Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per studiare l'invasione delle cellule tumorali in viventi frammenti di tessuto normale in tre dimensioni. Questa tecnica cultura organo è applicata principalmente per testare farmaci potenzialmente anti-invasive in vitro.
Abstract
L'obiettivo del saggio cuore pulcino è quello di offrire un metodo di coltura degli organi competenti di studiare invasione tumorale in tre dimensioni. Il dosaggio può distinguere tra cellule invasive e non invasive, e consente lo studio degli effetti dei composti di prova su invasione tumorale. Le cellule tumorali - sia come aggregati o singole cellule - si confrontano con frammenti di cuore pulcino embrionale. Dopo cultura organistica in sospensione per un paio di giorni o settimane le culture confrontano sono fissi e inclusi in paraffina per l'analisi istologica. L'interazione tridimensionale tra le cellule tumorali e il tessuto normale viene poi ricostruita da sezioni seriali colorate con ematossilina-eosina o dopo colorazione immunoistochimica per epitopi nel tessuto del cuore o le cellule tumorali confrontano. Il saggio è coerente con il concetto recente che l'invasione cancro è il risultato di interazioni molecolari tra le cellule tumorali e le loro elementi host vicina stromali (miofibroblasti, endothcellule Elial, componenti della matrice extracellulare, etc.). Qui, questo ambiente stromale è offerto alle cellule tumorali, come un frammento di tessuto vivente. Aspetti di supporto per la rilevanza del saggio sono molteplici. Invasione nel saggio è in conformità con i criteri di invasione cancro: occupazione progressiva e sostituzione nel tempo e nello spazio del tessuto ospite, e l'invasività e la non-invasività in vivo delle cellule confrontano generalmente correla con l'esito del test. Inoltre, il modello di invasione delle cellule in vivo, come definito da patologi, si riflette nelle immagini istologiche nel test. Quantitative relazione struttura-attività (QSAR) analisi dei risultati ottenuti con numerosi composti organici congeneri potenzialmente anti-invasivi consentito lo studio delle relazioni struttura-attività di flavonoidi e calconi e noti farmaci antimetastatici utilizzati in clinica (ad esempio, inibitori microtubuli ) inibiscono l'invasione nel test pure. However, il test non tiene conto dei contributi immunologici per l'invasione del cancro.
Introduction
Invasion è il segno distintivo di tumori maligni. Questa attività porta non solo alla distruzione dei tessuti circostanti, ma è anche implicato nella formazione di metastasi. Dal momento che i malati di cancro muoiono per invasione e metastasi, e trattamenti anti-invasivi efficienti sono ancora scarse, analisi di laboratorio che simulano l'invasione delle cellule tumorali sono stati sviluppati. L'obiettivo del saggio cuore pulcino è quello di offrire un metodo di coltura degli organi competenti di studiare invasione tumorale in tre dimensioni. Il dosaggio può distinguere tra cellule invasive e non invasive, e permette di studiare gli effetti dei composti di prova su invasione tumorale.
La logica dietro l'uso del test è il concetto stesso che i tumori sono ecosistemi in cui le cellule neoplastiche interagiscono continuamente con il loro stroma (cellule dell'ospite e matrice extracellulare), e che attraverso queste interazioni molecolari invasione è messo a punto 1. Così, nel dosaggio cellule tumorali si confrontano con living frammenti cardiaci pulcino embrionali 2, che servono non solo come substrati per l'invasione da parte delle cellule tumorali, ma anche come fonte di diversi tipi di cellule stromali e elementi di matrice. Il cuore pulcino contiene miociti, fibroblasti e cellule endoteliali, e la matrice extracellulare è composto di laminina, fibronectina e diversi tipi di collagene. In questo modo, il tridimensionale tecnica di coltura organo copre molte interazioni cellulari e molecolari implicati nell'invasione di tumori paziente.
