Summary
هنا، نقدم بروتوكول لدراسة غزو الخلايا السرطانية إلى أجزاء يعيشون الأنسجة الطبيعية في ثلاثة أبعاد. يتم تطبيق هذه التقنية الثقافة الجهاز أساسا لاختبار الأدوية محتملة مكافحة الغازية في المختبر.
Abstract
الهدف من الفحص الفرخ القلب هو تقديم طريقة ثقافة الأجهزة ذات الصلة لدراسة غزو الورم في ثلاثة أبعاد. الفحص يمكن التمييز بين الخلايا الغازية وغير الغازية، ويمكن دراسة آثار مركبات الاختبار على غزو الورم. الخلايا السرطانية - إما المجاميع أو خلايا مفردة - نواجه شظايا الجنينية الفرخ القلب. بعد ثقافة الجهاز في تعليق لبضعة أيام أو أسابيع قليلة يتم إصلاح الثقافات مواجهة وجزءا لا يتجزأ من البارافين للتحليل النسيجي. ثم يتم بناؤها التفاعل ثلاثي الأبعاد بين الخلايا السرطانية والأنسجة الطبيعية من مسلسل أقسام ملطخة الهيماتوكسيلين يوزين أو بعد تلطيخ المناعى للالحواتم في أنسجة القلب أو الخلايا السرطانية التي تواجه. الفحص يتسق مع مفهوم حديث أن غزو السرطان هو نتيجة التفاعلات الجزيئية بين الخلايا السرطانية وعناصرها المضيف انسجة المجاورة (myofibroblasts، endothخلايا elial، مكونات المصفوفة خارج الخلية، وما إلى ذلك). هنا، يتم تقديم هذه البيئة انسجة على الخلايا السرطانية مثل جزء الأنسجة الحية. دعم الجوانب لأهمية الفحص متعددة. الغزو في الاختبار هو وفقا للمعايير غزو السرطان: الاحتلال التدريجي والاستبدال في الزمان والمكان من النسيج المضيف، والغازية وغير الغازية في الجسم الحي من الخلايا التي تواجه يرتبط عموما مع نتائج الفحص. وعلاوة على ذلك، فإن نمط غزو الخلايا في الجسم الحي، كما تم تعريفها من قبل الأطباء، وينعكس في الصور النسيجية في الفحص. الكمي علاقة هيكل النشاط (QSAR) تحليل النتائج التي تم الحصول عليها مع العديد من المركبات العضوية يمكن أن تكون متجانسة مكافحة الغازية يسمح للدراسة العلاقات هيكل النشاط لمركبات الفلافونويد والجالكونات، والعقاقير المضادة للالمتنقل المعروف المستخدمة في العيادة (على سبيل المثال، مثبطات أنيبيب ) تمنع الغزو في مقايسة كذلك. Howeveص، وفحص لا يأخذ بعين الاعتبار مساهمات المناعية للغزو السرطان.
Introduction
الغزو هو السمة المميزة للأورام الخبيثة. هذا النشاط لا يؤدي فقط إلى تدمير الأنسجة المحيطة بها، ولكن تورط أيضا في تشكيل ورم خبيث. منذ مرضى السرطان يموتون من الغزو وورم خبيث، وكفاءة العلاجات المضادة للالغازية لا تزال شحيحة، فحوصات المخبرية التي تحاكي وقد وضعت غزو الخلايا السرطانية. الهدف من الفحص الفرخ القلب هو تقديم طريقة ثقافة الأجهزة ذات الصلة لدراسة غزو الورم في ثلاثة أبعاد. الفحص يمكن التمييز بين الخلايا الغازية وغير الغازية، ويسمح لدراسة آثار مركبات الاختبار على غزو الورم.
الأساس المنطقي وراء استخدام الاختبار هو مفهوم الفعلي الذي الأورام النظم الإيكولوجية التي الخلايا الورمية تتفاعل باستمرار مع سدى بها (الخلايا المضيفة والمصفوفة خارج الخلية)، وذلك من خلال هذه التفاعلات الجزيئية الغزو على ما يرام ضبطها 1. لذلك، في فحص تواجه الخلايا السرطانية مع تلفزيون القناة الاولىنانوغرام الجنينية شظايا الفرخ القلب 2، التي تخدم ليس فقط باعتبارها ركائز للغزو من قبل خلايا الورم، ولكن أيضا كمصدر من أنواع مختلفة من الخلايا اللحمية وعناصر المصفوفة. قلب كتكوت يحتوي myocytes، الخلايا الليفية والخلايا البطانية، وتتكون المصفوفة خارج الخلية من laminin، فبرونيكتين وأنواع مختلفة من الكولاجين. في هذه الطريقة، تغطي ثلاثية الأبعاد تقنية ثقافة الجهاز كثير من التفاعلات الخلوية والجزيئية المتورطين في غزو أورام المرضى.
