Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att studera invasion av tumörceller i levande normala vävnadsfragment i tre dimensioner. Detta organ odlingsteknik tillämpas huvudsakligen för att testa potentiellt anti-invasiva läkemedel in vitro.
Abstract
Målet med kycklinghjärt analys är att erbjuda en relevant organkultur metod för att studera tumörinvasion i tre dimensioner. Analysen kan skilja mellan invasiva och icke-invasiva celler, och möjliggör studier av effekterna av testföreningarna på tumörinvasion. Cancerceller - antingen som aggregat eller enstaka celler - konfronteras med fragment av embryonala chick hjärta. Efter organkultur i suspension under några dagar eller veckor de konfronterande odlingarna fixerades och inbäddades i paraffin för histologisk analys. Det tredimensionella interaktion mellan cancerceller och den normala vävnaden därefter rekonstrueras från seriella sektioner färgade med hematoxylin-eosin eller efter immunohistokemisk färgning för epitoper i hjärtvävnaden eller de konfronterande cancerceller. Analysen är i linje med den senaste konceptet att cancerinvasion är resultatet av molekylära interaktioner mellan cancerceller och deras angränsande stromala värdelement (myofibroblaster, endothelial celler, extracellulära matriskomponenter, etc.). Här är detta stromal miljö erbjuds till cancerceller som en levande vävnad fragment. Stöd aspekter relevansen av analysen är flera. Invasion i analysen är i enlighet med kriterierna i cancerinvasion: progressiv ockupation och utbyte i god tid och utrymme för värdvävnaden, och invasiv och icke-invasiv in vivo av de motstående celler i allmänhet korrelerar med resultatet av analysen. Vidare, invasionen mönster av celler in vivo, såsom definieras av patologer, återspeglas i de histologiska bilder i analysen. Kvantitativa struktur-aktivitets förhållande (QSAR) analys av de resultat som erhölls med många potentiellt anti invasiva organiska kongen föreningar tillät studier av struktur-aktivitetssamband för flavonoider och chalkoner, och kända antimetastatiska läkemedel som används i kliniken (t.ex. mikrotubuli-inhibitorer ) inhiberar invasionen i analysen samt. However, inte analysen inte hänsyn till immunologiska bidrag till cancerinvasion.
Introduction
Invasion är ett kännetecken för maligna tumörer. Denna aktivitet inte bara leder till förstörelse av omgivande vävnader, utan är också inblandat i metastasbildning. Eftersom cancerpatienter dör av invasion och metastas, och effektiva anti-invasiva behandlingar är fortfarande sällsynta, laboratorieanalyser som efterliknar invasionen av tumörceller har utvecklats. Målet med kycklinghjärt analys är att erbjuda en relevant organkultur metod för att studera tumörinvasion i tre dimensioner. Analysen kan skilja mellan invasiva och icke-invasiva celler, och gör det möjligt att studera effekterna av testföreningarna på tumörinvasion.
Logiken bakom användningen av analysen är själva begreppet att tumörer är ekosystem där de neoplastiska cellerna samverkar kontinuerligt med sin stroma (värdceller och extracellulära matrix), och att genom dessa molekylära interaktioner invasion är finjusteras 1. Så, i analysen tumörceller konfronteras med living embryonala kycklinghjärtfragment 2, som tjänar inte bara som substrat för en invasion från tumörcellerna, utan också som en källa för olika typer av stromala celler och matriselement. Ungen hjärta innehåller myocyter, fibroblaster och endotelceller, och den extracellulära matrisen är sammansatt av laminin, fibronektin och olika typer av kollagen. På detta sätt täcker den tredimensionella organkultur teknik många cellulära och molekylära interaktioner som är inblandade i invasion av patientens tumörer.
