Introduction
Hartklepaandoeningen is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en sterfte in de Westerse wereld; de prevalentie stijgt met de leeftijd en bij meer dan 10% van de bevolking 75 jaar en ouder 1. De kleppen van de systemische deel van het hart, de aorta en mitralis kleppen, meestal beïnvloed. Hartklepaandoeningen wordt gekenmerkt door het verlies van de goed georganiseerde structuur van de kleppen, waardoor de verandering van de mechanische eigenschappen 2. De structurele integriteit is dus cruciaal voor het functioneren van de klep.
De bladen van de klep bestaan uit valvulaire interstitiële cellen (VIC), valvulaire endotheelcellen (VEC) en extracellulaire matrix, die sterk georganiseerd een gelaagd patroon 3,4. De VIC zijn verantwoordelijk voor de synthese van ECM afbraak en organisatie. Factoren die voortvloeien uit de bloedbaan, EC of die in de ECM-act op het VIC orkestreren van zijn functie. Daarnaast,mechanische krachten op de folder tijdens de cardiale cyclus resulteert in een laminaire of oscillerende shear stress, druk- of trekspanningen het gedrag van VIC 5 beïnvloeden.
Om te begrijpen hoe de structuur van de klep wordt geregeld, moet eerst worden begrepen hoe VIC's reageren op de gevarieerde set van stimuli ervaren tijdens de cardiale cyclus. In vitro studies hebben zeer informatief over de kenmerken en mogelijkheden van de valvulaire cellen geweest. De respons van deze cellen in vitro, kan echter niet altijd goed mogelijk de in vivo reactie 6 bootsen; bijvoorbeeld de reactie van VIC op stimuli is afhankelijk van de aanwezigheid van EC en de ECM samenstelling 5. Bovendien is de respons van de valvulaire cellen op prikkels is afhankelijk van de specifieke locatie in de bijsluiter 7. Naast biochemische stimuli, is het gedrag van de valvulaire cellen bepaald door mechanische krachten on de klep 8. Elke regio van de klep wordt blootgesteld aan zijn eigen specifieke set van hemodynamische stress. Hoewel huidige ex vivo modellen hebben aangetoond dat mechanische krachten zijn belangrijke determinanten van valvulaire structuur 5, de bijbehorende mechanismen zijn nog onduidelijk. Terwijl in vivo modellen inzicht hebben gegeven in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan valvular ontwikkeling 9,10, inzichten in volwassen valvulaire biologie is nog steeds ongrijpbaar.
Daarom werd een ex vivo stromingsmodel ontwikkeld waarbij de hartkleppen kunnen worden gekweekt in hun natuurlijke positie in het hart langere tijd 11. Dit heeft het voordeel dat de kleppen blijven in hun natuurlijke configuratie en de VIC ervaren dezelfde omgeving als in vivo, waardoor de VIC respons zo natuurlijk mogelijk stimuli. Daarnaast is de cultuur van de kleppen in hun natuurlijke positie in het hart vergemakkelijkt het onderwerpen van elkvalvulaire regio om de relevante hemodynamische spanningen. In dit ex vivo model, dat wil zeggen, de miniatuur Tissue Culture System (MTCS), de kleppen kunnen worden onderworpen aan verschillende biochemische en hemodynamische stimuli waardoor het onderzoek naar hun rol in hartklep remodeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt het LUMC richtlijnen van het dier het onderzoek ethische commissie.
1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Medium en MTCS
Opmerking: Voer alle voorbereidingen in de laminaire stroming kap. De MTCS perfusie kamer, bel val en stand worden beschreven in Lieber et al., 2010 11.
- Ontsmet de tang en micro-schaar met 70% ethanol. Bereid een 5 ml spuit met 21 G naald met steriele Tyrode's buffer (130 mM NaCl, 5,4 mM KCI, 6,0 mM Hepes, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2PO 4, 20 mM glucose, 1,5 mM CaCl 2 .2H 2 O, pH = 7,2). Bereid een 5 ml spuit met 21G naald met steriele KCl-oplossing (100 mM).
- Bereid 65 ml medium per hart: DMEM aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, antibiotica / antimycotische (A / A, 100 eenheden penicilline, 100 ug streptomycine en 0,25 pg amfotericine B / ml), insuline-Transferrin-Selenium (ITS; 10 ug / ml insuline, 5,5 gg / ml transferrine, 6,7 ng / ml natriumseleniet) en filter steriliseren.
