDTA 0,53 mM), y contar por triplicado utilizando un hemocitómetro estándar con tinción con azul tripán como se ha descrito en la literatura 53.
    1. Añadir medio (con suero) ala muestra para la dilución según sea necesario.
    2. Contar las células y calcular la viabilidad celular mediante el registro de células vivas (no teñidas), y las células muertas (teñido) de forma independiente (viabilidad% = células vivas / células totales).
  • Medir los niveles de glucosa del medio, por triplicado, utilizando un medidor de glucosa en sangre y de un solo uso tiras reactivas.
    1. Tomar mediciones de glucosa como se describe en las instrucciones del medidor de glucosa en sustitución del medio de cultivo para sangre.
    2. Sumergir la tira reactiva en el medio a ensayar (recogida de muestras de recuento por encima), y repita para el número deseado de repeticiones (se recomiendan tres repeticiones).
    3. Pon a prueba tanto el medio fresco y medio de residuos para las concentraciones de glucosa.
      NOTA: Para algunos metros, mediciones inferiores a 20 mg / dl (umbral detectable del metro), se puede observar como un error en la salida del medidor.

    • 7. Medidas Asentamiento tarifas Esferoide

    1. Para asegurarse de que el cell agrupaciones no están siendo eliminados por el sistema de alimentación continua, medir la velocidad de sedimentación de esferoides ß-TC6 observando su sedimentación en una gran pipeta de plástico de diámetro.
    2. células de cultivo de ß-TC6 en biorreactores SSB para formar esferoides como se describe anteriormente.
    3. Después de 3 días de cultivo, tomar muestras de 30 ml de la suspensión esferoide y colocar en un tubo de 50 ml.
    4. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo utilizando una amplia pipeta de diámetro 25 ml para distribuir uniformemente en suspensión, y luego se detiene de pipeteado con la suspensión a un nivel conocido en la pipeta (por ejemplo, 20 ml marca), y luego registrar el tiempo para todos los esferoides de conformarse con 5 cm.
    5. Repita este procedimiento las veces suficientes para alcanzar confianza estadística (normalmente n> 3).
      NOTA: Para los estudios biológicos, un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa al comparar las mediciones. Se utilizó el error estándar de la media de los errores de información, y los dos de cola de prueba de t de Student no-emparejadose utilizó para comparar las condiciones de los datos presentados.

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    Representative Results

    Niveles de glucosa del medio y las fluctuaciones de restringir la expansión de la célula en la norma SSB culturas

    Los niveles de glucosa fluctúan en cultivos estáticos y culturas SSB durante todo el periodo de cultivo de 3. Estas fluctuaciones se intensifican a medida que aumenta el número de células durante el periodo de cultivo de 21 días y fueron casi idénticos en ambos cultivos estáticos y SSB. Estas observaciones se presentan en nuestra publicación anterior 3. Los niveles de glucosa pueden ser super-fisiológica para la duración del período de cultivo para ambos métodos. Debido a que esta exposición crónica puede inhibir el crecimiento de células de 54 años, un sistema de alimentación continua se desarrolló para eliminar las fluctuaciones de glucosa y mejorar el control de nutrientes durante el cultivo de esferoides.