Den huvudsakliga fördelen med kycklinghjärt analysen är genomförandet av stromala effekter. Denna aspekt är mer komplett än i andra invasionsanalyser in vitro som bygger på tumörcellinvasion till icke-levande geler bestående av basalmembran 3 eller interstitiell matris 4 molekyler. Begreppet konfrontation mellan tumörceller och normala levande värdvävnad som återfinns i organkultur experiment har införts av fleraFörfattarna inklusive Wolff och Schneider i Frankrike 5, Easty och Easty i Storbritannien 6 och Schleich i Tyskland 7. Två tekniska fördelarna med kyckling hjärtat invasionen analys över de angivna metoderna är att volymen av fragmenten enkelt kan vara standardiserade och att de förblir sammandragande, vilket möjliggör funktionella integritet övervakning under organkultur. Vidare är fågelembryon föredrages, eftersom de lätt kan skäras ut från den sterila innehållet av ägget. Analysen har begreppsmässiga likheter med kyckling chorioallantois membrananalys 8, genom att erbjuda en komplex stromal omgivande till tumörcellerna.
Analysen har framgångsrikt tillämpats för att skilja mellan invasiva och icke-invasiva cellvarianter från samma humana tumörer såsom i MCF-7 (bröst) 9 och HCT-8 (kolon) 10 cellinje familjer. Tekniken är användbar för att testa potentiellt anti invasiva föreningar samt
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1. Schematisk översikt av de olika analyssteg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Framställning av förodlas hjärta fragment (PHF)
- Inkubera ett befruktat hönsägg vid 37 ° C under 9 dagar. Fylls inkubation vid en tidpunkt som gör det möjligt för efterföljande framställning av PHF under 4 dagar (t.ex. på en torsdag) och slutliga konfrontationen med tumörcellaggregat (t.ex. på boet måndag).
- Desinficera skal med 70% (volym / volym) etanol i vatten. Utför alla ytterligare manipulationer i en vävnadskultur skåp med hjälp av sterila lösningar och material. Öppna skalet på embryonala polen med trubbiga pincett.
- Dra ut embryot genom holding halsen med en enucleation sked (Figur 2). Placera embryot i en glaspetriskål med en diameter av 5 cm och som innehåller 5 ml av Ringers saltlösning.
- Öppna ventrala bröstkorg huden genom att slita öppna huden med en vass pincett i båda händerna, ta bort bröstbenet av samma typ av manipulation, och dissekera ut hjärtat med hjälp av microdissection iridektomi sax för att koppla sina större blodkärl. Utför alla ytterligare manipulationer under ett makroskop med en kalibrerad okulär rutnät.
Figur 2. Lyft embryot ut ur ägget med en enucleation sked. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Överför hjärta till en glaspetriskål meden diameter av 5 cm och som innehåller 5 ml av MEM-Rega 3 odlingsmedium med 5% fetalt bovint serum. Ta förmaken och tillhörande fartyg genom resektion den övre hjärntredjedelen av hjärtat med hjälp av microdissection iridektomi sax. Dissekera hjärtsäcken från kamrarna med ett par vassa pincett.
- Gör en sagittal hemisection i kamrarna använder microdissection iridektomi sax och ta bort blod genom att försiktigt skaka med en vass pincett.
- Överför ventriklarna till en annan glas Petri-skål med en diameter av 5 cm innehållande 5 ml färskt MEM-Rega 3 odlingsmedium med 5% fetalt bovint serum. Skär kamrarna i bitar på ungefär 0,4 mm i diameter med hjälp microdissection iridektomi sax. Ett hjärta kan ge cirka 100 fragment.
Obs: ett hjärta kan ge cirka 100 fragment - Rotera petriskål försiktigt för att driva alla ventrikulära fragment mot mitten av skålen. Ta bort alla corpora aliena med en stålnål rostfritt SEParating dem från de ventrikulära fragment och driver dem mot periferin av petriskål.
- Överför hjärt fragmenten med en glas Pasteur-pipett till en 50 ml Erlenmeyer-kolv innehållande 2 till 3 ml odlingsmedium (MEM-Rega 3 plus 10% volym / volym fetalt bovint serum).
Obs: Den exakta medelhög volym beror på varierande botten konvexiteter av de enskilda flaskor: centrum för deras botten bör omfattas av en tunn film av vätska bara. - Gas kolven (er) med en blandning av 5% CO2 i luft via propparna, och inkubera kolven (er) på en gyrotorisk skakapparat vid 37 ° C vid 70 varv / min (rpm) under 24 timmar. Skälet till detta suspensionsodling steg är att erhålla sfäriska hjärta vävnadsfragment som lämpar sig för efterföljande konfrontation med tumörcellaggregat.