- Steriliseren van de perfusie kamer en bubble val door te besproeien met 70% ethanol en droog met keukenpapier. Monteer de MTCS (figuur 1D), maar aanvankelijk zonder perfusie kamer. Plaats de bel val op de stand. Gebruik een peristaltische roller pomp met easy-load pompkoppen.
- Gebruik siliconenslang maken verbindingen tussen het reservoir (50 ml buis) en de pomp, de pomp en de opvanginrichting, de opvanginrichting en het reservoir (zie figuur 1D). Maak de buis in de couveuse lang genoeg om gemiddelde tot gas evenwicht te bereiken met het gas in de incubator door de gasdoorlatende siliconenslang (1 m) en de buis buiten de incubator zo kort mogelijk.
- Vul de 50 ml buis met 70% ethanol, zet de pomp (stroomsnelheid ongeveer 1 ml / min tot een goede circulatie mogelijk te maken) en laat de ethanol cirkeningen gedurende 30 min om alle buizen steriliseren. Verwijder de ethanol ledigen van het reservoir en uitpompen de ethanol uit het systeem.
- Vul de 50 ml buis met steriel gedestilleerd water, zet de pomp en laat het water circuleren gedurende 30 minuten om zich te ontdoen van de resterende ethanol. Verwijder het water door het legen van het reservoir en pompen het water uit het systeem.
- Vul de 50 ml buis met 45 ml medium, zet de stand in de couveuse. Schakel de pomp (stroomsnelheid ongeveer 1 ml / min) en circuleren het medium voor alle buizen te vullen Verwijder luchtbellen en laat het medium aan te passen aan de gassamenstelling in de incubator gedurende ten minste 1 uur. Handhaaf de incubator bij standaard weefselkweek condities (5% CO2 en 37 ° C). Zorg dat er geen luchtbellen in de slang zijn.
2. Isolatie van Mouse Heart
- Injecteer de muis met 500 eenheden van heparine. Dit voorkomt dat het bloed stolt en maakt het verwijderen van de blood uit het hart. Na 10 min, verdoven de muis in een inductie kamer met 4% isofluraan met een precisie vaporizer. De anesthesie is voldoende als de muis niet reageert op teen knijpen.
- Breng de muis een dissectie board en verdoving te handhaven door middel van een gezichtsmasker verbonden met een coaxiale circuit. Ontsmet de vacht van de muis met 70% alcohol. Met een schaar opent de buikholte om de vena cava bloot te leggen en het middenrif.
- Naar het hart bloot te leggen, maken laterale incisies vanaf de laatste naar de eerste ribben en weerspiegelen de borstkas over het hoofd muis. Stop de narcose een muis is niet meer ademen. Let op de hartslag.
- Breng het 21G naald bevestigd aan een 5 ml spuit met steriel Tyrode buffer in de inferior vena cava van de buik in de borstholte (via membraan). Zorg ervoor dat het bloed kan verlaten van de vena cava staartvin van de naald inbrengen. Perfuseren the Tyrode Buffer voorzichtig en met constante druk in de vena cava, totdat het hart verliest gedeeltelijk zijn rode kleur. Opmerking: Het hart blijft kloppen waardoor het verwijderen van het bloed uit het hart.
- Vervang de naald met de 21G naald bevestigd aan een 5 ml spuit met een steriele KCl oplossing. Perfuseren voorzichtig de KCl oplossing in de vena cava, totdat het hart stopt met kloppen en verwijder de naald. Opmerking: De KCl oplossing bewaart het hart in de ontspannen diastolische fase, die gemakkelijker inbrengen van de naalden perfusie en perfusie van het coronaire systeem zal toestaan.
- Til het hart met behulp van gebogen pincet en met een schaar ontleden het hart vrij is van het omringende weefsel, maar laat slagaders en aders proximale naar het hart intact en bevestigd aan het hart. Breng het hart een 15 ml buis met ijskoude PBS gesupplementeerd met antibiotica / antimycotische (A / A). Bewaar het hart in ijskoude PBS gedurende maximaal 3 uur.
3. Cannulation van de Muis Harten in de perfusie kamer
- Voer alle procedures in de laminaire stroming kap. Breng het geïsoleerde hart van de 15 ml buis met een 10 cm Petrischaal en voeg PBS aangevuld met A / A.