    Sistema de alimentación continua para la Cultura del esferoide

    adición continua de medio fresco y la eliminación de medio viejo para la duración del período de cultivose puede lograr usando un sistema sencillo reposición medio. El sistema descrito en el Método 2 y se muestra en la Figura 1 utiliza una bomba y conjunto de tubo para reponer continuamente medio y un tubo de salida por separado para eliminar continuamente medio, mientras que la prevención de la eliminación de los esferoides del cultivo. La entrada del medio estaba en el lado opuesto del reactor para reducir al mínimo cualquier posibilidad de interferir con el funcionamiento correcto de la OT, y para permitir la mezcla completa. medio fresco (con alto contenido de glucosa, 450 mg / dl) se mantuvo a la temperatura del refrigerador para asegurar la estabilidad a largo plazo y añade continuamente a la cultura a través de una entrada del medio con una tasa de sustitución medio completo cada tres días para reponer los nutrientes. Este sistema limita las manipulaciones e intervenciones requeridas durante el periodo de cultivo mediante la sustitución del proceso de sustitución medio discontinuo manual con un proceso continuo 3,22,23. El medio frío entró en el biorreactor en pequeños volúmenes más de time (0,046 ml / min) en relación con el volumen total del cultivo (200 ml), dando a cada "Drop" de tiempo medio añadido para equilibrar la temperatura con el medio de cultivo circundante que estaba a 37 ° C. Esto aseguró que el medio frío añadido no redujo la temperatura global de cultivo se mantiene dentro de la incubadora. La agitación del medio de cultivo también aumentó la eficiencia de transferencia de calor, y mejoró la uniformidad de temperatura en estos cultivos. mantenimiento de la temperatura podría ser un problema si se utilizan muy altas velocidades de avance con pequeños volúmenes de cultivo, pero estas condiciones improbables no fueron probados para estos estudios. El volumen de cultivo se mantuvo a un nivel constante en el sistema de alimentación continua, asegurando que la velocidad de eliminación medio promedio fue igual a la tasa de alimentación. El sistema utilizado para estos estudios realmente retirados medio a una velocidad de flujo mayor que la velocidad de alimentación debido a que la sección de tubo de eliminación usa tubería de mayor diámetro de la sección de la bomba. A pesar de la remo más rápidotasa val, el volumen de cultivo se mantuvo mediante el ajuste del nivel del tubo de salida en el interior del reactor al nivel de volumen de cultivo deseado. adición continua de medio fresco a la SSB dio lugar a un pequeño aumento en el nivel medio en el reactor, y cuando el medio alcanza el nivel de la OT, se retiró el medio del reactor a un ritmo más rápido. Se retiró el medio a través del vidrio poroso OT, dejando a los esferoides de células en cultivo hasta que el nivel medio cayó por debajo de la parte inferior de la OT. Este sistema evita la complejidad del uso de sensores de flujo y volumen tenues para controlar las velocidades de la bomba, y es el estándar para su uso con aparatos cultura basada muchos SSB 47,48. El OT fue diseñado para asegurar que los esferoides no se eliminaron a partir del cultivo a través del circuito de eliminación, y el tamaño de poro y la densidad en el tubo de vidrio poroso eran lo suficientemente grandes (40% y 40 - 60 micras, respectivamente) para asegurar que la velocidad de flujo lineal fue menor que la velocidad de sedimentación de los EE.UU. esferoidesed para estos estudios de cultivo. El flujo lineal se calculó como se describe en detalle 3. La velocidad lineal media medio a través de los poros de la OT se calculó que era 0,17 cm / min y esto fue mucho más lento que la velocidad de sedimentación esferoide observada más lento. La velocidad media de sedimentación se midió como se describe en el método de 7 y era 2,53 ± 0,26 cm / min para los esferoides utilizadas en estos estudios. Se observaron los esferoides para aumentar de tamaño a medida que avanza la cultura, y estos esferoides más grandes se establecieron más rápido debido a su mayor proporción de masa-arrastre, que se redujo aún más la posibilidad de la eliminación a través de la OT. Algunos esferoides fueron atrapados en los poros más bajas en los bordes exteriores de la OT, pero esto se debió principalmente a impactos mecánicos cuando el tubo de salida se sumerge en el medio agitado. Esto no impidió que la función apropiada del AT, y no contribuye a una pérdida medible de esferoides en los cultivos probados. El OT para estos estudios fue limpiado después de cada estudio, (con DI descarga de agua), y se sustituye después de su uso para dos estudios de cultivo para evitar el riesgo de disminución de la función. El OT podría ser reemplazado después de cada estudio si se observan esferoides a obstruir los poros durante un estudio específico (esto no se observó en el trabajo presentado). Debido a la eliminación cíclica de medio utilizando este método, el volumen de medio de cultivo fluctuó por tanto como 6%. Las fluctuaciones fueron causadas por la tensión superficial del medio que permitió la OT para eliminar un poco más de medio después de que el nivel medio promedio cayó por debajo de la parte inferior de la OT.

    La eliminación de las fluctuaciones de nutrientes Crecimiento Celular mejorado en SSB culturas