- Överför hjärtfragment och deras odlingsmedium till en petriskål. Kasta korpusar aliena, nekrotiska (mörkret) fragment, och konglomerat av hjärtfragment med en nål.
- Inkubera de återstående hjärt fragmenten i en annan 50 ml Erlenmeyer-kolv innehållande 6 ml odlingsmedium såsom beskrivs i steg 1,9 under ytterligare 60 timmar.
Obs: Under denna inkubationstid, kommer fragmenten blir sfärisk. De består av en kärna av myoblaster och ett tunt skikt av fibroblastceller vid periferin. - Välj sfäroidala fragment som uppvisar ett tunt, homogent skikt av fibroblastceller (vilket bildar en genomskinlig kapsel) och en diameter av 0,4 mm med hjälp av en makroskop och nålar. En brud hjärta kommer att ge cirka 20 lämpliga PHF. Överföra dessa PHF, av vilka många kommer att sluta avtal rytmiskt vid 37 ° C, till en annan petriskål med färskt odlingsmedium. Dessa PHF är redo för konfrontation med testceller.
2. Upprättande och Konfrontation av Spheroidal testcell Ballast
- Förbered halvfast agarmedium: lös 100 mg agar i 15 ml Ringers saltlösning genom att koka tre gånger. Häftigtsuspensionen till 40 ° C och tillsätt 7,5 ml Ringers saltlösning / äggvita (1: 1) och 7,5 ml fetalt bovint serum.
- Förbered 6 ml av en suspension innehållande 1 x 10 5 prov celler / ml i sitt lämpligt odlingsmedium i en 50 ml Erlenmeyer-kolv. Gör detta 3 dagar innan den mötande kultur planeras. Inkubera kolven på en gyrotorisk skakapparat vid 37 ° C vid 70 rpm under 3 dagar. Gas kolvarna med en blandning av 5% eller 10% (volym / volym) CO2 i luft, beroende på typen av odlingsmedium som används.
- Visa aggregaten under ett makroskop utrustad med en kalibrerad okulär rutnät. Välj (med en nål) sfärisk cellaggregat med en diameter på 0,2 mm.
- Använd en Pasteur-pipett för att överföra åtta utvalda PHF (diameter = 0,4 mm) i en minimal mängd av kulturmedium till en embryologisk urglas innehållande halvfast agarmedium 13. Flytta enskilda PHF med en nål för att bilda en cirkel. Aspirera överskott medietmed användning av en liten bit filterpapper (se figur 3).
Figur 3. aspiration av överflödig vätska runt PHF. Åtta PHF är placerade på halvfast agar i en embryologisk urglas och fluid överskott avlägsnas med en liten triangulär bit op filterpapper. Pilar indikerar de 8 enskilda PHF. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Ta tio utvalda sfäriska cellaggregat (diameter = 0,2 mm) i cirkel med en Pasteur-pipett. Aspirera överskott medium. Flytta ett aggregat i riktning mot var och en av PHF med nålen tills de gör kontakt med varandra. Sug överskott medium med användning av en liten bit av filterpapper.
- Täta locket på urglas med paraffin och incuBate vid 37 ° C under 4-24 timmar, beroende på de adhesiva egenskaperna hos testcellerna till PHF.
- Doppa de konfronterande paren med förvärmd (37 ° C) odlingsmedium, och överför varje individuellt par med en Pasteur-pipett till en 5 ml Erlenmeyer-kolv innehållande 1,5 ml odlingsmedium.
- Inkubera kolvarna på en gyrotorisk skak vid 37 ° C justerades till 120 rpm. Gas kolvarna med 5% eller 10% (volym / volym) CO2 i luft, beroende på typen av odlingsmedium som används för testcellerna (se figur 4).
- För att undvika koncentration av medierna, fukta gaser genom att de genom två kompletterande 5 ml Erlenmeyerkolvar fyllda med 2 ml Ringers saltlösning. Uppdatera odlingsmediet var 8 dagar.
