独特的毛细管作用通过微通道骨般的模板可以增强细胞的招募大骨缺损修复

该程序的总体目标是创建一个能够恢复缺失或受损骨骼的骨骼模板微环境。这是通过首先塑造和修改聚氨酯海绵以适应缺陷区域来实现的。第二步是将聚氨酯海绵均匀地涂在粘性羟基磷灰石浆料中，并使其干燥。

最后一步是将羟基磷灰石涂层在高温肌肉炉中居中。最终，制造出具有工程微通道的骨状模板，具有高细胞吸收和保留能力。与现有方法（如盐到达或 3D 打印技术）相比，该技术的主要优点是微通道的工程师在tra中诱导毛细作用。

这种方法可以帮助解决再生医学领域的重大挑战，例如颅颌面和节段性骨缺损的重建。该技术的意义延伸到先天性畸形的治疗。这些模板的形状和大小是完全可定制的，毛细管作用将促进细胞长距离迁移。

虽然这种方法提供了对再生骨骼的见解，但它也可以应用于其他培养系统，例如 3D 癌症培养平台。首先将每英寸 80 个孔的聚氨酯海绵修剪成高 3.5 厘米、宽 5 厘米、深 1.5 厘米的桥形。接下来，制备 100 毫升 4% 氢氧化钠溶液。

使用 150 毫升烧杯。将海绵浸入氢氧化钠溶液中，挤出捕集空气，直到海绵完全浸泡。饱和后，将装有海绵的烧杯放入 42 kHz 的超声波加热中 15 至 20 分钟，不要加热。

完成后，用蒸馏水冲洗海绵 5 到 10 分钟，同时冲洗，挤压海绵并让它们膨胀 5 到 7 次，以去除海绵内残留的氢氧化钠。用纸巾擦去海绵上多余的水，然后将它们放入 60 至 80 摄氏度的烤箱中以完成干燥。要开始制作羟基磷灰石浆料，首先用磁力搅拌棒称量 50 毫升烧杯。

接下来，将 20 毫升蒸馏水加入烧杯中。在设置为 120 至 140 摄氏度的热板上吃水，并使用磁力搅拌搅拌。当水开始沸腾时，将 0.3 克聚乙烯醇粉放入蒸馏水中，同时以 300 至 400 RPM 的速度搅拌。

搅拌至粉末完全溶解，溶液澄清。然后关火，加入 0.1 克超低粘度羧甲基纤维素钠粉，同时继续以 400 至 500 RPM 的速度搅拌，直到溶液变清。再次溶解后，将混合物冷却至室温。

接下来，加入 0.3 克聚丙烯酸铵分散剂，同时以 300 至 400 RPM 的速度搅拌。搅拌至完全溶解，然后加入 0.2 克甘油，同时以 300 至 400 RPM 的速度搅拌。搅拌混合物，直到它完全溶解。

然后称取 10 克纳米级羟基磷灰石粉末，慢慢加入烧杯中，同时以 600 至 900 RPM 的速度搅拌。继续搅拌 5 分钟。接下来，将混合物放入超声波中并超声处理 5 分钟为确保分散羟基食欲粉的任何团聚，然后在混合物中额外加入 5 毫升蒸馏水，同时以 600 至 900 RPM 的速度搅拌，并在 90 至 100 摄氏度下加热，在 90 至 100 摄氏度下以 600 至 800 RPM 的磁力搅拌保持搅拌混合物。

为了蒸发水分含量，不时测量整个重量，包括烧杯和混合物，直到获得 1.75 至 1.80 的粉末与液体之比。如随附的文本协议中所述，在将浆料用于涂层之前，让浆料冷却至室温，使用不锈钢刮刀将制备的聚氨酯海绵与羟基食欲浆料一起涂抹，直到浆料均匀分布在整个聚氨酯海绵上玻璃板上。然后使用空气压缩机轻轻吹扫海绵，以确保互连性、均匀性和孔隙开放。

如果未实现均匀的 co，水凝胶涂层的涂层模板将在 ING 过程中塌陷，并且由于制造限制较低，在处理过程中也可能开裂。此外，均匀的涂层对于在 Tally 内创建微通道至关重要。在 20 至 25 摄氏度下干燥 HA 涂层模板至少 5 小时，并保持温和的空气流通。

对于较大的模板，请增加此时间。干燥过程后，将 HA 涂层模板放在 Illumina 坩埚上。然后将它们放入高温炉中，并按照随附文本协议中描述的八步定心配置文件进行作。

将 10 毫升成骨细胞 mc 3 T 3 细胞以 100 万个细胞加入 6 孔板内的单个孔中。然后将 3 厘米 x 4 厘米 x 1 厘米的桥形模板垂直放入六孔板中。将模板的一条腿放入含有细胞悬液的孔中，将另一条腿放入相邻的空容器中。

让模板在生物安全柜中吸收细胞悬液 10 分钟。然后将 5 mL 额外的培养基添加到最初填充有细胞悬液的孔中。再过 5 分钟后，将 5 mL 培养基添加到最初未填充细胞悬液的另一个孔中。

然后将设置放入培养箱中。在 7 天内每隔一天更换一次媒体。实验结束时，将细胞浸入装有 100% 乙醇的烧杯中，固定细胞和支架 20 至 30 分钟。

用 hemat toin 染色剂对冲洗过的脚手架染色 1 到 2 分钟。然后冲洗后再次将支架浸入装有蒸馏水的烧杯中两次，冲洗 1 到 2 分钟，将支架浸入 70% 乙醇中 1 到 2 分钟，使细胞中的支架脱水。然后将支架转移到 95% 乙醇中再转移 1 到 2 分钟。

最后，将支架放入 100% 乙醇中 2 分钟。接下来，用 e、s 和 Y 对构建体进行复染 1 到 2 分钟。然后再次将脚手架浸入装有蒸馏水的烧杯中两次，冲洗一到两分钟。

冲洗后，在树脂包埋前将支架浸入一系列分级乙醇中，使其脱水。最后，将支架嵌入丙烯酸树脂中，用于切片和成像。此处显示的生物微环境模板通过制造的各个阶段由一个完全互连的多孔小梁网络组成，类似于小梁骨的网络。

该模板具有多种结构成分，包括直径为 300 至 400 微米的互连初级孔、直径为 25 至 70 微米的微通道，以及表面直径为 100 至 400 纳米的纳米孔，允许细胞锚定。生物微环境模板支持通过毛细管作用到支架的所有区域进行细胞接种。完全饱和后，在 hemat、toin 和 eoin 染色以及支架切片后，可以清楚地看到细胞分布。

培养三天后，对模板每个区域的细胞数进行定量和跟踪。模板被快速增殖的细胞占据 培养 7 天后，每个小梁被细胞外基质包裹并包埋在细胞中。计量后，如果执行得当，这项技术可以在三天内完成。

在进行此程序时，重要的是要记住保持正确的粉末与水的比例并保持均匀的涂层遵循此程序。可以执行其他方法，例如动态摇摆系统或旋转培养系统，以回答涉及细胞反应的其他问题。