Il vantaggio principale del saggio cuore pulcino è l'implementazione di effetti stromali. Questo aspetto è più completa rispetto ad altri test di invasione in vitro che si basano su l'invasione delle cellule tumorali in gel non viventi composte da membrana basale 3 o matrice interstiziale 4 molecole. Il concetto di confronto tra le cellule tumorali e normali tessuti ostia vivente come si trova nella cultura organo sperimentazione è stata introdotta da variautori tra Wolff e Schneider in Francia 5, Easty e Easty nel Regno Unito 6, e Schleich in Germania 7. Due vantaggi tecnici del cuore pulcino invasione dosaggio rispetto ai metodi citati è che il volume dei frammenti può facilmente essere standardizzate, e che rimangano contrattile, che consente il monitoraggio integrità funzionale durante la coltura d'organo. Inoltre, gli embrioni aviaria sono preferiti, perché possono facilmente essere sezionati dal contenuto sterile dell'uovo. Il test ha somiglianza concettuale al pulcino chorioallantois membrane assay 8 offrendo un stromale complesso circostante per le cellule tumorali.
Il dosaggio è stato applicato con successo per distinguere tra le varianti cellule invasive e non invasive dagli stessi tumori umani come nel MCF-7 (mammaria) 9 e HCT-8 (colon) 10 famiglie di linee cellulari. La tecnica è utile per testare composti potenzialmente anti-invasive e
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Protocol
Figura 1. Schema delle varie fasi del test. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
1. Preparazione di Precultured cuore Fragments (PHFS)
- Incubare un uovo fecondato pulcino a 37 ° C per 9 giorni. Completa questa incubazione entro una data che consenta stesura definitiva PHFS per 4 giorni (ad esempio, su una Giovedi) e confronto finale con aggregati di cellule tumorali (per esempio, sul nido Lunedi).
- Disinfettare la shell con 70% (v / v) etanolo in acqua. Effettuare tutte le ulteriori manipolazioni in un armadio di coltura utilizzando soluzioni sterili e materiali. Aprire il guscio al polo embrionale con pinze smussato.
- Estrarre l'embrione da Holding al collo con un cucchiaio enucleazione (Figura 2). Posizionare l'embrione in una capsula di Petri di vetro con un diametro di 5 cm contenente 5 ml di soluzione salina di Ringer.
- Aprire la pelle toracica ventrale strappando aperto la pelle con un brusco pinza in entrambe le mani, rimuovere lo sterno dallo stesso tipo di manipolazione, e sezionare il cuore con le forbici microdissezione iridectomia scollegare suoi principali vasi sanguigni. Eseguire tutte le ulteriori manipolazioni sotto un macroscopio con una griglia oculare calibrata.
Figura 2. Sollevamento l'embrione fuori l'uovo con un cucchiaio di enucleazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Trasferire il cuore ad una piastra di Petri di vetro conun diametro di 5 cm contenente 5 ml di MEM-Rega medio 3 coltura con siero fetale bovino al 5%. Rimuovere gli atri e dei vasi associati dalla resezione del terzo craniale superiore del cuore utilizzando microdissezione forbici iridectomia. Sezionare il pericardio dai ventricoli con un paio di pinze taglienti.
- Fare un emisezione sagittale nei ventricoli con microdissezione iridectomia forbici, e rimuovere il sangue delicatamente agitando con una pinza taglienti.
- Trasferire i ventricoli in un'altra piastra di Petri di vetro con un diametro di 5 cm contenente 5 ml di fresco MEM-Rega medio 3 coltura con siero fetale bovino al 5%. Tagliare i ventricoli in pezzi di circa 0,4 mm di diametro, utilizzando forbici microdissezione iridectomia. Un cuore può produrre circa 100 frammenti.
Nota: Un cuore può produrre circa 100 frammenti - Ruotare delicatamente la piastra di Petri di guidare tutti i frammenti ventricolari verso il centro del piatto. Rimuovere tutti i corpora Aliena con ago in acciaio inossidabile da settembreli arating dai frammenti ventricolari e li guida verso la periferia del piatto Petri.
- Trasferire i frammenti del cuore con una pipetta Pasteur di vetro ad un pallone da 50 ml Erlenmeyer contenente da 2 a 3 ml di terreno di coltura (MEM-Rega 3 più 10% v / v di siero fetale bovino).
Nota: Il volume medio esatto dipende convessità inferiore variabili dei singoli flaconi: il centro del loro fondo deve essere coperta da una pellicola sottile di solo liquido. - Gas beuta (s) con una miscela di 5% di CO 2 in aria tramite i tappi, e incubare la beuta (s) su un agitatore gyrotory a 37 ° C a 70 giri / min (rpm) per 24 ore. La logica di questo passo coltura in sospensione è quello di ottenere frammenti di tessuto cardiaco sferoidali adatti per la successiva confronto con aggregati di cellule tumorali.