Figur 4. Liten Erlenmeyerkolvar på toppen av en gyrotorisk shak. ER de kolvar med 1,5 ml odlingsmedium är tätade med silikonproppar försedda med en gas i - och utloppsnålen, och förflyttas med 120 rpm vid 37 ° C. Gasen leds genom en inloppsröret (1) till den större Erlenmeyerkolv (2) fylld med steril Ringers saltlösning, och distribueras vidare (3 och 4) till mindre kolvar innehållande odlingsmedium med enskilda mot varandra vända paren (5 och 6). Slutligen är förbrukad gas uppsamlades i en större kolv med en steril vattenfälla (7), varifrån den kan läcka ut i luft (8). Figuren visar två uppsättningar av kultur batterierna på toppen av en hemmagjord plattform plattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Histologi av de mot varandra vända kulturer
- Förbered Bouin-Hollande s fixering lösning.
- Lös 2,5 g kopparacetat (neutral) i 100 ml enkel destillerat vatten ochsätt långsamt 4,0 g pikrinsyra.
- Filtrera lösningen genom ett pappersfilter. Tillsätt 10 ml formalin och 1 ml ättiksyra. Blanda 9 delar av denna lösning med en del av en mättad kvicksilverkloridlösning i enkel destillerat vatten.
VARNING: Denna lösning innehåller flera giftiga ämnen. Formalin är giftig vid inandning, hudkontakt och förtäring. Ättiksyra är frätande för mun och tarmkanalen efter intag. Pikrinsyra är allergiframkallande och explosiva när upphettas snabbt eller slagverk. Merkuriklorid är starkt frätande på slemhinnor och nefrotoxic. Använd skyddskläder och handskar för att förbereda Bouin-Hollande lösning, och hantera det på ett väl ventilerat utrymme på avstånd från eld. Ett alternativt fixering förfarande baseras på 4% formaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning.
- Fäst individuella kulturer efter flera dagar eller veckor inkubation enligt följande. Först överföra kulturer Ringers saltlösning under några sekunder för att avlägsna serumproteiner. Därefter doppa i petriskålar med en diameter på 3 cm innehållande 3 ml Bouin-Hollande s fixering lösning för ca 2 timmar.
- Skölj kulturerna tre gånger i 3 ml avmineraliserat vatten innan inkubera dem i vatten i 2 h för att avlägsna så mycket fixeringslösning som möjligt. Slutligen, överför till 3 ml av 70% (volym / volym) etanol i vatten. Håll kulturerna i denna lösning O / N, men det kan förlängas med ett antal dagar.
- Dehydrera genom att överföra sekventiellt genom burkar innehållande 100 ml av 96% (volym / volym) etanol i vatten, 100% etanol eller 100% isopropanol och 100% xylen under 2 timmar vardera.
- Överför varje kultur till en separat täckglas (med en minimal mängd av xylen), placera täckglas på botten av en vinflaska kapsel för paraffininbäddning och täcka fasta materialet med flytande paraffin vid 56 ° C. Inkubera vid 56 ° C under 24 h och därefter kyla den inbäddade materialet till RT.
VARNING: Som en bensenderivat xylen kan vara giftiga efter inandning och bör endast hanteras i väl ventilerade utrymmen.
- Överför varje kultur till en separat täckglas (med en minimal mängd av xylen), placera täckglas på botten av en vinflaska kapsel för paraffininbäddning och täcka fasta materialet med flytande paraffin vid 56 ° C. Inkubera vid 56 ° C under 24 h och därefter kyla den inbäddade materialet till RT.
- Ta vinflaskan kapseln och täck, och klipp ut paraffinblock som innehåller den fasta kulturen.
- Gör 8 | im tjocka paraffinsektioner av hela mötande par med hjälp av en mikrotom 14, och samla in alla sektioner på tre alternerande mikroskopobjektglas, som förbehandlats med vävnadsklisterlösning som en stickmedel. Undvik äggvita som fastnar medel, eftersom det kan störa immun.
Anmärkning: Förbehandling av objektglas sker genom att leverera en liten droppe av vävnadsklisterlösningen och 3 små droppar av avmineraliserat vatten med en Pasteur-pipett, och blanda dem för att täcka sliden. - Avlägsna paraffinet från den första sliden genom nedsänkning två gånger i en burk innehållande 100 ml 100% xylen under 10 minuter.
- Rehydrera bilderna genom nedsänkning under 10 s iburkar innehållande 100 ml av följande lösningar: xylen / etanol (1: 1), 100% etanol, 96% (volym / volym) etanol i vatten, 70% (volym / volym) etanol i vatten, och slutligen avmineraliserat vatten.
