Abstract
Sem, uma população de células florescente activo que é bem distribuído e ancorado de forma estável com o molde inserido, a regeneração óssea excepcional não ocorre. Com os modelos convencionais, ausência de micro-canais internos resulta na ausência de infiltrado celular, distribuição, e inhabitance profundo no interior dos moldes. Assim, um modelo altamente porosa e uniforme interligado-trabecular de ossos como com micro-canais (modelo microambiente biogênicas; BMT) foi desenvolvido para superar estes obstáculos. O romance BMT foi criado por conceitos inovadores (ação capilar) e fabricado com uma técnica de revestimento de esponja-modelo. O TMO é composto por vários componentes estruturais: primário-poros interconectados (300-400 um) que imitam poros em osso trabecular, micro-canais (25-70 um) dentro de cada trabecula e nanoporos (100-400 nm) sobre a superfície para permitir que as células a ancorar. Além disso, o TMO tem sido documentada pelo estudo teste mecânico para ter simILAR propriedades de resistência mecânica às do osso trabecular humano (~ 3,8 MPa) 12.
A BMT exibiu alta absorção, retenção e morada de células ao longo dos (¸) modelos em forma de ponte (de altura de 3 cm e 4 cm de comprimento). As células que foram inicialmente semeadas em uma extremidade dos modelos imediatamente mobilizados para a outra extremidade (10 cm de distância) por acção capilar do TMO no meio celular. Após 4 horas, as células homogeneamente ocupava todo o BMT e exibiu comportamento celular normal. A ação capilar representaram a infiltração das células suspensas na mídia e distribuição (migração ativa) durante todo o TMO. Tendo observado estas capacidades do TMO, projectamos BMTs que irá absorver células de medula óssea, factores de crescimento e nutrientes a partir da periferia em condições fisiológicas.
A BMT pode resolver as limitações atuais via rápida infiltração, distribuição homogênea e inhabitance de células em grandes, modelos volumétricos para reparar defeitos esqueléticos maciças.
Protocol
1. Poliuretano (PU) Sponge Preparação como Modelo
- Use esponjas PU para produzir modelos de hidroxiapatita contendo poros comunicantes. Usar cada esponja para fornecer as trabéculas primária para a formação das escoras do molde, bem como a formação de micro-canais dentro de trabéculas.
- Cortar e aparar 80 ppi (poros por polegada) esponjas em 2 ponte-formas com dimensões de 3,5 cm de altura x 5 cm de comprimento x 1,5 cm de largura.
Nota: As dimensões e formas podem ser escolhidas de acordo com o tamanho de poro desejado primária: 100 ppi, 80 ppi e 60 ppi. - Adicione 100 ml de 4% (w / v) de uma solução de NaOH utilizando um copo de 150 ml; em seguida, mergulhar e espremer até que as esponjas preparadas são completamente encharcada.
- Após a imersão, coloque o copo com as esponjas do ultrasonicator (42 kHz).
- Ultrassonicamente pré-tratar as esponjas de PU para 15-20 min sem calor para modificar as propriedades de superfície.
- Enxágüe com água destiladaágua para 5-10 min. Ao lavar, apertar as esponjas e permitir-lhes expandir 5 a 7 vezes a fim de remover o NaOH residual no interior das esponjas.
- Espremer as esponjas com toalhas de papel, a fim de remover o excesso de água; em seguida secá-los num forno a 60-80 ° C.
2. A hidroxiapatita (HA) Slurry Preparação para Revestimento
- Antes de fazer a suspensão de HA, medir o peso de um copo com uma barra de agitação magnética. Esta medição vai ser utilizado para calcular a relação pó / líquido.
- Medir 10 g de HA em pó tamanho nano.
- Adicionar 20 ml de água destilada no copo de 50 ml. Calor para 120-140 ° C e agitar com um agitador magnético placa quente.