والميزة الرئيسية للمقايسة الفرخ القلب هو تنفيذ الآثار اللحمية. هذا الجانب هو أكثر اكتمالا مما كان عليه في المقايسات الغزو أخرى في المختبر التي تستند إلى غزو الخلايا السرطانية في المواد الهلامية غير الحية تتألف من الغشاء القاعدي 3 أو مصفوفة الخلالي 4 الجزيئات. وقد تم إدخال مفهوم المواجهة بين الخلايا السرطانية والطبيعية الأنسجة الحية المضيفة كما هو موجود في الثقافة الجهاز التجريب من قبل عدةالكتاب بما في ذلك وولف وشنايدر في فرنسا 5، Easty وEasty في المملكة المتحدة 6، وSCHLEICH في ألمانيا 7. اثنين من المزايا التقنية للغزو فحص الفرخ القلب على الطرق المذكورة هي أن حجم شظايا يمكن بسهولة موحدة، وأنها لا تزال مقلص، والذي يسمح مراقبة سلامة وظيفية خلال الثقافة الجهاز. وعلاوة على ذلك، ويفضل أجنة الطيور، لأنها يمكن بسهولة أن تشريح من محتوى العقيمة من البيض. مقايسة لديه تشابه المفاهيمي لفرخ السقاء المشيمائي غشاء فحص 8 من خلال تقديم انسجة المعقدة المحيطة إلى الخلايا السرطانية.
وقد تم بنجاح تطبيق فحص للتمييز بين المتغيرات الخلايا الغازية وغير الغازية من نفس الأورام البشرية كما هو الحال في MCF-7 (الثدي) 9 وHCT-8 (القولون) 10 عائلات خط الخلية. هذه التقنية مفيدة لاختبار مركبات يحتمل أن تكون معادية للالغازية وكذلك
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الشكل 1. نظرة عامة التخطيطي لخطوات فحص مختلفة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. إعداد Precultured القلب شظايا (PHFs)
- احتضان البويضة المخصبة الفرخ عند 37 درجة مئوية لمدة 9 أيام. إكمال هذه الحضانة قبل التاريخ الذي يسمح إعداد لاحق من PHFs خلال 4 أيام (على سبيل المثال، في يوم الخميس) والمواجهة النهائية مع المجاميع الخلية السرطانية (على سبيل المثال، على العش الاثنين).
- تطهير وعاء مع 70٪ (ت / ت) الايثانول في الماء. تنفيذ جميع التلاعبات أخرى في خزانة زراعة الأنسجة باستخدام حلول والمواد المعقمة. فتح قذيفة في القطب الجنينية باستخدام الملقط حادة.
- سحب الجنين عن طريق الهولقرع الرقبة مع ملعقة قلع (الشكل 2). وضع الجنين في طبق بتري الزجاج التي يبلغ قطرها 5 سم تحتوي على 5 مل من محلول رينغر الملح.
- فتح الجلد الصدري البطني عن طريق تمزيق فتح الجلد باستخدام الملقط حادة في كلتا يديه، وإزالة القص من قبل نفس النوع من التلاعب، وتشريح خارج القلب باستخدام مقص تسليخ مجهري قطع القزحية لقطع السفن الكبرى في الدم. تنفيذ كافة التلاعب مزيد من تحت macroscope مع شبكة العين معايرة.
الشكل 2. رفع الجنين من البيضة مع ملعقة قلع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- نقل القلب إلى طبق بتري الزجاج معيبلغ قطرها 5 سم تحتوي على 5 مل من MEM-ريكا 3 مستنبت مع 5٪ مصل بقري جنيني. إزالة الأذينين والأوعية المرتبطة بها من قبل resecting الثالث الجمجمة العلوي من القلب باستخدام مقص قطع القزحية تسليخ مجهري. تشريح التامور من البطينين مع زوج من الملقط حادة.
- جعل تنصيف سهمي في البطينين باستخدام مقص تسليخ مجهري قطع القزحية، وإزالة الدم عن طريق هز بلطف مع ملقط حادة.
- نقل البطينين في الزجاج طبق بتري آخر يبلغ قطرها 5 سم تحتوي على 5 مل من جديد MEM-ريكا 3 مستنبت مع 5٪ مصل بقري جنيني. قطع البطينين إلى قطع ما يقرب من 0.4 ملم في القطر باستخدام مقص تسليخ مجهري قطع القزحية. قلب واحد يمكن أن تسفر عن 100 شظايا.
ملاحظة: قلب واحد يمكن أن تسفر عن 100 شظايا - وتناوب على طبق بيتري برفق لدفع كل أجزاء البطين باتجاه وسط الطبق. إزالة كافة المجاميع aliena بإبرة الفولاذ المقاوم للصدأ التي كتبها سبتمبرarating لهم من شظايا البطين، ورميهم نحو المحيط الخارجي للصحن بتري.
- نقل أجزاء القلب مع الماصة الزجاج باستور لقارورة 50 مل مخروطي يحتوي على 2-3 مل من مستنبت (MEM-ريكا 3 زائد 10٪ ت / ت المصل البقري الجنين).
ملاحظة: حجم متوسط بالضبط يعتمد على التحدبات أسفل متغير من قوارير الفردية: يجب أن تكون مشمولة في وسط أسفل من خلال طبقة رقيقة من السائل فقط. - الغاز القارورة (s) مع خليط من 5٪ CO 2 في الجو عن طريق سدادات، واحتضان قارورة (ق) على شاكر gyrotory عند 37 درجة مئوية في 70 الثورات / دقيقة (دورة في الدقيقة) لمدة 24 ساعة. الأساس المنطقي لهذه الخطوة ثقافة تعليق هو الحصول كروي شظايا أنسجة القلب مناسبة للمواجهة اللاحقة مع المجاميع الخلايا السرطانية.