- Lös kvicksilverkloridkristaller genom nedsänkning i en burk innehållande 100 ml av 0,5% (vikt / vol) jod i 96% (volym / volym) etanol i vatten under 2 minuter.
- Rensa sektionerna i en burk innehållande 100 ml av 5% (vikt / vol) natriumtiosulfat i vatten under 10 sek. Tvätta sedan bilderna noggrant i destillerat vatten.
- Inkubera objektglasen i en burk innehållande 100 ml Harris hematoxylin under 2 min, översvämmas kort i 0,1 M HCl, och sedan tvätta i rinnande kranvatten under 10 minuter.
- Inkubera i en burk innehållande 100 ml eosin 0,1% (vikt / volym) i vatten under 1 minut.
- Dehydratisera via kort nedsänkning i burkar innehållande 100 ml av följande serie av lösningar: avmineraliserat vatten, 70% (volym / volym) etanol, 96% (volym / volym) etanol, 100% etanol två gånger, xylen-etanol (1: 1) och slutligen i 100% xylen.
- Monteraglider med monteringsmedium genom att leverera två separata droppar av mediet på bilderna, låt dessa expandera genom att sätta en täck ovanpå dem, och låt det härda vid RT under 24 timmar.
4. Immunohistokemi
- Förbered Tris-buffrad saltlösning (TBS). Lös 6,0 g tris- (hydroximetyl) -aminometan (Tris-bas) och 45,0 g NaCl i 4,5 liter avmineraliserat vatten. Ställs till pH 7,6 med 1 M HCl (ca 42 ml). Tillsätt destillerat vatten till 5 L.
- Förbered Tris-HCl-buffert. Lös 60 g Tris-bas i 800 ml avmineraliserat vatten. Ställs till pH 7,6 med 6 M HCl (ca 65 ml). Tillsätt destillerat vatten till 1 L. Späd 10x med destillerat vatten före användning.
- Förbered Tris-BSA 0,1% buffert. Lös 12,1 g Tris-bas och 45,0 g NaCl i 4,5 liter avmineraliserat vatten. Ställs till pH 8,2 med 1 M HCl (ca 42 ml). Lägg 5,0 g bovint serumalbumin (BSA) och 6,5 g NaNs 3. Lägg avsaltat vatten till 5 L.
VARNING: NaN3 är en myckettoxisk produkt. Kontakt med syror frigör mycket giftiga gaser. Använd handskar och undvik intag med alla medel. NaN3 former mycket känsliga explosiva föreningar med koppar, bly och andra metaller. Spola handfat med rikliga mängder vatten. Ett alternativ konserveringsmedel är 0,01% tiomersal. - Följ poster 3,2-3,10.
- Doppa dem i TBS eller Tris-0,1% BSA-buffert, och torka bort överflödig vätska runt delarna med en pappershandduk.
- Applicera 150 | il normalt getserum utspätt 1:20 i TBS eller i 5% (vikt / volym) BSA i Tris-0,1% (vikt / volym) BSA-buffert under 30 min i en hög-fuktighetskammare (en sluten låda för medföre -incubation av bilderna med en öppet vatten mottagare säkerställer hög luftfuktighet inuti). Ta sedan bort överskottsvätska med en pappershandduk.
- Applicera 150 | il primärt antiserum utspätt i Tris-0,1% (vikt / volym) BSA kompletterat med 1% (vol / vol) normalt getserum under minst 2 h i en hög-fuktighetskammare. Bestäm den optimala utspädningen av primärt antiserum empiritiskt.
Obs: Immunohistokemi kan användas för att detektera chick heart antigener men, med användning av specifika antikroppar, kan den teknik som beskrivs för kycklinghjärt antigener tillämpas på andra antigener (såsom grönfluorescerande protein) 15 samt. - Tvätta objektglasen två gånger i Tris-0,1% vikt / volym BSA på en gungande bord under 5-10 min.
- Ta bort överflödig vätska med användning av en pappershandduk och applicera 150 | il get-anti-kaninantiserum i överskott (t ex., 1:20 i TBS) under minst en timme i en hög fuktighetskammare.
- Tvätta två gånger med TBS på en gungande bord under 5-10 min.