- Adicionar 0,3 g (3% w / w) de álcool polivinílico (PVA) (MW 89,000-98,000) por pó em água destilada com agitação a 300-400 rpm.
- Agita-se até o PVA estar completamente dissolvido. A solução deve ser límpida após a dissolução completa do PVA.
- Vire off o calor e adicionar 0,1 g (1% w / w) de carboximetilcelulose de sódio (CMC) (ultra-baixa viscosidade) em pó enquanto se agitava a 400-500 rpm. A solução deve ser límpida após a dissolução completa do PVA.
- Mexa até que o CMC se dissolva completamente e arrefecer à RT.
- Adicionar 0,3 g (3% w / w) de dispersante de poliacrilato de amónio em pó por agitação a 300-400 rpm. Mexa até dissolver completamente.
- Adicionar 0,2 g (2% w / w) de glicerina por pó enquanto se agitava a 300-400 rpm. Mexa até dissolver completamente.
- Lentamente dispersar o pó de HA na solução enquanto se agitava a 600-900 rpm e manter a agitação durante 5 min.
- Sonicar durante 5 min, utilizando um ultrasonicator para assegurar a dispersão de qualquer aglomeração do pó de HA.
- Adicionar um extra de 5 ml de água destilada para dentro da mistura com agitação a 600-900 rpm e aquece-se a 90-100 ° C.
- Continuar a mexer a mistura utilizando um agitador magnético a 600-800 rpm, a 90-100 ° C em order para evaporar o conteúdo de água.
- Medir o peso inteiro, incluindo o recipiente e mistura ao longo do tempo até uma razão de pó / líquido de 1,75-1,8 é obtido.
- A formatação da relação pó / líquido, dividir a massa do pó e o peso total da mistura (2,14), incluindo o pó, reagentes, e de água, menos o peso da taça e um agitador (2.1), e menos o pó de HA (2.2).
Nota: Por exemplo: Se A (mistura em pó inteiro, incluindo, reagentes, e da água) é 49,05 g, B (proveta com agitador) é de 33,5 g, e, em seguida, C (HA pó) é de 10 g.
C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 - Permitir que a suspensão arrefecer até à temperatura ambiente antes de utilizar para revestimento.
3. HA revestimento, secagem e sinterização
- Revestir as esponjas preparadas de PU com a suspensão de revestimento de HA utilizando uma espátula de aço inoxidável até a suspensão é homogeneamente distribuído em toda a esponja de PU numa placa de vidro.
Nota: Depois de retirar o excesso de injúriary, alguns dos poros ainda pode ser obstruído com pasta devido à alta viscosidade da lama. - De modo a assegurar a interligação, a uniformidade, e os poros abertos, ligeiramente soprar os modelos HA revestida utilizando um compressor de ar. Este processo garante que os moldes estão homogeneamente revestido tanto nas superfícies interiores e exteriores da esponja de PU.
Nota: Se um revestimento homogéneo não é alcançado, os modelos revestidos HA entrará em colapso durante o processo de sinterização e também podem quebrar durante o manuseio devido à baixa resistência mecânica. Além disso, o revestimento homogéneo é crítico na criação de micro-canais dentro de trabéculas. - Secam-se os modelos de HA revestidas durante um mínimo de 5 horas, sob condições de arrefecimento (20-25 ° C) com circulação de ar suave. No entanto, prolongar o tempo de secagem com base no tamanho do molde.
Nota: Após a secagem, os modelos revestidos HA irá encolher tipicamente cerca de 8% a 10% em cada dimensão. - Após o processo de secagem, colocar o HAmodelos revestidos de um cadinho de alumina. Em seguida, colocá-los em um forno de alta temperatura e usar o 8 passo seguinte perfil sinterização.
- Calor de 2 ° C / min até 230 ° C.
- Calor 1 ° C / min até 280 ° C.
- Aquecer 0,5 ° C / min até 400 ° C.
- Calor 3 ° C / min até 600 ° C. Mantenha a 600 ° C por 1 hora.