- Onder een stereomicroscoop, met de micro schaar en forceps om alle niet-cardiaal weefsel te verwijderen maar behoudt de omhooggaande aorta tenminste de vertakking van de brachycefale slagader en de pulmonaire aders, 2 mm proximaal van het hart. Snij het puntje van de apex van het hart om toegang tot het linker ventrikel lumen (typisch 2 mm) te maken. Plaats de perfusie kamer in de stroomkap onder de stereomicroscoop.
- Bevestig een injectiespuit van 5 ml met medium tot de insert naald met behulp van de silicone. Vul het perfusie kamer met 20 ml medium en zet het hart op de rotatie stadium tussen de 2 afgestompt naalden in de perfusie kamer (figuur 1). De hoogte van de rotatie-fase, zodat het hart wordt geplaatst vóór denaalden.
4. Ligatie voor het kweken van de mitralisklep (zie figuur 1)
- Ligeren de aorta met hechtdraad (zijde 7.0). Ligeren de linker hartoor met hechtdraad. Steek de naald (nr. 1 in figuur 1) door de longader in het linkeratrium en ligeren met hechtdraad proximaal om hem in het linker atrium. Zorg ervoor dat de naald niet te ver in de linkerboezem, omdat dit de mitralisklep zou beschadigen.
- Steek de naald (nr.2 in figuur 1) met een lineaire beweging in de linker ventrikel. Breng het medium van de perfusie kamer naar een 50 ml buis. Verzegeling van de naald naar de hartspier met biocompatibele lijm.
- Nadat de lijm droog is, zorgvuldig te injecteren medium in het hart door het aansluiten van een middelgrote spuit om de naald nr.1 en controleer of er een lekkage. Ervoor te zorgen dat medium verlaat naald nr.2 en de laatst overgebleven bloed doorbloed uit het hart.
5. Liplichting voor kweken van de aortaklep (zie figuur 1)
- Steek de naald (nr.1 in figuur 1) in de aorta en ligeren met hechtdraad. Zorg ervoor dat de naald niet te ver in de aorta omdat dit de aortaklep zou beschadigen. Steek de naald (nr.2 in figuur 1) met een lineaire beweging in de linker ventrikel. Breng het medium van de perfusie kamer naar een 50 ml buis. Verzegeling van de naald naar de hartspier met biocompatibele lijm.
- Nadat de lijm droog is, zorgvuldig te injecteren medium naar het hart door het aansluiten van een middelgrote spuit om de naald nr.2 en controleer of er een lekkage. Ervoor te zorgen dat medium verlaat naald nr.1 en de laatst overgebleven bloed doorbloed uit het hart.
6. Plaats perfusie kamer op Tribune
- Vul perfusie kamer met de 20 overgebracht medium ml. Plaats pakking en deksel op de kamer en draai met wasmachine en schroeven.
- Verwijder de verzamelde MTCS van incubator. Bevestig de perfusie kamer op de stand. Sluit de buis (zie figuur 1D). Plaats de stand in de incubator (5% CO2 en 37 ° C). Sluit de slang op de pomp. Zet de pomp met stroomsnelheid ongeveer 600 ul / min.
- Zorg ervoor dat in het reservoir en / of de opvanginrichting het niveau van het medium maakt de visualisatie van de aanwezigheid van de stroming door het vallen van het inkomende medium daalt. Na kweek wordt het hart uit het systeem verwijderd, gefixeerd en verwerkt voor histologisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De aortaklep (figuur 2) of mitralisklep 11 kunnen worden gekweekt gedurende ten minste 3 dagen. Door kweken in de open stand (waarin de systolische positie voor de aortaklep en de diastolische functie van de mitralisklep voorstelt), valvulaire cellen levensvatbaar blijven. Nr celdood wordt waargenomen, zoals bepaald door de afwezigheid van TUNEL-positieve cellen (figuur 2 H, I) of gesplitst caspase-3 expressie (niet getoond en Lieber et al., 2010 11). Het collageen verdeling (zoals gevisualiseerd door Masson trichroomkleuring) is vergelijkbaar met de natieve toestand indien gekweekt in 1% serum (figuur 2D, E). De kleppen reageren op veranderende kweekomstandigheden. Het verhogen van de hoeveelheid serum tot 10% resulteert in dikkere bladen (figuur 2C). Bovendien wordt een duidelijke collageen vrij gebied waargenomen bij de ventriculaire kant van de bijsluiter bij de bevestiging aan de aortawand (pijl in figuur 2F
Figuur 1. De miniatuur Tissue Culture systeem. (A) In de perfusie kamer het hart is tot op de rotatie podium en geligeerd met het afgestompte naalden aangeduid met nr.1 en nr.2. (B) perfusie kamer wordt op de standaard gemonteerd. (C) Schematische tekening van het hart bij het kweken van de mitralisklep (links) of aortaklep (rechts). (D) Schematische tekening van de opstelling van de ex vivo stroomsysteem voor aortaklep cultuur. Dit cijfer is gedeeltelijk gewijzigd ten opzichte van eerdere studie 11. Klik hier om een grotere versie te bekijken of dit cijfer.