- Ta bort överflödig vätska genom att använda en pappershandduk. Applicera peroxidas-anti-peroxidaskomplex utspätt 1: 250 i TBS kompletterat med 1% (vol / vol) normalt getserum under minst 1 h i en hög fuktighetskammare. Utspädningen av komplexet beror på satsen.
- Tvätta bilderna med TBS och överföra till Tris-HCl-buffert pH 7,6.
- Överför bilderna till en Tris-HCl-buffert innehållande 0,25 g / L diaminobensidin och 0,01% (volym / volym) H 2 O 2 i några minuter. Stoppa inkubation när ungen hjärta färgade. Kontrollera regelbundet under mikroskop.
- Överför objektglasen till Tris-HCl under 10 minuter och därefter till destillerat vatten.
- Följ objekt 3.13 och 3.14.
Obs: För antigener som lätt förstörs under fixering, kan cryosectioning av kulturerna erbjuda ett alternativ för immunohistokemisk analys. Detta beskrivs i de följande protokoll steg: - Tvätta de levande kulturerna med 3 ml Ringers saltlösning för att avlägsna serumproteiner.
- Tillsätt en droppe inbäddningsmedium till förkyld (-16 ° C) preparathållaren av en cryomicrotome. Överför den odlade vävnaden från kanten av ett täckglas till toppen av denna droppe innan den är helt frusen.
- Kyl kultur till -16 ° C, skär 6 um tjocka frysta snitt, och samla dem på gelatin-belagdaglasskivor.
- Fäst glasen i aceton vid 4 ° C under 10 min före förvaring vid 4 ° C.
- Följ poster 4,5-4,15.
5. Utvärdering av analysresultaten
Obs: I föreliggande analys är invasion definieras som den gradvisa ockupationen av PHF av de motstående testceller. Mikroskopisk analys av alla på varandra följande sektioner från en konfrontera kultur tillåter återuppbyggnaden av interaktionen mellan testcellaggregat och PHF i tre dimensioner.
- Följ de olika mönster av interaktion och kvalitet i enlighet med följande skala (se figur 5).
Grad 0: Endast PHF observerats. Inga konfronterande celler kan observeras.
Grad I: De konfronterande testceller är knutna till PHF, men upptar inte hjärtvävnaden, inte ens de yttersta fibroblastiska cellskikten.
Grade IIa: Ockupation av PHF är begränsad till den yttre fibroblastliknande och myoblast cell skikt.
Grade IIb: Den PHF har omringade cellaggregat, men det finns inga tecken på ockupationen.
Grad III: De mot varandra vända cellerna har ockuperat PHF, men har kvar mer än hälften av den ursprungliga mängden av hjärtvävnaden intakt.
Grad IV: De mot varandra vända celler har ockuperat mer än hälften av den ursprungliga volymen av PHF.
Obs: Betyg I och II observeras med icke-invasiv cellpopulationer, medan betygen III och IV är typiska för invasion. För att utvärdera progressionen inom olika tidsramar, bör histologisk analys tillämpas på konfrontera kulturer fasta efter olika inkubationsperioder.
Figur 5. Exempel på samspelet mellan motstående cancerceller och PHF. Histologiska sektioner av konfrontera kulturer färgades antingen med hematoxylin-eosin (vänster paneler) eller immunohistochemically med en antikropp mot chick hjärta (höger sida). Interaktions Kvaliteterna definieras i protokollet text. (H: hjärtvävnad, T: tumörceller). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6. Bedömning toxicitet efter läkemedelsbehandlingar
- Överför de konfronterande kulturerna i en minimal volym till 24-brunnars vävnadsodlings multidishes med en Pasteur-pipett.
- Tvätta odlingarna genom tillsats av 500 | il av läkemedelsfritt odlingsmedium, och uppdatera efter 6 h.
- Inspektera alla brunnar dagligen för cell utväxt från explantaten med användning av ett inverterat mikroskop (objektiv 40X). Dividera antalet outgrowing kulturer med det totala antalet av explanterade kulturer för att erhålla ett index på överlevnad av de mot varandra vända kulturerna. Jämför resultaten av läkemedelsbehandlade kulturer med lösningsmedelsbehandlade sådana.