- نقل شظايا القلب والمتوسطة ثقافتهم إلى طبق بيتري. تجاهل aliena المجاميع، الميتة (المظلمة) شظايا، والتكتلات من شظايا القلب مع إبرة.
- احتضان شظايا قلب المتبقية في 50 مل مخروطي قارورة أخرى تحتوي على 6 مل من مستنبت كما هو موضح في الخطوة 1.9 لمدة 60 ساعة أخرى.
ملاحظة: خلال هذه الفترة الحضانة، وشظايا تصبح كروية. وهي تتألف من مجموعة أساسية من myoblasts وطبقة رقيقة من الخلايا ليفية في الهامش. - حدد شظايا كروي اظهار، طبقة رقيقة متجانسة من خلايا ليفية (تشكيل كبسولة شفافة) ويبلغ قطرها 0.4 ملم عن طريق macroscope والإبر. واحد فرخ القلب تسفر عن 20 PHFs مناسبة. نقل هذه PHFs، وكثير منها ستتعاقد بشكل متوازن في 37 ° C، إلى طبق بيتري آخر يحتوي على مستنبت الطازجة. هذه PHFs مستعدون للمواجهة مع خلايا الاختبار.
2. إعداد والمواجهة للبيضاوي اختبار المجاميع خلية
- إعداد المتوسطة أجار شبه الصلبة: حل 100 ملغ من أجار في 15 مل من محلول رينغر الملح المغلي ثلاث مرات. باردتعليق إلى 40 ° C وإضافة 7.5 مل من محلول رينغر الملح / البيض (1: 1)، و 7.5 مل من مصل بقري جنيني.
- إعداد 6 مل من تعليق تحتوي على 1 × 10 5 اختبار خلية / مل في هم مستنبت المناسبة في 50 مل دورق مخروطي. القيام بذلك قبل 3 أيام ومن المقرر بدء ثقافة مواجهة. احتضان القارورة على شاكر gyrotory عند 37 درجة مئوية في 70 دورة في الدقيقة لمدة 3 أيام. الغاز في قوارير مع خليط من 5٪ أو 10٪ (V / V) CO 2 في الهواء، وهذا يتوقف على نوع من الثقافة الوسيلة المستخدمة.
- عرض المجاميع تحت macroscope مجهزة شبكة العين معايرة. حدد (مع إبرة) المجاميع خلية كروي بقطر 0.2 مم.
- استخدام الماصة باستور لنقل ثمانية PHFs المحدد (القطر = 0.4 ملم) في الحد الأدنى من مستنبت إلى الجنينية ساعة من الزجاج يحتوي على شبه صلبة أجار المتوسطة 13. نقل PHFs الفردية مع إبرة لتشكيل دائرة. نضح المتوسطة الزائدباستخدام قطعة صغيرة من ورق الترشيح (انظر الشكل 3).
الشكل 3. شفط السوائل الزائدة حول PHFs. توضع ثمانية PHFs على أجار شبه صلبة في الزجاج ووتش الجنينية، وتتم إزالة فائض السوائل مع قطعة مثلثة رقة الترشيح المرجع الصغيرة. السهام تشير إلى 8 PHFs الفردية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- جلب عشرة اختيار المجاميع خلية كروي (القطر = 0.2 ملم) في دائرة باستخدام الماصة باستور. نضح المتوسطة الزائد. نقل تجميع واحد تجاه كل من PHF مع الإبرة حتى أنها تجعل الاتصال مع بعضها البعض. نضح المتوسطة الزائد باستخدام قطعة صغيرة من ورق الترشيح.
- ختم غطاء ساعة من الزجاج مع البارافين، وincuباتي عند 37 درجة مئوية لمدة 4-24 ساعة، اعتمادا على خصائص لاصقة من الخلايا اختبار لPHFs.
- تزج أزواج مواجهة مع ما قبل تحسنت (37 ° C) مستنبت، ونقل كل زوج على حدة مع الماصة باستور في 5 مل دورق مخروطي يحتوي على 1.5 مل من مستنبت.
- احتضان قوارير على شاكر gyrotory عند 37 درجة مئوية تعديل إلى 120 دورة في الدقيقة. الغاز في قوارير مع 5٪ أو 10٪ (V / V) CO 2 في الهواء، وهذا يتوقف على نوع من الثقافة الوسيلة المستخدمة للخلايا اختبار (انظر الشكل 4).
- لتجنب تركيز وسائل الإعلام، بلل الغازات عن طريق تمرير من خلال اثنين التكميلية 5 مل مخروطي قوارير مليئة 2 مل من محلول رينغر الملح. تحديث مستنبت كل 8 أيام.