- Aquecer 5 ° C / min até 1230 ° C. Manter 1230 ° C durante 3 h.
- Arrefecer 5 ° C / minuto até à temperatura ambiente.
Nota: a sinterização irá reduzir ainda mais os modelos de esponja revestidas por HA de cerca de 22% - 25% em cada dimensão.
4. Ingress e inhabitancy de células em Template
- Culturas de células MC3T3 pré-osteoblásticas em um meio não-osteogénica que consiste em α-MEM, suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de antibióticos (estreptomicina e penicilina) a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO 2 .
- Adicionar 10 mlde uma suspensão de células a 2 x 10 6 a densidade celular em uma única bem dentro de uma placa de 6 poços.
- Coloque o molde em forma de ponte de 3 cm x 4 cm x 1 cm verticalmente na placa de 6 poços. Coloque uma perna do modelo na placa que contém a suspensão de células, e a outra perna num poço vazio adjacente.
- Permitir que o molde para absorver a suspensão de células durante 10 min.
- Adicionar 5 ml de meios em seguida para o poço que foi inicialmente cheio com a suspensão de células.
- Reabastecer o meio em ambos os poços cada 2 ou 3 dias até 7 dias se passaram.
- Determinar a eficácia da mobilidade celular por hematoxilina e eosina 11.
- Fixar as células e andaime por imersão em EtOH a 100% por 20-30 min.
- Mancha com hematoxilina para 1-2 min.
- Enxágüe com água destilada por 1-2 min por duas vezes.
- Desidratar por imersão em 70%, depois 95%, depois 100% de EtOH durante 1-2 min cada.
- Coram com eosina por 20-30 seg.
- Enxágüe com água destilada por 12 min para o dobro.
- Desidratar por imersão em 70%, 80%, 90%, e 100% de EtOH durante 1-2 min cada.
- Incorporar o andaime em uma resina acrílica para seccionamento e de imagem.
- Determinar a viabilidade celular, com o ácido 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazólio (MTT) a viabilidade celular e ensaio vivo / morto (células vivas / mortas kit de coloração com MPTP) no tempo de pontos do dia 3 e 7 11.
Nota: O esquema de protocolos de fabricação do modelo de osso-como são representados no "Resultados representativos" sessão.
Representative Results
A estrutura geral do TMO exibe um modelo tridimensional original com estruturas internas do osso trabecular semelhante. A BMT contém macro-poros, micro-canais, e nano-poros. Configurações claras de totalmente interligadas macro-poros (tamanho médio de 320 mícrons), micro-canais (diâmetro médio de 50 mm), e nano-poros (tamanho médio de 100 nm) foram verificadas com um microscópio eletrônico de varredura (EVO-40; Zeiss), bem como através de micro-tomografia.
A Figura 1 mostra protocolos detalhados passo a passo na criação de um TMO. Através de um controlo preciso dos protocolos de preparação das esponjas de PU para o processo de sinterização (P1 - P7; Figura 1), as características seguintes podem ser obtidos: uma superfície altamente denso e liso após o revestimento de HA e secagem; um precisamente moldada e dimensionada de 3-D do modelo; uma rede trabecular poroso completamente interligada semelhante à do osso trabecular; e micro-canais sagacidadehin cada trabecula que imitam canais intra-ósseos, tais como canais de Havers e canais de Volkmann (Figuras 2 e 3). Além disso, relativamente elevada resistência mecânica (~ 3,8 MPa) semelhante ao do osso trabecular humano foi medido por um teste de resistência à compressão. Altamente histomorfométricas parâmetros semelhantes com os da vértebra lombar humano osso trabecular foram confirmadas por análise de micro-CT 12. Diferentes magnitudes de ação capilar foram demonstrados através de diferentes diâmetros capilares na Figura 4, utilizando simulação computacional. Através destas simulações, projetamos que a BMT exibiria diferentes taxas de absorção dentro das primárias-poros (300-400 um) e micro-canais (25-70 um), com base nos diâmetros. Capilares menores exibiram capacidades de absorção fortes. Esta suposição foi verificada nesta experiência como demonstrado na Figura 5.