Figuur 2. Histologische analyse van gekweekte afsluiters 2 maanden oude muizen. (AC) heamatoxylin en eosine (H & E) (DF) Masson trichroomkleuring en GI) TUNEL kleuring van een niet-gekweekte aortaklep (A, D, G), een aortaklep gekweekt in aanwezigheid van 1% serum (B, E , H) of 10% serum (C, F, I) gedurende 3 dagen in het MTCS. De klep gekweekt met 1% serum lijkt vergelijkbaar met de niet-gekweekte klep terwijl de klep gekweekt met 10% serum dikker (C) en heeft een veranderde ECM patroon (F). Geen apoptose waargenomen in de kleppen (GI). Schaal bar is 100 um. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in kweken van cardiale muis kleppen omvatten het maken van de tijd tussen excisie van het hart van de muis en de ligatie in de perfusie kamer zo kort mogelijk de levensvatbaarheid en ligatie van de naalden waarborgen loodrecht op de kleppen juiste richting van de doorstroming . Bovendien, het controleren van de flow na ligatie in de perfusie kamer zonder medium zorgt voor een goede inbrengen en ligatie van naalden. Het is cruciaal om een steriele cultuur en het voorkomen van luchtbellen in de slang, die aanleiding zouden kunnen komen te zitten in het hart belemmeren van de stroming.
Het totale volume medium voor perfusie van een hart 45 ml (merk op dat het medium dat wordt geperfuseerd via het hart niet in contact met 20 ml medium in de perfusie kamer). Voor de toevoeging van bijvoorbeeld virussen een kleiner volume kan de voorkeur. Temporeel het reservoir (en een deel van de buis) kan uit het circuit worden verwijderd leaving 5-7 ml in het systeem om infectie van de afsluiter mogelijk maken.
De afwezigheid van hartslag kan worden beschouwd als een beperking. Echter, het mogelijk maken van een experimentele conditie waarbij alle stimuli aan het leaflet constant kan worden gehouden. Dit biedt de unieke mogelijkheid om het effect van een enkele modificatie bestuderen. Bij het verplaatsen kleppen nodig, kan een pulserende stroming ontstaan.
Om de valvulaire biologie en de rol van moleculaire, cellulaire en mechanische stimuli op de afsluiter te bestuderen, kunnen aanpassingen eenvoudig aan het kweeksysteem. Moleculaire modificatie kan worden bereikt door toevoeging van groeifactoren, chemische verbindingen en virussen mediëren genafgifte 11 de perfusie medium. Een of meerdere celtypen kunnen aan het perfusiemedium de invloed van deze cellen op valvulaire biologie of hun bijdrage aan de klep te onderzoeken. De invloed van oxidatieve stress of hypoxie kan wordenonderzocht door het veranderen van de zuurstof- druk in het kweekmedium. De hemodynamische spanningen op de kraan kan worden gevarieerd door de stroomsnelheid, stroomrichting, pulsatiliteit stroming en de viscositeit. De algehele morfologie kan worden onderzocht (Figuur 2B, C) van H & E, histochemische en immunofluorescentiekleuring. Daarnaast is de organisatie en de samenstelling van de ECM, het fenotype, proliferatie en levensvatbaarheid van de valvulaire cellen en de activatie van signaalwegen geven inzicht in de effecten van variërende deze voorwaarden. Genetisch gemodificeerde muizen kunnen worden gebruikt om de endotheelcellen te volgen, met behulp endotheliale reportermuizen (via de Tie2-Cre en floxed reporter muizen) die de aanwezigheid van endotheliale naar mesenchymale transformatie of muizen met winst of verlies van functie van specifieke signaleringsroutes. Overall, de hier gepresenteerde systeem is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van cardiale valvulaire biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N.
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