الرقم 4. مخروطي صغير قوارير على رأس شق gyrotory. إيه وختم القوارير مع 1.5 مل من مستنبت مع سدادات سيليكون مجهزة الغاز في - ومخرج الإبرة، وانتقل في 120 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. وقاد الغاز عن طريق مدخل أنابيب (1) إلى دورق مخروطي سعة أكبر (2) مملوءة بمحلول معقم رينغر الملح، وكذلك توزيع (3 و 4) في قوارير صغيرة تحتوي على مستنبت مع أزواج مواجهة الفردية (5 و 6). وأخيرا، يتم جمع الغاز الذي يقضيه في قارورة أكبر مع فخ الماء المعقم (7)، من حيث أنه يمكن الهرب في الهواء (8). يوضح الشكل مجموعتين من البطاريات الثقافة على رأس منصة لوحة محلية الصنع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. الأنسجة من ثقافات مواجهة
- تحضير محلول التثبيت بوين-هولاند.
- حل 2.5 غرام من خلات النحاسيك (محايد) في 100 مل من الماء المقطر واحدببطء إضافة 4.0 غرام من حمض البكريك.
- تصفية حل من خلال مرشح ورقة. إضافة 10 مل من الفورمالين و 1 مل من حمض الخليك. مزيج 9 أجزاء من هذا الحل مع 1 جزء من محلول مشبع كلوريد الزئبق في الماء المقطر واحد.
تنبيه: هذا الحل يحتوي على العديد من المواد السامة. الفورمالين مادة سامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد، وإذا ابتلع. حمض الخليك غير قابلة للتآكل لالفم والأمعاء بعد الابتلاع. حمض البكريك هو الحساسية وناسفة عند تسخينها بسرعة أو من خلال قرع. كلوريد الزئبق غير ضارة للغاية على الأغشية المخاطية وnefrotoxic. ارتداء ملابس واقية وقفازات لإعداد حل بوين-هولاند، والتعامل معها في منطقة نائية منطقة جيدة التهوية من النار. ويستند إجراء التثبيت بديل في 4٪ الفورمالديهايد في الفوسفات مخزنة المالحة.
- إصلاح الثقافات الفردية بعد عدة أيام أو أسابيع من الحضانة على النحو التالي. لأول مرة، ونقل الثقافات الملح رينغرالحل لبضع ثوان لإزالة بروتينات مصل. المقبل، تزج في أطباق بتري التي يبلغ قطرها 3 سم تحتوي على حل تثبيت 3 مل بوين-هولاند ما يقرب من 2 ساعة.
- شطف الثقافات ثلاث مرات في 3 مل المنزوعة الماء قبل تفرخ لهم في الماء لمدة 2 ساعة لإزالة أكبر قدر من الحل تثبيت وقت ممكن. أخيرا، ونقل إلى 3 مل من 70٪ (ت / ت) الايثانول في الماء. الحفاظ على الثقافات في هذا الحل O / N، ولكن يمكن تمديد هذه الفترة لعدة أيام.
- يذوى عن طريق نقل بشكل تسلسلي من خلال الجرار التي تحتوي على 100 مل من 96٪ (ت / ت) الايثانول في الماء، الإيثانول بنسبة 100٪ أو 100٪ الأيزوبروبانول، و 100٪ الزيلين لمدة 2 ساعة لكل منهما.
- نقل كل ثقافة إلى ساترة الزجاج منفصلة (مع وجود الحد الأدنى من زيلين)، ضع ساترة على الجزء السفلي من كبسولة زجاجة النبيذ لالبارافين التضمين، وتغطية المواد الثابتة من شمع البرافين السائل عند 56 درجة مئوية. احتضان عند 56 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ثم تبرد المادة جزءا لا يتجزأ من لRT.
تنبيه: كما البنزين الزيلين المشتقة قد تكون سامة بعد استنشاقه، وينبغي التعامل في مناطق جيدة التهوية فقط.
- نقل كل ثقافة إلى ساترة الزجاج منفصلة (مع وجود الحد الأدنى من زيلين)، ضع ساترة على الجزء السفلي من كبسولة زجاجة النبيذ لالبارافين التضمين، وتغطية المواد الثابتة من شمع البرافين السائل عند 56 درجة مئوية. احتضان عند 56 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ثم تبرد المادة جزءا لا يتجزأ من لRT.
- إزالة كبسولة زجاجة النبيذ وساترة، وقطع كتلة البارافين الذي يحتوي على ثقافة ثابتة.
- جعل 8 ميكرون أقسام البارافين سميكة من الزوج مواجهة بأكمله باستخدام مشراح 14، وجمع كل أقسام على ثلاثة بالتناوب الشرائح الزجاجية المجهر التي تم سابقة التجهيز مع حل لاصق الأنسجة كعامل الشائكة. تجنب البيض كعامل الخلاف، لأنها قد تتداخل مع المناعية.
ملاحظة: يتم المعالجة من الشرائح الزجاجية المجهر من خلال تقديم 1 قطرة صغيرة من محلول لاصق الأنسجة و 3 قطرات صغيرة من الماء المنزوع المعادن مع الماصة باستور، وخلطها لتغطية الشريحة. - إزالة البارافين من الشريحة الأولى عن طريق غمر مرتين في جرة تحتوي على 100 مل 100٪ الزيلين لمدة 10 دقيقة.