O TMO exibiu altamente eficazabsorção e retenção de fluido através da acção capilar das estruturas micro-canal; mancha azul de Stevenel foi usado como meio de fluido para controlar facilmente o fluxo (Figura 5). Com base na simulação computacional, o TMO com estas configurações foram observados para absorver e reter suspensões de células de até 8,5 cm de distância total dentro de 10 seg. Devido a uma forte acção capilar induzida por as estruturas internas, a forma manchado atingido a extremidade oposta de um 3 cm (altura) x 4 cm (comprimento) x 1 cm (largura) do modelo em forma de ponte dentro de 1 min e 40 seg. Além disso, a mobilização de células activo e incorporação no TMO foi observado (Figura 6). Subsequentemente, a mobilização de células homogénea e fixação resultou na proliferação aumentada e a formação de matriz numa formação uniformemente distribuída. Além disso, a longa distância (~ 10 cm) migração de células através do TMO foi validada imediatamente após o TMO foi saturado com a suspensão de células. Se EDED células sobreviveram no segmento modelo que foi exposta ao ar e não imersa no meio de cultura. Nesta experiência, o meio de cultura foi fornecido às células por exclusivamente nos poços que tocam apenas as pernas do andaime. A ação capilar exibida pelos microcanais em seguida deixada para meio fresco para alcançar a parte de cima, ponte do andaime. Após 3 dias de cultura, o modelo tornou-se ocupado com células de proliferação rápida. Após 7 dias de cultura, cada trabecula foi envolvido por matrizes extracelulares e incorporado com células 13.
Figura 1. O protocolo de fabricação modelo global semelhante ao osso a partir do pré-tratamento de PU esponja (P1) para o tratamento térmico final (P7). Mantendo o perfil exacto de sinterização após P7 é crucial para alcançar resistência mecânica favorável.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 2 microscópio estéreo Representante (AmScope; SM-2TZ-M) imagens (x4) de um ppi 80 dimensionada PU esponja (à esquerda), HA revestido e seco BMT (meio), e sinterizados BMT (direita) (Dimensão: 3. cm de altura x 4 cm de comprimento x 1 cm de largura). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Imagens Figura 3. SEM e micro-CT de um modelo biogenic: (A) uma imagem global de um modelo biogênicas,
. Figura 4. cálculo computacional de acção capilar com diferentes diâmetros de canal dentro do mesmo período de tempo (0,4 ms), enquanto o maior capilar (d = 300 uM: refere-se ao primário de poros) absorvido a forma (azul) com 0,16 mm de altura, o menor capilar (d = 30 mm: refere-se a micro-channel) absorvida a médio até 0,415 mm de altura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. As imagens mostraram diferenças de capacidades de absorção de acção capilar com base em diferentes tamanhos de poros-primárias e micro-canais (tamanho de poros primária refere-se ao diâmetro médio: 60 ppi ≈ 470 uM, 80 ppi ≈ 320 mícrons, ≈ 100 ppi 200 um). As linhas amarelas representam a acção capilar induzida pela combinação de poros primários e micro-canais. As linhas vermelhas representam a ação capilar induzida principalmente por micro-canais exibidos em cada trabecula. Como mostrado em (F), o modelo 100 ppi induzida a acção capilar mais forte, o que resulta na saturação completa do molde dentro de 39 seg. Os modelos de 80 ppi e 60 ppi foram testados depois. (B) 0 seg, (C) 0,5 s, (D) 1,5 s, (E) 17,0 seg, (F) 39,0 seg, (L) 50,0 seg, e (H) 1 min 18 seg depois da imersão. (Dimensão Template: 1cm x 1 cm x 4 cm de altura cúbico). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. A entrada e a imigração de células dos poços semeados (parte I) para os poços não semeadas parte (V) através dos modelos biogénicas induzidas por acção capilar. As células inicialmente semeadas atingido o fim da perna unseeded (Parte V) imediatamente depois saturação completa. Após 3 dias, a confluência das células foi evidente ao longo de todo o modelo. Após 7 dias, a formação da matriz de colagénio espaço-temporal ocorreu dentro das populações de células (H & E de manchas). (Dimensão Molde: 3 cm de altura x 4 cm de comprimento x 1 cm de largura). Por favor click aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Um molde de multi componente incluindo células, factores de crescimento, nutrientes, etc, é necessária para a regeneração do osso bem sucedida e restauração funcional de grandes defeitos ósseos críticos de tamanho. Dentro desses fatores, propriedades biológicas anatomicamente conformes são essenciais. Para realizar a funcionalidade biológica, o molde deve apresentar biocompatibilidade, osteocondutividade, integridade mecânica, uma superfície, uma textura de superfície adequada, e os meios para o transporte de oxigénio e de nutrientes. Ao nível celular, as seguintes características são especialmente crucial para a restauração funcional de defeitos ósseos maciços: penetração facilitado em modelo (recrutamento activo), a distribuição uniforme em todo o modelo (retenção), a proliferação acelerada e alta viabilidade (habitação). Finalmente, a formação subsequente de matriz extracelular substancial e o desencadeamento de expressão do gene são cruciais em processos biológicos essenciais, tais como uma rápida vascularizaçãoosteogênese nd.
Muitos tipos diferentes de substitutos sintéticos têm sido propostos para substituir auto- / alo- enxertos ósseos. No entanto, a organização andaime actual não exibem um microambiente interno contendo micro-canais e nano-poros, e tem, portanto, não activamente facilitar a infiltração celular, distribuição, e inhabitance em profundidade os substitutos sintéticos que são maiores do que 10 mm. Eles não fornecem pistas físicas para abrir caminho para as células de forma eficiente, rápida e uniformemente migrar profundamente o modelo de osso. Em vez disso, o recrutamento de células passiva limitado cria uma populações de células desigualmente distribuídas entre as zonas exteriores e interiores do andaime. Isto não só agrava o desafio inicial das células que atingem o núcleo interno da matriz, mas também impede o fluxo de nutrientes e comunicação celular com a outra extremidade do substituto sintético. Este tipo de resultados de recrutamento e Habitacionais celulares desproporcional na célula death e crescimento incompleto do osso depois de a escora tenha sido implantado no corpo 14,15.
Assim, nós introduzimos o conceito de ação capilar como a sugestão físico primário para superar estes obstáculos. Temos absolutamente de engenharia micro-canais na BMT para induzir a ação capilar que serão responsáveis por a força de arrasto principal responsável para recrutar células profundas na BMT.
A técnica de revestimento de esponja PU apresenta várias propriedades únicas. Em primeiro lugar, permite uma fácil preparação das estruturas porosas trabecular bem controlados, que se dependem das estruturas do molde pré-definido (ou seja, 80 poros por polegada molde para 300-400 mm). Isto é muito importante para a optimização de tamanho de poro de 15 osteoblastos infiltração. Em segundo lugar, a técnica permite a construção de micro-canais interligados, que representam o papel significativo de inicializar deslocalização da célula 11. Em terceiro lugar, quase não há limitações ao usar a esponja PU em termos de criação de formas e tamanhos dos modelos personalizados. O fabricante pode usar uma tesoura para formas simples ou até mesmo de corte a laser computadorizada para geometrias complexas. Usando essas tecnologias precisamente controladas, criamos o TMO. HA foi seleccionado como o material de partida, devido à sua biocompatibilidade e capacidade osteocondutora 17.