- Trasferire i frammenti di cuore e il loro terreno di coltura di una piastra di Petri. Eliminare corpora aliena, necrotiche (scuro) frammenti, e conglomerati di frammenti di cuore con un ago.
- Incubare i frammenti di cuore rimasti in un'altra beuta da 50 ml contenente 6 ml di terreno di coltura come descritto al punto 1.9 per un altro 60 h.
Nota: In questo periodo di incubazione, i frammenti diventeranno sferica. Sono costituiti da un nucleo di mioblasti e uno strato sottile di cellule fibroblastiche alla periferia. - Selezionare frammenti sferoidali espongono un sottile strato omogeneo di cellule fibroblastiche (formando una capsula traslucido) e un diametro di 0,4 mm mediante un macroscopio e aghi. Un cuore pulcino produrrà circa 20 PHFS adatti. Trasferire questi PHFS, molti dei quali si contrarrà ritmicamente a 37 ° C, ad un altro piatto Petri contenenti terreno di coltura fresco. Questi PHFS sono pronto per un confronto con le cellule di prova.
2. Preparazione e confronto di aggregati di cellule sferoidale test
- Preparare terreno agar semisolido: sciogliere 100 mg di agar in 15 ml di soluzione salina di Ringer per bollitura tre volte. Frescola sospensione a 40 ° C e aggiungere 7,5 ml della soluzione di sale di Ringer / albume (1: 1) e 7,5 ml di siero bovino fetale.
- Preparare 6 ml di una sospensione contenente 1 × 10 5 cellule / ml di prova nel loro terreno di coltura appropriato in un matraccio da 50 ml Erlenmeyer. Fare questo 3 giorni prima è previsto l'inizio della cultura Confronting. Incubare la beuta su un agitatore gyrotory a 37 ° C a 70 rpm per 3 giorni. GAS beute con una miscela di 5% o 10% (v / v) di CO 2 in aria, a seconda del tipo di terreno di coltura utilizzato.
- Mostra gli aggregati sotto un macroscopio attrezzata con una griglia oculare calibrato. Selezionare (con un ago) aggregati cellulari sferoidale con un diametro di 0,2 mm.
- Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire otto PHFS selezionati (diametro = 0,4 mm), in una quantità minima di terreno di coltura di un vetro di orologio embrionale contenente agar semisolido 13. Spostare i singoli PHFS con un ago per formare un cerchio. Aspirare il terreno in eccessoutilizzando un piccolo pezzo di carta da filtro (vedi Figura 3).
Figura 3. L'aspirazione di liquidi in eccesso intorno PHFS. Otto PHFS sono immessi sul agar semisolido in un vetro da orologio embrionale, e l'eccesso di liquido viene rimosso con un piccolo pezzo triangolare carta da filtro op. Le frecce indicano le 8 singole PHFS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Portare dieci aggregati di cellule sferoidali selezionati (diametro = 0,2 mm) nel cerchio utilizzando una pipetta Pasteur. Aspirare eccesso di terreno. Spostare un aggregato verso ciascuno dei PHF con l'ago fino al contatto con l'altro. Aspirare il terreno in eccesso con un piccolo pezzo di carta da filtro.
- Sigillare il coperchio del vetro di orologio con paraffina, e incubate a 37 ° C per 4 - 24 ore, a seconda delle proprietà adesive delle cellule di prova al PHFS.
- Immergere le coppie confrontano con pre-riscaldato (37 ° C) terreno di coltura, e trasferire ciascuna singola coppia con una pipetta Pasteur in una beuta 5 ml contenente 1,5 ml di terreno di coltura.
- Incubare i flaconi su un agitatore gyrotory a 37 ° C regolato a 120 rpm. Gas La boccette con 5% o 10% (v / v) di CO 2 in aria, a seconda del tipo di terreno di coltura utilizzati per le celle di prova (vedere Figura 4).
- Al fine di evitare la concentrazione dei mezzi di comunicazione, inumidire i gas facendoli passare attraverso due 5 ml beute supplementari riempiti con 2 ml di soluzione salina di Ringer. Aggiornare il terreno di coltura ogni 8 giorni.
