类骨模板中微通道的独特毛细作用可增强细胞募集以修复大段骨缺损

本实验的总体目标是构建一种能够修复缺失或受损骨组织的骨模板微环境。首先，将聚氨酯海绵塑形并修饰，以适配骨缺损区域；第二步，将聚氨酯海绵均匀涂覆于黏稠的羟基磷灰石浆料中，随后使其干燥。

最后一步是将羟基磷灰石涂层置于高温马弗炉中进行中心加热。最终，制备出具有类似骨组织结构并带有工程化微通道的支架，该支架具备高效的细胞吸附与滞留能力。与现有的方法（如造孔剂法或3D打印技术）相比，该技术的主要优势在于，所设计的微通道可通过毛细作用促进骨组织再生过程中的营养传输。

该方法有助于解决再生医学领域中的重大挑战，例如颅颌面及节段性骨缺损的重建。该技术的应用前景还包括先天性畸形的治疗。模板在形状和尺寸上完全可定制，且毛细作用将促进细胞的长距离迁移。

尽管该方法可为骨再生研究提供见解，但也适用于其他培养系统，例如三维肿瘤培养平台。首先，将每英寸80孔的聚氨酯海绵修剪成桥形，尺寸为高3.5厘米、宽5厘米、深1.5厘米。接下来，配制100毫升4%的氢氧化钠溶液。

使用一个 150 毫升烧杯，将海绵浸入氢氧化钠溶液中，并挤出其中截留的空气，直至海绵完全浸透。浸透后，将装有海绵的烧杯置于 42 千赫的超声波中处理 15 至 20 分钟，无需加热。

完成后，用蒸馏水冲洗海绵5到10分钟，同时挤压海绵并使其膨胀5至7次，以去除海绵内部残留的氢氧化钠。用纸巾吸去海绵中多余的水分，然后将其放入60至80摄氏度的烘箱中完成干燥。开始制备羟基磷灰石浆液时，首先称量一个带有磁力搅拌子的50毫升烧杯。

接下来，向烧杯中加入 20 毫升蒸馏水，在设定为 120 至 140 摄氏度的电热板上加热，并使用磁力搅拌器搅拌。当水开始沸腾时，在持续以 300 至 400 转/分钟搅拌的同时，将 0.3 克聚乙烯醇粉末加入蒸馏水中。

搅拌至粉末完全溶解且溶液澄清。然后关闭加热，同时继续以 400 至 500 RPM 的速度搅拌，加入 0.1 克超低粘度羧甲基纤维素钠粉末，直至溶液再次变得澄清。待其完全溶解后，将混合物冷却至室温。

接着，在300至400 RPM的搅拌条件下加入0.3克聚丙烯酸铵分散剂。待其完全溶解后，在300至400 RPM的搅拌条件下加入0.2克甘油。继续搅拌混合物直至完全溶解。

然后称取10克纳米级羟基磷灰石粉末，在600至900转/分钟的搅拌速度下缓慢加入烧杯中。继续搅拌5分钟。接着将混合物置于超声仪中，超声处理5分钟，以确保分散羟基磷灰石粉末中可能存在的团聚物。然后在搅拌速度为600至900转/分钟的同时，向混合物中额外加入5毫升蒸馏水，并在90至100摄氏度下加热，使用磁力搅拌器在600至800转/分钟的转速下持续搅拌混合物。

为了蒸发水分，需不时测量包括烧杯和混合物在内的总重量，直至达到1.75至1.80的粉末与液体比例。如随附文本方案所述，在将浆料用于涂覆前，需使其冷却至室温。使用不锈钢刮刀将制备好的含羟基磷灰石浆料均匀涂布于聚氨酯海绵上，直至浆料在整个聚氨酯海绵中均匀分布，并将其置于玻璃板上。然后使用空气压缩机对海绵轻轻吹气，以确保孔隙之间的连通性、均匀性以及开放孔隙结构。

如果未能实现均匀的共混，水凝胶涂覆的模板在ING过程中会发生坍塌，并且由于成形约束较低，在操作时也可能出现开裂。此外，均匀涂覆对于在整体结构中形成微通道至关重要。将HA涂覆的模板在20至25摄氏度条件下，以温和的空气循环干燥至少五小时。

对于较大的模板，应延长此时间。干燥过程结束后，将涂有羟基磷灰石（HA）的模板置于Illumina坩埚中，然后放入高温炉内，并按照随附文本方案中描述的八步居中程序进行操作。

将10毫升含有100万个成骨前体MC3T3细胞的细胞悬液加入六孔板的一个孔中。然后将一个3厘米×4厘米×1厘米的桥状模板垂直放入六孔板中，使模板的一端插入含有细胞悬液的孔内，另一端插入相邻的空孔中。

在生物安全柜中，让细胞悬液在孔板中静置10分钟，使模板充分吸收细胞悬液。随后，向最初加入细胞悬液的孔中再添加5毫升培养基。再静置5分钟后，向另一个最初未加入细胞悬液的孔中加入5毫升培养基。

然后将装置放入培养箱中。每隔一天更换一次培养基，持续七天。实验结束时，将细胞和支架浸入装有100%乙醇的烧杯中固定20至30分钟。

将冲洗后的支架用苏木精染色液染色1至2分钟。然后再次将支架浸入盛有蒸馏水的烧杯中冲洗1至2分钟，重复冲洗两次。随后将支架浸入70%乙醇中1至2分钟，以进行脱水处理。接着将支架转移至95%乙醇中，继续浸泡1至2分钟。

最后，将支架放入100%乙醇中处理两分钟。接着，用e、s和Y对构建物进行复染，时间为一到两分钟。然后再次将支架浸入盛有蒸馏水的烧杯中两次，每次一到两分钟，以完成冲洗。

清洗后，将支架浸入梯度乙醇中进行脱水，然后进行树脂包埋。最后，将支架包埋于丙烯酸树脂中，以便切片和成像。此处展示的生物源性微环境模板在制备的各个阶段均呈现出完全相互连通的多孔小梁网络结构，类似于骨小梁的结构。

该支架具有多种结构组分，包括相互连通的主孔，其直径为300至400微米；微通道直径为25至70微米；以及表面直径为100至400纳米的纳米孔，后者可使细胞锚定。这种生物源性微环境支架可通过毛细作用将细胞接种至支架的各个区域。在完全饱和后，经伊红-苏木精染色并切片后，可清晰观察到细胞的分布情况。

培养三天后，对模板每个区域的细胞数量进行定量和追踪。培养七天后，模板被快速增殖的细胞占据，每根小梁均被细胞包埋并包裹于细胞外基质中。若操作得当，该技术在标准化后可在三天内完成。

进行此操作时，重要的是要牢记保持正确的粉末与水的比例，并在此操作过程中维持均匀的包被。此外，还可采用其他方法，如动态摇动系统或旋转培养系统，以探究涉及细胞反应的其他问题。