- ترطيب الشرائح عن طريق الغمر لمدة 10 ق فيالجرار التي تحتوي على 100 مل من الحلول التالية: زيلين / الإيثانول (1: 1)، الإيثانول بنسبة 100٪، 96٪ (ت / ت) الايثانول في الماء، 70٪ (ت / ت) الايثانول في الماء، والماء المنزوعة في نهاية المطاف.
- حل بلورات كلوريد الزئبق عن طريق الغمر في وعاء يحتوي على 100 مل من 0.5٪ (ث / ت) اليود في 96٪ (ت / ت) الايثانول في الماء لمدة 2 دقيقة.
- مسح الأقسام في وعاء يحتوي على 100 مل من 5٪ (ث / ت) وحمض الصوديوم في الماء لمدة 10 ثانية. ثم تغسل الشرائح جيدا في الماء المقطر.
- احتضان الشرائح في جرة تحتوي على الهيماتوكسيلين 100 مل هاريس لمدة 2 دقيقة، غمر لفترة وجيزة في 0.1 M حمض الهيدروكلوريك، ثم يغسل في ادارة مياه الصنبور لمدة 10 دقيقة.
- احتضان في وعاء يحتوي على 100 مل يوزين 0.1٪ (ث / ت) في الماء لمدة 1 دقيقة.
- يذوى عن طريق غمر وجيزة في الجرار التي تحتوي على 100 مل من السلسلة التالية من الحلول: الماء المنزوع المعادن، و 70٪ (ت / ت) الايثانول و 96٪ (ت / ت) الايثانول، الإيثانول بنسبة 100٪ مرتين، زيلين الإيثانول (1: 1) ، وأخيرا في 100٪ زيلين.
- تحميلالشرائح مع تصاعد المتوسطة من خلال تقديم 2 قطرات منفصلة من المتوسط على الشرائح، فلتكن هذه توسيع طريق وضع ساترة على أعلى منهم، والسماح لها تتصلب في RT لمدة 24 ساعة.
4. المناعية
- إعداد المالحة تريس مخزنة (TBS). حل 6.0 غرام من tris- (hydroxymethyl) -aminomethane (قاعدة تريس) و45،0 غرام من كلوريد الصوديوم في 4.5 لتر من الماء المنزوع المعادن. جلب لدرجة الحموضة 7.6 مع 1 M حمض الهيدروكلوريك (حوالي 42 مل). إضافة الماء المقطر لجعل 5 L.
- إعداد العازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك. حل 60 غرام من قاعدة تريس في 800 مل من الماء المنزوع المعادن. جلب لدرجة الحموضة 7.6 مع 6 M حمض الهيدروكلوريك (حوالي 65 مل). إضافة الماء المقطر لجعل 1 L. تمييع 10X مع الماء المقطر قبل الاستخدام.
- إعداد تريس BSA 0.1٪ العازلة. حل 12،1 غراما من قاعدة تريس و45،0 غرام من كلوريد الصوديوم في 4.5 لتر من الماء المنزوع المعادن. جلب لدرجة الحموضة 8.2 مع 1 M حمض الهيدروكلوريك (حوالي 42 مل). إضافة 5.0 غرام من ألبومين المصل البقري (BSA) و 6.5 غرام من نان 3. إضافة الماء المنزوع المعادن لجعل 5 L.
تنبيه: NaN3 هو غايةالمنتجات السامة. الاتصال مع الأحماض يحرر الغازات السامة جدا. ارتداء القفازات وتجنب ابتلاع بكل الوسائل. أشكال NaN3 المركبات المتفجرة حساسة للغاية مع النحاس والرصاص والمعادن الأخرى. المصارف الاحمرار مع كميات وفيرة من الماء. حافظة للالبديلة 0.01٪ الثيومرسال. - متابعة البنود 3،2 حتي 3،10.
- تراجع الشرائح في TBS أو تريس 0.1٪ العازلة BSA، وتمحو السوائل الزائدة حول المقاطع باستخدام منشفة ورقية.
- تطبيق 150 ميكرولتر مصل الماعز الطبيعي المخفف 01:20 في TBS أو في 5٪ (ث / ت) BSA في تريس 0.1٪ (ث / ت) العازلة BSA لمدة 30 دقيقة في غرفة الرطوبة العالية (صندوق مغلق للرئيسين -incubation الشرائح مع مستلم المياه المفتوحة ضمان ارتفاع نسبة الرطوبة في الداخل). ثم إزالة السوائل الزائدة مع منشفة ورقية.
- تطبيق 150 مصل الأساسي ميكرولتر المخفف في تريس 0.1٪ (ث / ت) BSA تستكمل مع 1٪ (V / V) مصل الماعز العادي لا يقل عن 2 ساعة في غرفة الرطوبة العالية. تحديد التخفيف الأمثل للمصل الأساسي empiriأتوماتيكيا.
ملاحظة: المناعية يمكن أن تستخدم لكشف المستضدات الفرخ القلب ولكن، باستخدام أجسام مضادة محددة، تقنية وصفها لمستضدات الفرخ القلب يمكن تطبيقها على مستضدات أخرى (مثل البروتين الفلوري الأخضر) 15 كذلك. - تغسل الشرائح مرتين في تريس 0.1٪ ث / ت BSA على طاولة هزاز لمدة 5-10 دقيقة.