Figura 4. Piccola beute sulla cima di una Shak gyrotory. er I palloni con 1,5 ml di terreno di coltura sono sigillate con tappi in silicone dotati di un gas in - e ago presa e spostati a 120 rpm a 37 ° C. Il gas è guidata da un tubo di ingresso (1) al pallone grande Erlenmeyer (2) riempito con soluzione salina sterile di Ringer, e ulteriormente distribuiti (3 e 4) per flaconi più piccoli contenenti terreno di coltura con singole coppie affrontare (5 e 6). Infine, il gas esaurito viene raccolto in un pallone più grande con una trappola di acqua sterile (7), da dove può sfuggire in aria (8). La figura mostra due gruppi di batterie cultura sulla cima di una piastra piattaforma fatta in casa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
3. Istologia delle Culture Affrontare
- Preparare la soluzione di fissaggio di Bouin-Hollande.
- Sciogliere 2.5 g di acetato rameico (neutro) in 100 ml di acqua distillata e single-aggiungere lentamente 4,0 g di acido picrico.
- Filtrare la soluzione attraverso un filtro di carta. Aggiungere 10 ml di formalina e 1 ml di acido acetico. Miscelare 9 parti di questa soluzione con 1 parte di una soluzione di cloruro mercurico satura singolo distillata.
ATTENZIONE: Questa soluzione contiene numerose sostanze tossiche. Formalina è tossico per inalazione, contatto con la pelle, e per ingestione. L'acido acetico è corrosivo per bocca e del tratto intestinale dopo l'ingestione. L'acido picrico è allergenico ed esplosivo quando riscaldato rapidamente o percussioni. Cloruro mercurico è altamente corrosivo per le mucose e nefrotoxic. Indossare indumenti protettivi e guanti per la preparazione di soluzione di Bouin-Hollande, e gestirlo in una zona remota e ben ventilato dal fuoco. Una procedura di sintesi alternativa si riferiscono al 4% di formaldeide in soluzione salina tamponata con fosfato.
- Fissare le singole culture dopo parecchi giorni o settimane di incubazione come segue. In primo luogo, trasferire le culture al sale di Ringersoluzione per alcuni secondi per rimuovere le proteine sieriche. Successivamente, immergere in capsule Petri con un diametro di 3 cm contenente soluzione di fissaggio 3 ml di Bouin-Hollande per circa 2 h.
- Risciacquare le culture tre volte in 3 ml di acqua demineralizzata prima incubazione in acqua per 2 ore per rimuovere la soluzione il più possibile il fissaggio. Infine, trasferire a 3 ml di 70% (v / v) etanolo in acqua. Conservare le culture in questa soluzione O / N, ma questo può essere esteso per un numero di giorni.
- Disidratare trasferendo sequenzialmente attraverso vasi contenenti 100 ml di 96% (v / v) etanolo in acqua, etanolo al 100% o 100% di isopropanolo, e 100% xilene per 2 ore ciascuno.
- Trasferire ciascuna cultura vetrino coprioggetti separata (con una minima quantità di xilene), posizionare il coprioggetto sul fondo di una capsula bottiglia di vino per paraffina, e coprire il materiale fissato con paraffina liquida a 56 ° C. Incubare a 56 ° C per 24 h, e poi raffreddare il materiale incorporato per RT.
ATTENZIONE: In qualità di xilene derivato del benzene può essere tossico dopo l'inalazione e devono essere maneggiati solo aree ben ventilate.
- Trasferire ciascuna cultura vetrino coprioggetti separata (con una minima quantità di xilene), posizionare il coprioggetto sul fondo di una capsula bottiglia di vino per paraffina, e coprire il materiale fissato con paraffina liquida a 56 ° C. Incubare a 56 ° C per 24 h, e poi raffreddare il materiale incorporato per RT.
- Rimuovere la capsula bottiglia di vino e il vetrino, e tagliare fuori il blocco di paraffina, che contiene la cultura fissa.
- Fai 8 micron sezioni di paraffina di spessore della coppia tutta Confronting utilizzando un microtomo 14, e raccogliere tutte le sezioni su tre alternati vetrini da microscopio che sono stati pretrattati con soluzione adesiva tessuto come agente attaccare. Evitare di bianco d'uovo come agente attaccare, perché può interferire con immunocolorazione.
Nota: Pretrattamento dei vetrini da microscopio viene fatto consegnando 1 piccola goccia di soluzione di tessuto adesivo e 3 piccole gocce di acqua demineralizzata con una pipetta Pasteur e mescolandoli a coprire la diapositiva. - Rimuovere la paraffina dalla prima diapositiva immergendo due volte in un barattolo contenente 100 ml 100% xilene per 10 min.