Obs: Användningen av Ki67 immunohistochemistry (för cell prolifbete) och TUNEL analys (för apoptos) föreslås som kompletterande tekniker till explantatet analys för att bedöma toxicitet.
7. Tillväxt Bedömning att konfrontera kulturer
- Gör svartvita fotografier av kulturerna strax före fixering, med hjälp av ett mikroskop utrustat med en digitala kameror (objektiv 50X)
- Mät i mm den större (a) och mindre (b) diametern av kulturen med hänsyn till den förstoring.
- Beräkna den ungefärliga volymen (V) i mm 3 via formel 16
- V = 0,4 xaxb 2
- Beräkna odlingens tillväxt genom att jämföra denna slutliga volymen med de kombinerade volymerna av PHF och cellaggregat vid början av konfrontation.
Obs! Eftersom ensamma PHF tenderar att minska sin volym under kultur, är beroende av tumörcellerna tillväxt av motstående par.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De histologiska sektioner som presenteras i Figur 5 visar slutresultatet av ett antal framgångsrika analyser. Ljudet histologi av odlingarna visar livsdugliga celler och gör det möjligt att tolka samspelet mellan tumörceller och normal vävnad. Dessutom kan observeras ingen immunreaktion från den normala vävnaden, vilket bekräftar den korrekta ålder kycklingembryon används t.ex. före avstötning systemet utvecklas. Det finns inga bakterier synliga, vilket indikerar frånvaro av (brutto) kontaminering under odlingsperioden. Slutligen rundade periferin av sektionerna bekräftar kultur i suspension utan tecken på (tillfälligt) anslutning till Erlenmeyerkolven väggen.
Många föreningar har testats i analysen. Läkemedel i huvudsak levereras till odlingsmediet i det ögonblick då de konfronterande PHF / tumöraggregatparen överförs till små Erlenmeyerkolvar (steg 2,7). Några användes som verktyg (kändhibitors och aktivatorer) att riva upp vägar och effektormolekyler inblandade i processen för tumörinvasion. För andra föreningar som strukturellt var närstående, var en kvantitativ struktur-aktivitetssamband (QSAR) fastställs baserat på resultaten av kyckling hjärtat invasionsanalys. Så, för relaterade polyphenolics ett antal beräknings deskriptorer användes för att göra det möjligt att förutsäga deras anti-invasiv aktivitet i analysen. Under en period av 15 år 139 olika analoger testades för eventuella anti-invasiva effekter i analysen, och deras verksamhet grupperades i fyra klasser. En utbildning och ett validerings uppsättning bestående av 93 och 46 av dessa polyphenolics respektive var slumpmässigt utvalda. Med hjälp av en QSAR artificiella neurala nätverk resultaten av validerings uppsättningen visade ett klart samband mellan de förutsagda och experimentella anti-invasiva verksamhet 17 (se figur 6).
Uppgifterna visar robustheten the chick hjärta invasionsanalys, eftersom sambandet mellan förutsedda och experimentella resultat gällde över 15 år, och bekräftades i en nyligen genomförd (opublicerad) prognos studie med olika polyphenolics. Matrisen förvirring presenteras i figur 6 sammanfattar svaghet och styrkan i analysen grafiskt: det ger en grov uttryck för noggrannhet och reproducerbarhet. Tolkningen av denna graf bör ta hänsyn till den biologiska variationen av levande kulturer organ, och den halv kvantitativa poäng av invasionen resultat.