- إزالة السوائل الزائدة باستخدام منشفة ورقية وتطبيق 150 ميكرولتر الماعز المضادة للأرنب مصل تتجاوز (على سبيل المثال، 1:20 في TBS) لا يقل عن 1 ساعة في غرفة الرطوبة العالية.
- يغسل مرتين مع TBS على طاولة هزاز لمدة 5-10 دقيقة.
- إزالة السوائل الزائدة باستخدام منشفة ورقية. تنطبق مجمع الغلوثانيون مكافحة البيروكسيد المخفف 1: 250 في TBS تستكمل مع 1٪ (V / V) مصل الماعز العادي لا يقل عن 1 ساعة في غرفة الرطوبة العالية. التخفيف من مجمع يعتمد على دفعة واحدة.
- تغسل الشرائح مع TBS ونقل إلى تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.6 درجة الحموضة عازلة.
- نقل الشرائح في Tris-حمض الهيدروكلوريك العازلة التي تحتوي على 0.25 غرام / لتر من diaminobenzidine و 0.01٪ (V / V) H 2 O 2 لبضع دقائق. وقف الحضانة عندما اتسخت قلب الفرخ. تأكد دائما تحت المجهر.
- نقل الشرائح إلى تريس، حمض الهيدروكلوريك لمدة 10 دقيقة ثم إلى الماء المقطر.
- متابعة البنود 3.13 و 3.14.
ملاحظة: للحصول على مولدات المضادات التي يتم تدميرها بسهولة أثناء التثبيت، cryosectioning الثقافات يمكن أن تقدم بديلا للتحليل المناعى. يوصف هذا في الخطوات التالية البروتوكول: - غسل الثقافات الحية مع 3 مل من محلول رينغر الملح لإزالة بروتينات مصل.
- إضافة قطرة واحدة من تضمين المتوسطة إلى precooled (-16 ° C) عينة حامل cryomicrotome. نقل الأنسجة مثقف من على حافة ساترة الزجاج إلى الجزء العلوي من هذا الانخفاض قبل أن يتم تجميده تماما.
- تبريد الثقافة إلى -16 ° C، قطع 6 ميكرون أقسام المجمدة سميكة، وجمعها على الجيلاتين المغلفةالشرائح الزجاجية.
- إصلاح الشرائح في الأسيتون في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل تخزينها في 4 درجات مئوية.
- متابعة البنود 4،5 حتي 4،15.
5. تقييم نتائج الفحص
ملاحظة: في الفحص الحالي، يتم تعريف الغزو كما الاحتلال التدريجي للPHF من قبل خلايا اختبار مواجهة. التحليل المجهري للجميع أقسام متتالية من ثقافة مواجهة يسمح اعادة اعمار التفاعل بين المجاميع خلية الاختبار وPHFs في ثلاثة أبعاد.
- مراقبة أنماط مختلفة من التفاعل ودرجة وفقا للجدول التالي (انظر الشكل 5).
الصف 0: فقط PHF الملاحظة. ويمكن ملاحظة أي خلايا مواجهة.
الصف الأول: يتم إرفاق الخلايا اختبار مواجهة للهوكي، ولكن لا تحتل أنسجة القلب، ولا حتى أبعد طبقات خلية ليفية.
الصف الداخليين: المهنة من PHF يقتصر على م الليفية مثل وبالخلايا العضلية الجذعية الخارجيطبقات ليرة لبنانية.
الصف الثاني ب: لقد أحطت PHF المجاميع الخلية ولكن لا توجد علامات من الاحتلال.
الصف الثالث: الخلايا التي تواجه لقد احتل PHF، ولكن لم يقم أكثر من نصف المبلغ الأصلي للأنسجة القلب سليمة.
الصف الرابع: احتلت الخلايا التي تواجه أكثر من نصف حجم الأصلي للهوكي.
ملاحظة: الصفوف لوحظ الأول والثاني مع السكان الخلية موسع، في حين الدرجات الثالثة والرابعة هي نموذجية من الغزو. لتقييم التقدم ضمن أطر زمنية مختلفة، ينبغي تطبيق التحليل النسيجي لمواجهة الثقافات الثابتة بعد فترات حضانة مختلفة.
الرقم 5. نماذج للتفاعلات بين مواجهة الخلايا السرطانية وPHFs. أقسام النسيجية مواجهة الثقافات ملطخة إما مع الهيماتوكسيلين يوزين (لوحات اليسرى) أو immunohistochemicallذ مع الأجسام المضادة ضد الفرخ القلب (لوحات اليمين). يتم تعريف درجات التفاعل في نص البروتوكول. (H: أنسجة القلب، T: الخلايا السرطانية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. تقييم سمية بعد العلاج بالعقاقير
- نقل الثقافات التي تواجهها في حجم الحد الأدنى إلى 24 جيدا multidishes زراعة الأنسجة مع الماصة باستور.
- غسل الثقافات من خلال إضافة 500 ميكرولتر من مستنبت خالية من المخدرات، وتحديث بعد 6 ساعات.