- Reidratare i vetrini per immersione per 10 s inbarattoli contenenti 100 ml delle seguenti soluzioni: xilene / etanolo (1: 1), 100% di etanolo, 96% (v / v) etanolo in acqua, 70% (v / v) di etanolo in acqua, e infine acqua demineralizzata.
- Sciogliere cristalli di cloruro mercurico di immersione in un barattolo contenente 100 ml di 0,5% (w / v) di iodio in 96% (v / v) di etanolo in acqua per 2 min.
- Cancellare sezioni in un barattolo contenente 100 ml di 5% (w / v) di tiosolfato di sodio in acqua per 10 secondi. Poi lavare accuratamente i vetrini in acqua distillata.
- Incubare i vetrini in un vaso contenente ematossilina 100 ml di Harris 'per 2 minuti, immergere brevemente in 0.1 M HCl, e poi lavare in acqua corrente per 10 minuti.
- Incubare in un barattolo contenente 100 ml eosina 0,1% (w / v) in acqua per 1 min.
- Disidratare via breve immersione in vasi contenenti 100 ml della seguente serie di soluzioni: acqua demineralizzata, 70% (v / v) etanolo, 96% (v / v) etanolo, 100% etanolo due volte, xilene-etanolo (1: 1) , e infine in 100% xilene.
- Montare ilvetrini con mezzo di montaggio fornendo 2 gocce separate del mezzo sui vetrini, lasciate che questi espandono mettendo un coprioggetto su di essi, e lasciate indurire a temperatura ambiente per 24 h.
4. immunoistochimica
- Preparare soluzione fisiologica tamponata con Tris (TBS). Sciogliere 6.0 g di tris (idrossimetil) -aminometano (Tris base) e 45,0 g di NaCl in 4,5 L di acqua demineralizzata. Portare a pH 7,6 con 1 M HCl (circa 42 ml). Aggiungere acqua distillata per fare 5 L.
- Preparare tampone Tris-HCl. Sciogliere 60 g di Tris base in 800 ml di acqua demineralizzata. Portare a pH 7,6 con HCl 6 M (circa 65 ml). Aggiungere acqua distillata per fare 1 L. Diluire 10x con acqua distillata prima dell'uso.
- Preparare Tris-BSA tampone 0,1%. Sciogliere 12,1 g di Tris base e 45,0 g di NaCl a 4.5 L di acqua demineralizzata. Portare a pH 8,2 con 1 M HCl (circa 42 ml). Aggiungere 5,0 g di albumina sierica bovina (BSA) e 6,5 g di NaN 3. Aggiungere acqua demineralizzata per fare 5 L.
ATTENZIONE: NaN3 è altamenteprodotto tossico. Contatto con acidi libera gas molto tossici. Indossare guanti e di evitare l'ingestione con tutti i mezzi. NaN3 forme composti esplosivi molto sensibili con rame, piombo e altri metalli. Lavelli a filo con abbondante acqua. Un conservante alternativa è 0,01% tiomersale. - Segui elementi 3,2-3,10.
- Immergere i vetrini in TBS o Tris-0.1% tampone BSA, e pulire i liquidi in eccesso intorno alle sezioni usando un tovagliolo di carta.
- Applicare 150 microlitri di siero normale di capra diluito 1:20 in TBS o 5% (w / v) in Tris-BSA 0,1% (w / v) di tampone BSA per 30 minuti in una camera ad alta umidità (un contenitore chiuso per la co -incubation delle diapositive con un destinatario acqua aperta garantendo un'elevata umidità all'interno). Quindi rimuovere il liquido in eccesso con un tovagliolo di carta.
- Applicare 150 microlitri antisiero diluito in Tris-0.1% (w / v) integrato con BSA 1% (v / v) di siero di capra normale per almeno 2 ore in una camera ad alta umidità. Determinare la diluizione ottimale dell'antisiero primaria empiricamentemente.
Nota: Immunoistochimica può essere utilizzato per rilevare antigeni cardiaci pulcino ma, utilizzando anticorpi specifici, la tecnica descritta per antigeni cardiaci pulcino può essere applicato ad altri antigeni (come la proteina fluorescente verde) 15 pure. - Lavare i vetrini due volte in tampone Tris-0.1% w / v BSA in una tabella dondolo per 5-10 min.