    Continuamente sustituyendo el medio en cultivos de SSB utilizando el sistema descrito anteriormente aumento de los rendimientos de cultivo durante el periodo de cultivo de 21 días en comparación con los cultivos estándar SSB. La velocidad de alimentación se mantuvo constante durante todo el periodo de cultivo a una velocidad que sustituirá la totalidad del volu culturayo cada tres días para ser comparables a las culturas SSB por lotes alimentados. La eliminación de las fluctuaciones de nutrientes como resultado un aumento en los rendimientos celulares (Figura 3) a pesar de la alta concentración de glucosa 3. Tamaño de esferoides también se midió al final del periodo de cultivo mediante una evaluación microscópica 2D (microscopía de luz estándar descrito en la literatura 3), y los esferoides en cultivos CF-SSB fueron significativamente mayores (p <0,02, t de Student prueba) que, en estático o culturas estándar SSB como se informa en la literatura 3. Estas observaciones confirman los datos de recuento de células que sugieren una mayor tasa de crecimiento en cultivos CF-SSB, mientras que la viabilidad se mantuvo en el mismo nivel alto (96,23 ± 0,85%), independientemente de la condición de cultivo. El SSB alimenta continuamente (CF-SSB) sistema de cultivo elimina las fluctuaciones de nutrientes en los cultivos de esferoides, y mejoró las tasas de crecimiento de las células, pero los niveles de glucosa se mantuvo super-fisiológica que posiblemente impidió incluso más imp rovement en la expansión de células (Figura 2). Para mejorar aún más en el sistema de cultivo CF-SSB, un algoritmo se utilizó para ajustar la velocidad de avance durante el período de cultivo, con el objetivo de mejorar el control de los niveles de glucosa en cultivos de SSB.

    Cálculo de la tasa ajustada RSS

    Hay varios factores que pueden ser considerados para el cálculo de la velocidad de alimentación para mantener los niveles de glucosa consistentes. Los factores específicos de interés pueden ser alterados para un estudio determinado y para una línea celular específica. Para el propósito de esta demostración, se consideró que la tasa de crecimiento y el consumo de glucosa, determinado a partir de cultivos anteriores, así como los niveles de glucosa reales en el momento de ajuste 3. los ajustes del tipo de alimentación se pueden hacer en cualquier intervalo de tiempo. Para esta demostración, se recogieron muestras y la velocidad de alimentación se ajustó cada tres días sobre la base de los cálculos secuenciales descritos como sigue.

    t "> Cálculo de la tasa de crecimiento pronosticada

    La ecuación 1 predice que el crecimiento de las células durante un determinado período de cultivo, con el recuento de células predicho (N 2) que representa el número total esperado de células en cultivo en algún momento en el futuro. Este método utiliza una aproximación tasa de crecimiento lineal en el que se añade el recuento de células actual (N 1) a la tasa de crecimiento estimada de las células en cultivos esferoides (R g) multiplicado por el periodo de cultivo (t 2 -t 1).

    Ecuación 1 (1)

    Velocidad de alimentación de línea de base calculada

    La velocidad de alimentación de referencia (R F) se calculó utilizando la ecuación 2 por la estimación de la glucosa consumida en el cultivo durante el periodo de cultivo (numerador) y dividiéndolo por la concentración de glucosa en el medio de alimentación (C F 1) por la media ponderada de N 1 y N 2 de la ecuación 1. A continuación, esta tasa de consumo se dividió por la concentración de glucosa (C F) en el medio de alimentación para calcular la tasa de alimentación del medio promedio necesario para reemplazar la glucosa consumida durante el mismo período de cultivo.

    Ecuación 2 (2)

    Ajuste de Velocidad de alimentación con niveles de glucosa observados

    Otros se hicieron ajustes a la velocidad de alimentación de la línea de base para dar cabida a los niveles de glucosa medidos (C 1) en el punto de tiempo elegido utilizando la ecuación 3. Esta tasa de alimentación de glucosa-ajustado (GAFR) se puede utilizar para mantener los niveles cuando los cambios inesperados en el crecimiento o la muerte ocurrir en el cultivo. este equatio n incorpora una constante de control (X), y se utilizó un valor de 0,5 para estos datos 3. C 1 representa la concentración de glucosa medida en el medio de cultivo en el día de la muestra, y C D representa la concentración de glucosa del medio de destino. El valor final se ajusta la velocidad de alimentación predicha a partir de la segunda cálculo.

    Ecuación 3 (3)

    Figura 1
    Figura 1: Diagrama de sistema de alimentación continua con el tubo de salida. (A) Diagrama del sistema demostrada. (B) filtro de vidrio poroso se coloca en el tubo de flujo de salida para permitir medio a ser removido de la cultura sin pérdida de células. Figura reproducida con autorización. 3

    /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
    Figura 2:. Las mediciones de glucosa para SSB, CF-SSB, y se ajustó culturas CF-SSB (A) mediciones de glucosa en medio procedente de cultivos de esferoides ß-TC6 utilizando, los métodos estáticos de cultivo SSB, y CF-SSB y se alimentan con medio alto estándar de glucosa. La alimentación continua es capaz de eliminar las fluctuaciones de la glucosa, pero los niveles promedio de glucosa en el cambio de medio de manera espectacular durante el periodo de cultivo, y muy por encima del rango fisiológico (indicado por la barra gris). La alimentación ajustada es capaz de eliminar las fluctuaciones, así como mantener las concentraciones de glucosa cerca de los niveles fisiológicos para la duración del período de cultivo. Las barras de error para las mediciones de glucosa son demasiado pequeños para ser visibles en la escala que se muestra (Error Estándar ≤ 4% para todas las mediciones). Los datos de las figuras se presentan en la publicación anterior con el permiso. 3