- تفقد جميع الآبار يوميا لنمو الخلية من إإكسبلنتس باستخدام مجهر مقلوب (عدسة الهدف 40X). تقسيم عدد من تعدى الثقافات على العدد الكلي للثقافات explanted للحصول على مؤشر بقاء الثقافات مواجهة. مقارنة نتائج الثقافات المعالجة المخدرات مع تلك المعالجة المذيبات.
ملاحظة: استخدام Ki67 المناعية (لprolif الخليةeration) وTUNEL فحص (لموت الخلايا المبرمج) واقترح عن تقنيات مكملة لفحص النباتى لتقييم سمية.
7. تقييم نمو الثقافات مواجهة
- جعل الصور بالأسود والأبيض من الثقافات قبل التثبيت، وذلك باستخدام المجهر مجهزة الصورية الرقمية (عدسة الهدف 50X)
- قياس مم الأكبر (أ) وأصغر (ب) قطر للثقافة الأخذ بعين الاعتبار التكبير.
- حساب حجم تقريبي (V) في ملم 3 عن طريق صيغة 16
- V = 0.4 xaxb 2
- حساب نمو ثقافة بمقارنة هذا الحجم النهائي مع وحدات التخزين المشتركة للهوكي والتجميعية الخلية في بداية المواجهة.
ملاحظة: نظرا لأن PHFs الانفرادي تميل إلى الانخفاض حجمها خلال الثقافة، ونمو أزواج مواجهة يعتمد على الخلايا السرطانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المقاطع النسيجية كما هو مبين في الشكل (5) تظهر النتيجة النهائية لعدد من فحوصات ناجحة. الأنسجة السليمة للثقافات تشير خلايا قابلة للحياة، ويسمح لتفسير التفاعل بين الخلايا السرطانية والأنسجة الطبيعية. وعلاوة على ذلك، لا رد فعل جهاز المناعة من الأنسجة الطبيعية يمكن ملاحظة، مما يؤكد سن الصحيح لافراخ الدجاج المستخدمة على سبيل المثال، قبل أن يتم تطوير نظام الرفض المناعي. لا توجد البكتيريا واضحة، مما يدل على غياب (الإجمالي) التلوث خلال الفترة الثقافة. وأخيرا هامش مقربة من الأقسام يؤكد الثقافة في تعليق بدون علامات (مؤقت) التمسك الجدار دورق مخروطي.
وقد تم اختبار العديد من المركبات في الفحص. يتم تسليم المخدرات عموما إلى مستنبت في اللحظة التي يتم نقلها من مواجهة PHF / ورم أزواج الإجمالية للقوارير مخروطي صغير (الخطوة 2.7). وقد استخدمت بعض كأدوات (المعروف فيمثبطات ومنشطات) لكشف مسارات والجزيئات المستجيب المتورطين في عملية غزو الورم. لغيرها من المركبات التي كانت مرتبطة هيكليا، تأسست علاقة الكمي هيكل النشاط (QSAR) بناء على نتائج الفحص غزو قلب الفرخ. لذلك، لpolyphenolics ذات الصلة واستخدمت عددا من واصفات الحسابية لتمكين التنبؤ النشاط المضادة للجائحة في الفحص. على مدى 15 عاما تم اختبار 139 النظير مختلفة لالممكنة آثارها المضادة للالغازية في الفحص، وصنفت أنشطتها إلى 4 فصول. تم اختيار التدريب ومجموعة التحقق من صحة تتكون من 93 و 46 من تلك polyphenolics على التوالي عشوائيا. عن طريق الشبكة العصبية الاصطناعية QSAR نتائج مجموعة التحقق من صحة أظهرت وجود ارتباط واضح بين أنشطة مكافحة الغازية توقع والتجريبية 17 (انظر الشكل 6).
وتشير البيانات إلى متانة عشرالبريد فرخ غزو قلب الفحص، منذ كان الارتباط بين النتائج المتوقعة والتجريبية صالح أكثر من 15 عاما، وأكد في حديثة (غير منشورة) دراسة التنبؤ مع polyphenolics مختلفة. مصفوفة الارتباك المعروضة في الشكل 6 تلخص الضعف والقوة للمقايسة بيانيا: أنه يعطي التعبير الخام من الدقة والتكاثر. تفسير هذا الرسم البياني يجب أن تأخذ في الاعتبار التباين البيولوجي للكائنات الحية الثقافات الجهاز، والنتيجة الكمية نصف النهائي من نتائج الغزو.