- Rimuovere il liquido in eccesso con un tovagliolo di carta e applicare 150 microlitri di capra anti-antisiero di coniglio in eccesso (per es., 1:20 in TBS) per almeno 1 ora in una camera ad alta umidità.
- Lavare due volte con TBS su un tavolo a dondolo per 5-10 min.
- Rimuovere il liquido in eccesso con un tovagliolo di carta. Applicare complesso perossidasi anti-perossidasi diluito 1: 250 in TBS addizionato con 1% (v / v) di siero di capra normale per almeno 1 ora in una camera ad alta umidità. La diluizione del complesso dipende dal lotto.
- Lavare i vetrini con TBS e trasferimento in Tris-HCl pH 7,6.
- Trasferire i vetrini in una Tris-HCl contenente 0,25 g / L di diaminobenzidina e 0,01% (v / v) H 2 O 2 per alcuni minuti. Interrompere l'incubazione quando il cuore pulcino è macchiato. Controllare regolarmente sotto il microscopio.
- Trasferire i vetrini in Tris-HCl per 10 min e poi acqua distillata.
- Segui articoli 3.13 e 3.14.
Nota: per gli antigeni che possono essere facilmente distrutti durante la fissazione, criosezionamento delle culture in grado di offrire un'alternativa per l'analisi immunoistochimica. Questo è descritto nelle seguenti fasi di protocollo: - Lavare le culture viventi con 3 ml di soluzione salina di Ringer per rimuovere le proteine del siero.
- Aggiungere una goccia di mezzo di inclusione per la (-16 ° C) esemplare titolare preraffreddato di un criomicrotomo. Trasferire il tessuto coltivato dal bordo del vetrino coprioggetti all'inizio di questa goccia prima che sia completamente congelato.
- Raffreddare la cultura a -16 ° C, ha tagliato 6 micron sezioni spesse congelate, e alla loro raccolta su gelatina rivestitavetrini.
- Fissare i vetrini in acetone a 4 ° C per 10 minuti prima di conservazione a 4 ° C.
- Segui elementi 4,5-4,15.
5. Valutazione dei risultati del test
Nota: Nel presente saggio, invasione è definita come la progressiva occupazione della PHF dalle celle di prova confrontano. Analisi microscopica di tutte le sezioni consecutive da una cultura confronto permette di ricostruire l'interazione tra gli aggregati di cellule di prova ed i PHFS in tre dimensioni.
- Osservare i diversi modelli di interazione e grado secondo la seguente scala (vedi Figura 5).
Grado 0: Solo PHF osservato. Nessuna cellula confrontano possono essere osservati.
Grado I: Le celle di prova confrontano sono attaccati alla PHF, ma non occupano il tessuto cardiaco, nemmeno gli strati più esterni di cellule fibroblastic.
Grade II bis: Occupazione del PHF è limitato al esterno ce fibroblasti-like e mioblastill strati.
IIb Grado: Il PHF ha circondato gli aggregati di cellule, ma non ci sono segni di occupazione.
Grado III: le cellule confrontano hanno occupato la PHF, ma hanno lasciato più della metà dell'importo originario del tessuto cardiaco intatto.
Grado IV: Le cellule confrontano hanno occupato più della metà del volume originale del PHF.
Nota: gradi I e II sono rispettate con popolazioni cellulari non invasivi, mentre i gradi III e IV sono tipici di invasione. Per valutare la progressione entro tempi diversi, l'analisi istologica dovrebbe essere applicata a confronto culture fisse dopo diversi periodi di incubazione.
Figura 5. Esempi di interazioni tra le cellule tumorali e confrontano PHFS. Sezioni istologiche di confronto culture colorate o con ematossilina-eosina (pannelli di sinistra) o immunohistochemically con un anticorpo contro cuore pulcino (pannelli a destra). Gradi di interazione sono definite nel testo protocollo. (H: tessuto cardiaco, T: le cellule tumorali). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
6. Valutazione tossicità dopo Trattamenti farmacologici
- Trasferire le culture confrontano in un volume minimo di 24 pozzetti multipozzetto colture di tessuti con una pipetta Pasteur.
- Lavare le culture con l'aggiunta di 500 ml di terreno di coltura senza droga, e rinfrescarsi dopo 6 ore.