    Figura 3: Los recuentos de células de SSB, CF-SSB, y se ajustó culturas CF-SSB con un crecimiento ajustado de alimentación velocidades de crecimiento celular reportó como factor de cambio en el número de células durante el periodo de cultivo de 21 días comparando SSB con cambios de medio regulares contra velocidad de alimentación constante. culturas y culturas SSB SSB ajuste del avance. Las barras de error informan el error estándar de la media, y los valores de p son reportados para una prueba estadística no-emparejados de dos colas de t de Student. Reproducido con permiso. 3

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    Discussion

    Generación de productos de células de mamíferos para la producción de agentes biológicos y para las terapias con células requiere la cultura y el seguimiento de las células de mamífero en gran escala 55-58. Además, estas aplicaciones requieren condiciones de cultivo definidas y validadas. Simplemente aumentando el volumen de las células utilizando tecnologías de investigación no va a cumplir con todos estos requisitos. cambios de medio manuales que causan fluctuaciones en nutrientes y la acumulación de productos de desecho reducen la calidad celular, viabilidad y rentabilidad. El uso de biorreactores está bien establecido para el cultivo comercial de microorganismos para aplicaciones biofarmacéuticas, y estrategias similares se han aplicado a los cultivos de células de mamíferos. La compleja interacción de células de mamífero con su entorno requiere modificaciones específicas para regular los niveles de nutrientes con el fin de optimizar el potencial de expansión celular.

    Para hacer frente a estos problemas, hemos desarrollado un straightforward método para mantener los niveles de glucosa en un rango objetivo específico, se aproxima a los niveles fisiológicos en un biorreactor suspensión agitada con un mecanismo de alimentación de la perfusión de tasa ajustable. Para lograr esto, esferoides de una línea de células beta se generaron en un biorreactor suspensión agitada. Se empleó un sistema de alimentación de perfusión para proporcionar un mecanismo de alimentación continua para reemplazar los procedimientos de alimentación por lotes estándar. Se observaron tasas de crecimiento de la célula, y se utilizaron para predecir las tasas aproximadas utilizar la glucosa. Los niveles reales de glucosa también se midieron en el tiempo en cultivo para ajustar las velocidades de alimentación en respuesta a nutrientes real consumida y los productos metabólicos depositados en el medio por las células. Este método impide las fluctuaciones en los niveles de glucosa observados con otros sistemas estáticos y SSB 3, donde los niveles de glucosa fluctuaron dramáticamente con cambios de medio cada 3 días. El uso de las estrategias de lotes de alimentación, las concentraciones de glucosa cayeron tanto como 275 mg / dl durante tres días, en la etapa tardías en la expansión de 21 días. Estas fluctuaciones en los niveles de glucosa limitados rendimiento celular.

    Cálculo de la tasa de sustitución medio para la demostración del sistema de alimentación ajustado incorporado una tasa de crecimiento establecida y la tasa de consumo de glucosa para la línea celular, así como los observados (medidos) densidades de cultivo y los niveles de glucosa en cada punto de tiempo de la alimentación. Para los diferentes tipos de células, o para sistemas de cultivo de tejidos más complejos, estos supuestos pueden no ser cierto. Para garantizar un control más preciso de la glucosa, el algoritmo también incluye un sistema de control de retroalimentación para dar cuenta de la variabilidad de los cultivos individuales. Limitaciones de un método de perfusión en base a la tasa de crecimiento por sí solo, incluyendo el impacto de la heterogeneidad en la utilización de la glucosa por las células a través de los esferoides y los cambios en el consumo de glucosa en base a parámetros tales como la diferenciación de las células madre, pueden ser mitigados por un sistema de control de retroalimentación. Dependiendo de la aplicación, las células que exhiben Exponelas tasas de crecimiento ntial o perfiles de crecimiento más complejos podrían ser implementadas para mejorar el rendimiento de los algoritmos. Los supuestos y los valores utilizados para los cálculos de la tasa de alimentación se pueden alterar para cumplir con las condiciones de cultivo reales.