الرقم 6. التحقق الخارجي للنموذج QSAR التنبؤي (الشبكة العصبية الاصطناعية) لنشاط الجزيئات الصغيرة في مقايسة غزو قلب الفرخ. إخراج هذا النموذج هو الطبقة النشاط المضادة للالغازية من مركب. وقد تم تحديد أربعة من هذه الطبقات، representing بأقل تركيز في أي جزيء تمارس النشاط المضادة للجائحة (أي غزو الصف الأول أو الثاني) في فحص CHI: فئة 4 (النشطة وصولا إلى 1 ميكرومتر)، والطبقة 3 (10 ميكرون)، والطبقة 2 (100 ميكرومتر) والفئة 1 (أي نشاط مكافحة الغازية بتركيزات عالية تصل إلى 100 ميكرومتر). مصفوفة الارتباك يصور يقارن توقع وتجريبيا فئات النشاط المضادة للالغازية للمركبات من مجموعة التحقق من الصحة. مجموعة المصادقة يحتوي على 46 مركبات، تعيين وتدريب تستند 93. تنبؤات نموذج فقط على واصفات تحسب من التركيب الجزيئي، وبالتالي يمكن الحصول عليها عن المركبات افتراضية. بهذه الطريقة، يمكن أن تركز الجهود على الجزيئات الاصطناعية مع واعدة في النشاط سيليكون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثناء إعداد PHFs، وشظايا قد لا يبقى في التعليق لكن التمسك جدار الوعاء الدموي. يمكن التغلب على ذلك عن طريق زيادة حجم مستنبت. إذا كان عدد PHFs منخفض جدا وحجمها كبير جدا، وانخفاض حجم مستنبت. قد يكون راجعا إلى التقلبات في درجة الحرارة أو العدوى الميكروبية فشل الخلايا اختبار لتجميع. بدلا من ذلك، عدم القدرة على تجميع قد يكون سمة أصلية من الخلايا. خلال مرفق من الركام إلى هوكي، ويمكن التغلب على التصاق الفقراء عن طريق تمديد فترة الحضانة على رأس المتوسطة شبه صلبة أجار أو عن طريق إزالة أكثر مرونة مستنبت حول الثقافات عن طريق امتصاص ورق الترشيح. تحقق أيضا عن التلوث الميكروبي في هذه الحالة. قد تكون الصعوبات خلال باجتزاء المقرر أن تفكك الكتل برافين: يحدث هذا عندما كانت فترة التخزين للكتل طويل جدا (إذابة البارافين مرة أخرى). عندما باجتزاء الفنتحدث ifacts، يجب أن يتم التحقق من سلامة السكين مشراح وغياب aliena المجاميع في الثقافات الثابتة. المناطق الميتة في الثقافات هي علامات ظروف التربية السيئة. في حالة تقييد هذه المناطق إلى مركز للثقافات، ينبغي للمرء أن يشك في حجم المواجهات كونها كبيرة جدا. الاختيار السليم للمجلدات من PHF وخلايا الركام هو في الواقع عاملا حاسما. ومع ذلك، أكثر عمومية نقاط نخر نحو غير لائقة مراقبة درجة الحموضة، التلوث الميكروبي أو التحف التثبيت. أخيرا، عندما تظهر المقاطع مظلمة للغاية، وفترة الغمر في الهيماتوكسيلين قد تكون طويلة جدا، أو قد تكون المقاطع سميكة جدا (> 8 ميكرومتر).
وقد تم تطبيق العديد من الاختلافات على فحص الفرخ القلب بنجاح في الدراسات الغزو. هذه الاختلافات تتعلق أصل النسيج المضيف، عرض الخلايا اختبار مواجهة، وشروط الحضانة. شظايا قلب من الأنواعبخلاف كتكوت 18، ومن الأنسجة مثل الكبد 19 والرئة 20، والدماغ 21، تم فحصها. بدلا من الركام، الخزعة العينات 22 شظايا أحادي الطبقة 23، واستخدمت تعليق خلية لمواجهة مع PHF في الثقافة الجهاز. يتم استبدال الثقافات تعليق بعض الأحيان الثقافات ثابتة على رأس الركيزة نصف صلبة 24، وثبت المواجهات المصل خالية مجدية مع أنواع معينة من الخلايا 25. عموما، يتم وصف التفاعل وفقا لمقياس كمي الدور 26 ومع ذلك، فقد تم أيضا تطوير نظم تحليل الصور الآلي بمساعدة الحاسوب 27،28. الهدف الأخير لتوفير معلومات كمية عن مدى غزو الخلايا السرطانية.
كما يشمل الفحص كتكوت قلب الأنسجة الحية المضيفة، يحاول الإعداد لألخص الوضع في الجسم الحي، وبشكل واضح هو من بعض الأهمية مقارنة مع سنظم ذر في المختبر (انظر القسم مقدمة). ومع ذلك، ينبغي أن ندرك أن فشل الفحص ليشمل جميع عناصر النظام البيئي المصغر الحالية في الأورام الطبيعية والبيئات حيث على سبيل المثال العوامل المناعية يمكن أن تؤثر في سلوك الغازية من الخلايا السرطانية. في دراسة واحدة على الأقل، وقد أدى غياب هذه العوامل في مقايسة إلى نتائج متضاربة بين نتائج فحص الفرخ القلب 29 وتلك من نموذج حيواني 30.
تطبيق في المستقبل ستكون دراسة الخلايا cardiomyocyte السلف في مقايسة. هذه الخلايا يمكن حقن علاجية في المناطق احتشاء من مرضى القلب، ولكن يجب أن يكونوا قادرين على الاندماج في عضلة القلب. في فحص القلب الفرخ سيواجه الخلايا الاصلية مع شظايا قلب الفرخ، وسيتم تحليل هجرتهم والتمايز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. JR, B. ertino 2, Academic Press. San Diego. 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al.
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. MB, V. isser 2, Year Book Publishers. Chicago. 241-24 (1951).
- Romeis, B.
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. Grundmann, E. , Gustav Fisher Verlag. Stuttgart and New York. 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