- Ispezionare tutti i pozzetti al giorno per escrescenza cellulare da espianti utilizzando un microscopio invertito (lente obiettivo 40X). Dividere il numero di outgrowing culture per il numero totale di culture espiantati per ottenere un indice di sopravvivenza delle culture confrontano. Confrontare i risultati delle culture trattati con farmaci con quelli trattati con solventi.
Nota: L'uso di Ki67 immunoistochimica (per prolif cellularerazione) e di test TUNEL (per apoptosi) vengono suggerite come tecniche complementari al test espianto per la valutazione della tossicità.
7. La crescita Valutazione delle Culture Affrontare
- Fare fotografie in bianco e nero delle culture poco prima fissazione, utilizzando un microscopio equipaggiato con una fotocamera digitale (lente obiettivo 50X)
- Misurare in mm (a) più grande e più piccolo (b) Diametro della cultura tenendo conto ingrandimento.
- Calcolare il volume approssimativo (V) in mm 3 tramite la formula 16
- V = 0.4 xaxb 2
- Calcolare la crescita della coltura confrontando questo volume finale con i volumi combinati di PHF e aggregata cella all'inizio del confronto.
Nota: Poiché PHFS solitari tendono a diminuire il loro volume durante la coltura, la crescita delle coppie confrontano dipende dalle cellule tumorali.
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Representative Results
Le sezioni istologiche come illustrato nella figura 5 mostra il risultato finale di una serie di saggi di successo. L'istologia suono delle culture indica cellule vitali e permette di interpretare l'interazione tra cellule tumorali e tessuto normale. Inoltre, nessuna reazione immune dal tessuto normale può osservare, che conferma la corretta età degli embrioni di pollo utilizzati ad esempio, prima che il sistema immunitario di rigetto è sviluppato. Non ci sono batteri visibili, il che indica l'assenza di contaminazione (lordo) durante il periodo di coltura. Infine la periferia arrotondate delle sezioni conferma coltura in sospensione senza segni di (temporanea) aderenza alla parete beuta.
Molti composti sono stati analizzati con il test. I farmaci sono generalmente forniti al mezzo di coltura nel momento in cui le confrontano PHF / tumorali coppie aggregati vengono trasferiti alle piccole beute (passo 2.7). Alcuni sono stati utilizzati come strumenti (noto ininibitori ed attivatori) per svelare percorsi e molecole effettrici implicati nel processo di invasione tumorale. Per altri composti che sono stati strutturalmente simili, una relazione quantitativa struttura-attività (QSAR) è stato istituito sulla base dei risultati del test pulcino cuore di invasione. Così, per polyphenolics correlati sono stati utilizzati un numero di descrittori computazionali per consentire la predizione della loro attività anti-invasiva nel saggio. In un periodo di 15 anni 139 diversi analoghi sono stati testati per i loro possibili effetti anti-invasivi nel test, e le loro attività sono stati raggruppati in 4 classi. Una formazione e un set di validazione composto da 93 e 46 di questi polifenoli rispettivamente sono stati selezionati in modo casuale. Per mezzo di una rete neurale artificiale QSAR i risultati del set di validazione hanno mostrato una chiara correlazione tra le attività anti-invasivi previsti e sperimentali 17 (vedi Figura 6).
I dati mostrano la robustezza di the pulcino saggio di invasione cuore, dal momento che la correlazione tra risultati previsti e sperimentali era valido in 15 anni, e confermato in un recente (non pubblicato) studio previsione con differenti polifenoli. La matrice di confusione illustrato nella figura 6 riassume la debolezza e la forza del dosaggio graficamente: dà un'espressione approssimativa della precisione e la riproducibilità. L'interpretazione di questo grafico dovrebbe tener conto della variabilità biologica di vivere colture d'organo, e il punteggio quantitativa semi dei risultati invasione.