Neste estudo, existem vários passos críticos que precisam ser destacados. Durante a preparação das suspensões de HA, se a temperatura for demasiado elevada e a velocidade de agitação é demasiado baixa, a suspensão de HA vai ficar preso na extremidade inferior do recipiente e secar. Após o processo de revestimento, quando se sopra para fora o excesso de pasta fluida HA, demasiado elevada de uma pressão de ar pode induzir fissuras na superfície do TMO. É importante manter a pressão de ar relativamente baixo para expor adequadamente o excesso de pasta fluida HA única. Finalmente, os segundo e terceiro passos do processo de sinterizaçãosão mais crucial (calor 1 ° C / min até 280 ° C e calor de 0,5 ° C / min até 400 ° C). Neste intervalo de temperatura, a esponja PU vai queimar completamente fora enquanto o HA torna-se densa. Se este protocolo não é seguido de perto, o TMO será recolhido ou se desintegrou após a sinterização.
O TMO descrito no presente estudo oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, as macro-poros interconectados (300-400 um) imitam os de osso trabecular humano e permite o fluxo de medula óssea suave. Em segundo lugar, os moldes são constituídos por micro-canais (25-50 ^ m) em cada septo trabecular para acelerar a entrada inicial de células de osso através da acção capilar. Como demonstrado utilizando simulação computacional 13, se o modelo apenas 300 uM poros primários (poros) e não há microcanais, a acção capilar seriam insuficientes para a saturação completa do molde com medula óssea. Isso seria especialmente verdadeiro para grandes defeitos tamanho que exigiriam lmodelos de tamanho arge. Sized micrômetros de canais exibem absorção de fluidos altamente eficaz e, assim, esperava que os micro-canais a ser a principal responsável pela acção capilar em nosso estudo. Em terceiro lugar, os nossos BMTs foram estrategicamente colocados nano-poros. Dados da literatura indicam que as células são especialmente sensíveis à nano-padrões 18,19; portanto, esperado que os nano-poros nas paredes dos microcanais para desempenhar um papel no aumento da ligação de células. Poros de tamanho nano (100-400 nm) na superfície da septos trabecular permitidos para ancorar células imobilizadas. Em geral, os efeitos combinados destas três estruturas internas resultou na mobilização e adesão celular aumentada ao longo do molde. No entanto, existem algumas limitações do protocolo e os passos críticos para fabricar o BMT perfeito. Por exemplo, há muitas vezes uma grande quantidade de pasta fluida HA preparados, devido à dificuldade de manter uma viscosidade enquanto o revestimento homogéneo. Além disso, há uma limitação na tomadamodelos de mais de 5 cm 3 de volume devido ao tempo de trabalho, enquanto revestimento. A espessura do revestimento é crítico que varia de acordo com as técnicas do fabricante.
Os resultados do nosso estudo sugerem que a BMT capaz de absorver e reter as células irão oferecer potenciais vantagens sobre andaimes alloplastic convencional (ou sintético). Um estudo prospectivo, está a ser considerado para verificar os benefícios da BMT na osteogénese e / ou angiogénese, juntamente com os factores de crescimento relacionadas com os ossos. Por isso, afirmamos que o nosso único destaque BMT andaime pode tratar das principais barreiras da infiltração da medula óssea insuficiente para as construções sintéticas e regeneração óssea incompleta em grandes defeitos.
O objetivo final deste estudo é o de simplificar o paradigma atual de bioengenharia na reconstrução óssea e restauração funcional em defeitos ósseos de tamanho crítico, eliminando a necessidade de estroma da medula óssea tempo- / trabalho intensivoprocessos de células l de isolamento e expansão. Finalmente, pretendemos utilizar anatomicamente conformando-construções em 3D com micro-canais e nano-poros, que induzem uma rápida absorção celular, distribuição homogênea, e inhabitance para a reconstrução do osso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyurethan sponge | Plastifoam | PU-3215 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 167176 | |
| Hydroxyapatite Powder | Ossgen | ||
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| Carboxymethyl cellulose sodium salt | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| ammonium polyacrylate | Vanderbilt | DARVAN 821A | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G2289 |
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