Figur 6. Extern validering av en prediktiv QSAR modell (artificiella neurala nätverk) för aktiviteten hos små molekyler i chick hjärtat invasionsanalys. Utsignalen från denna modell är den anti-invasiv aktivitet klass hos en förening. Fyra sådana klasser har fastställts, representing den lägsta koncentration vid vilken en molekyl utövar anti-invasiv aktivitet (dvs invasion klass I eller II) i CHI-analysen: klass 4 (aktiv ned till 1 M), klass 3 (10 M), klass 2 (100 M) och klass 1 (ingen anti-invasiv aktivitet vid koncentrationer så höga som 100 ^ M). Den visade förvirring matris jämförs förutspått och experimentellt bestämd anti-invasiva verksamhetsgrupper för föreningarna validerings uppsättningen. Valideringen set innehåller 46 föreningar, övningsuppsättningen 93. Modell förutsägelser enbart på beskrivningar beräknade från molekylstruktur baserad, och kan på så sätt erhållas för hypotetiska föreningar. På så sätt kan syntetiska ansträngningar inriktas på molekyler med lovande in silico aktivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under förberedelserna av PHF kan fragmenten inte stanna i suspension men hålla sig till kärlväggen; detta kan övervinnas genom att öka volymen av odlingsmediet. Om antalet PHF är för låg och deras storlek är för stor, minska volymen av odlingsmediet. Fel i testcellerna att aggregera kan bero på variationer i temperatur eller till mikrobiell infektion. Alternativt kan en oförmåga att aggregera vara en inneboende egenskap hos cellerna. Under fastsättningen av aggregaten till PHF, kan dålig vidhäftning övervinnas genom att förlänga inkubationstiden ovanpå halvfast agarmedium eller genom att ta bort mer vätska odlingsmedium runt kulturerna medelst absorberande filterpapper. Kontrollera också för mikrobiell förorening i det här fallet. Svårigheter under sektione kan bero på sönderdelning av paraffinblock: detta inträffar när den period av blocken lagring har varit alltför lång (smälta paraffinet gång). När snitt konstiFACTS inträffar, bör kontrolleras integriteten hos mikrotomen kniv och frånvaron av corpora aliena i de fasta kulturer. Nekrotiska områden i kulturer är tecken på dåliga odlingsbetingelser. Om dessa områden är begränsade till centrum av kulturerna, bör en misstänka volymen av konfrontationer är alltför stor. Lämpligt val av volymerna av PHF och cellaggregaten är verkligen en kritisk faktor. Men mer generaliserad nekros pekar mot olämpligt pH-kontroll, mikrobiell förorening eller fixerings artefakter. Slutligen, när sektionerna blir för mörkt, kan nedsänkning perioden hematoxylin vara för lång eller sektionerna kan vara för tjockt (> 8 pm).
Många variationer på kycklinghjärt analysen har tillämpats med framgång i invasionsstudier. Dessa variationer hänför sig till ursprunget för värdvävnaden, presentationen av de motstående testcellerna, och inkubationsbetingelserna. Hjärta fragment från arterannat än chick 18, och från vävnader såsom lever 19, lunga 20 och hjärna 21, har undersökts. I stället för aggregat, exemplar biopsi 22 monolager fragment 23, och cellsuspensioner har använts för att konfrontera med PHF i organkultur. Suspensionsodlingar ibland ersatts av statiska kulturer på toppen av en halvfast substrat 24, och serumfria stötningar har visat sig vara genomförbara med vissa typer av celler 25. Generellt är interaktionen beskrivits i enlighet med en semi kvantitativ skala 26 emellertid, har datorstödd automatiserad bildanalyssystem också utvecklats 27,28. Det senare syftar till att ge kvantitativ information om omfattningen av tumörcellinvasion.
Som ungen hjärta analysen omfattar en levande värdvävnad, försöker installationsprogrammet att sammanfatta situationen in vivo, och tydligt är av viss relevans jämfört med ofins system in vitro (se inledn avsnitt). Det bör emellertid inses att analysen misslyckas att omfatta alla delar av microecosystem närvarande i naturliga tumörer, miljöer där till exempel immunologiska faktorer kan påverka det invasiva beteendet hos cancercellerna. I åtminstone en studie, har avsaknaden av sådana faktorer i analysen lett till motstridiga resultat mellan resultaten av chick hjärtat analysen 29 och de i en djurmodell 30.
En framtida tillämpning kommer att vara studiet av cardiomyocyte progenitorceller i analysen. Dessa celler kan injiceras terapeutiskt i infarkt zoner hjärtpatienter, men de bör kunna integreras i hjärtmuskeln. I chick hjärtat analysen progenitorcellerna kommer att konfronteras med chick hjärta fragment och deras migration och differentiering kommer att analyseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. JR, B. ertino 2, Academic Press. San Diego. 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al.
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. MB, V. isser 2, Year Book Publishers. Chicago. 241-24 (1951).
- Romeis, B.
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. Grundmann, E. , Gustav Fisher Verlag. Stuttgart and New York. 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