Figura 6. La validazione esterna di un modello QSAR predittivo (rete neurale artificiale) per l'attività di piccole molecole nel test pulcino cuore invasione. L'uscita di questo modello è la classe di attività anti-invasiva di un composto. Quattro tali classi sono state definite, ripresenting la concentrazione più bassa alla quale una molecola esercita attività anti-invasiva (cioè grado invasione I o II) nel saggio CHI: classe 4 (attivo fino a 1 micron), classe 3 (10 micron), classe 2 (100 micron) e la classe 1 (nessuna attività anti-invasiva a concentrazioni fino a 100 mM). La matrice di confusione raffigurato paragona previsto e determinato sperimentalmente classi di attività anti-invasivi per i composti del set di validazione. Il set di validazione contiene 46 composti, la formazione impostata 93. predizioni del modello si basano esclusivamente su descrittori calcolati dalla struttura molecolare, e può quindi essere ottenuto per i composti ipotetiche. In questo modo, gli sforzi di sintesi può essere focalizzata su molecole promettenti nell'attività silico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Durante la preparazione di PHFS, i frammenti potrebbero non rimanere in sospensione, ma aderire alla parete del vaso; questo può essere superato aumentando il volume del mezzo di coltura. Se il numero di PHFS è troppo bassa e la loro dimensione è troppo grande, diminuire il volume del terreno di coltura. Fallimento delle celle di prova per aggregare può essere dovuto a fluttuazioni nella temperatura e conseguente infezione microbica. In alternativa, l'incapacità di aggregare può essere una caratteristica intrinseca delle cellule. Durante fissaggio degli aggregati a PHF, scarsa adesione può essere superato estendendo il periodo di incubazione in cima al terreno semisolido agar o rimuovendo più fluido terreno di coltura intorno alle colture mediante assorbimento carta da filtro. Controllare anche per la contaminazione microbica in questo caso. Difficoltà durante sezionamento possono essere dovuti alla disgregazione dei blocchi di paraffina: ciò avviene quando il periodo dei blocchi di memorizzazione è stata troppo lunga (fondere nuovamente la paraffina). Quando sezionamento arteverificano ifacts, l'integrità della lama microtomo e assenza di corpo aliena nelle colture fisse dovrebbero essere controllati. Aree necrotiche nelle culture sono segni di condizioni di coltura povere. Se queste aree sono limitate al centro delle culture, si dovrebbe sospettare il volume delle scontri troppo grandi. Accurata scelta dei volumi dei PHF e cellulari aggregati è infatti un fattore critico. Tuttavia, più generalizzata punti necrosi verso inadeguato controllo del pH, la contaminazione microbica o artefatti di fissaggio. Infine, quando le sezioni risultano troppo scuri, il periodo di immersione in ematossilina può essere troppo lungo, o sezioni potrebbe essere troppo spessa (> 8 micron).
Molte variazioni sul dosaggio cuore pulcino sono stati applicati con successo negli studi di invasione. Queste variazioni riguardano l'origine del tessuto ospite, la presentazione delle celle di prova confrontano, e le condizioni di incubazione. Frammenti di cuore da speciediverso pulcino 18, e da tessuti come fegato 19, polmone 20 e cervello 21, sono stati esaminati. Invece di aggregati, biopsia campioni 22 frammenti monostrato 23, e sospensioni cellulari sono stati utilizzati per confrontarsi con PHF nella cultura d'organo. Colture in sospensione sono talvolta sostituiti da culture statiche su di un substrato 24 semisolido e scontri privi di siero hanno dimostrato di essere fattibile con alcuni tipi di cellule 25. Generalmente, l'interazione è descritta secondo una scala quantitativa semi 26 Tuttavia, sistemi di analisi automatica delle immagini computerizzate sono stati sviluppati anche 27,28. Quest'ultimo obiettivo di fornire informazioni quantitative sul grado di invasione delle cellule tumorali.
Come il saggio cuore pulcino comprende un tessuto ospite vivente, il programma di installazione tenta di ricapitolare la situazione in vivo, e chiaramente è di una certa rilevanza a fronte di osistemi ther in vitro (vedi sezione introduttiva). Va tuttavia riconosciuto che il saggio non riesce a comprendere tutti gli elementi del microecosistema presente nei tumori naturali, ambienti dove per esempio fattori immunologici possono influenzare il comportamento invasivo delle cellule tumorali. In almeno uno studio, l'assenza di tali fattori nel saggio ha portato a risultati contraddittori tra i risultati del test cuore pulcino 29 e quelle di un modello animale 30.
Un'applicazione futuro sarà lo studio delle cellule progenitrici dei cardiomiociti nel test. Queste cellule possono essere iniettate terapeuticamente in zone infarto di pazienti cardiopatici, ma dovrebbero essere in grado di integrare nel miocardio. Nel saggio cuore pulcino le cellule progenitrici si confronteranno con frammenti di cuore pulcino, e la loro migrazione e differenziamento saranno analizzati.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
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