    Los métodos presentados están destinadas a producir células para una aplicación terapéutica en la que la expansión y la cultura de esferoides serían para una duración finita, y las células en sí son el producto .. Puede ser deseable para algunos investigadores a ampliar de forma continua o el uso de células de cultivo un método similar, pero esto podría presentar otros retos que no se encuentran para estos estudios. Si cultivado durante períodos prolongados, los esferoides se continuará creciendo en tamaño, y la viabilidad de algunas células en el núcleo del esferoide pueden sufrir debido a la creciente de nutrientes y de difusión de oxígeno limitaciones. Estos cultivos pueden requerir manipulaciones adicionales para disociar grandes esferoides para evitar esta limitación cuando se desean cultivos a largo plazo.No se observó disminución de la viabilidad de esferoides generados con este protocolo, lo que sugiere que no se alcanza este límite durante el período de cultivo de 21 días de este estudio.

    Para terapias celulares, estas técnicas podrían ser utilizados en combinación con sistemas de regulación adicionales para mejorar el rendimiento de células, la función y viabilidad. Por ejemplo, el método de SSB podría combinarse con tecnologías que facilitan incluyendo cultivos de superficie micro-portadores para células adherentes para mejorar las tasas de crecimiento celular, o la encapsulación de las células o esferoides. Además, los algoritmos de ajuste más complejos podrían implementarse para proporcionar un control más estricto de cultivo. Ajuste de alimentación se podría combinar con el control de varios otros parámetros, tales como pH, concentración de oxígeno disuelto, la temperatura, y la inyección de reactivos para mejorar aún más 59,60. Para mejorar los resultados en otras aplicaciones, este método podría ser automatizado 15,24, y velocidades de alimentación se puede calcular mmineral o con menor frecuencia, otras condiciones de cultivo de refinación.

    Procesos de fabricación 61 - 63 serán definidas y controladas para hacer que los productos biológicos reproducibles. El uso de sustitución medio continuo puede ser utilizado para mitigar las fluctuaciones en nutrientes críticos observados en la producción de células a gran escala, y la incorporación de un sistema de alimentación ajustable puede aplicar aún más control en el entorno de la célula, para mantener los niveles de nutrientes deseados. El método descrito se podría utilizar con otras células de mamífero para ambos productos celulares y farmacéuticas.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    β TC-6 Cells ATCC, Manassas, VA CRL-11506 Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)
    DPBS No Ca, No Mg Invitrogen, Carlsbad, CA 14190-144 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles Medium Invitrogen, Carlsbad, CA See below for product numbers 
    DMEM High Glucose (500 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11965-092 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11885-084 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)
    L-glutamine Invitrogen, Carlsbad, CA 25030081 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
    Sodium Pyruvate Invitrogen, Carlsbad, CA 11360070 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
    Heat Inactivated Porcine Serum Gibco - Life Technologies 10082147 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTA Invitrogen, Carlsbad, CA 25200056 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
    T-150 Tissue Culture Treated Flasks Corning, Corning, NY 430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    &categoryname=
    NuAire Cell culture incubator Princeton, MN US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used.
    Centrifuge Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)
    Refrigerator Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)
    1 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-1L Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    &categoryname=
    2 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-2L Any vendor could be used
    250 ml stirred bioreactors  Corning, Corning, NY 4500-250 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)
    &categoryname=
    Stir Plate Fisher Scientific 11-496-104A Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor
    Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) 1256598  Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)
    FALCON 50 ml Conical Tubes Falcon, San Jose, CA 1256598 Any vendor could be used
    Delran Plastic Used for Custom Parts McMaster Carr Various Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    Stainless Steel Pipe for custom lids McMaster Carr Various Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding Custom made Not aware of any vendors producing a similar product
    Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding Custom made Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below.
    Masterflex Digital Peristaltic Pump Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-77919-25 Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF Tubing Connectors (various) Cole Parmer, Vernon Hills, IL see link Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT Tubing L/S 16 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-16 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L/S 14 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-14 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-13 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-13
    Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) Fisher Scientific SLGP033RS Any vendor could be used
    25 ml Graduated Pipette Fisher Scientific 13-678-11 Any vendor could be used, and various sizes may be used
    Pipetter Fisher Scientific 13-681-15E Any vendor, or similar product could be used
    Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6 Any vendor, or similar product could be used
    Trypan Blue Gibco - Life Technologies 15250-061 Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Inverted Light Microscope Leica Any vendor, or similar product could be used
    One Touch Ultra Blood Glucose Meter Fisher Scientific 22-029-293 Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)
    One Touch Ultra-Strips Fisher Scientific 22-029-292  Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)

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    References

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