Abstract
Без активного, процветающей популяции клеток, которые хорошо распределенных и стабильно, прикрепленной к вставленной шаблона, исключительный регенерация кости не происходит. С обычными шаблонов, отсутствие внутренних микро-каналов приводит к отсутствием клеточной инфильтрации, распределения и обитания глубоко внутри шаблонов. Следовательно, очень пористая и равномерно между собой шаблон трабекулярной кости, как с микро-каналов (биогенные шаблон микросреда; БМТ) была разработана для решения этих препятствий. Роман БМТ был создан инновационных концепций (капиллярное действие) и изготовлены с техникой покрытия губки шаблона. БМТ состоит из нескольких структурных компонентов: взаимосвязанных первичной поры (300-400 мкм), которые имитируют поры в губчатой кости, микро-каналов (25-70 мкм) в пределах каждого трабекулы и нанопоры (100-400 нм) на поверхность, чтобы клетки на якорь. Кроме того, БМТ были задокументированы механической исследования испытаний, чтобы симИлар свойства механическую прочность тех человеческого губчатой кости (~ 3,8 МПа) 12.
БМТ проявляли высокую абсорбцию, удержание и жилье клеток на протяжении моста в форме (П) шаблонов (высота 3 см и 4 см длиной). Клетки, которые были первоначально высевают в одном конце шаблонов немедленно мобилизованы к другому концу (10 см) расстоянии под действием капиллярных сил ВМТ на клеточных сред. Через 4 часа клетки равномерно заняли весь BMT и выставлены нормальную клеточную поведение. Капиллярное действие приходилось инфильтрации клеток, взвешенных в средствах массовой информации и распределения (активная миграция) в течение ТКМ. Наблюдая эти возможности ТКМ, мы прогнозируем, что BMTs будет поглощать клетки костного мозга, факторы роста и питательных веществ от периферии в физиологических условиях.
БМТ могут решить существующие ограничения с помощью быстрого проникновения, равномерным распределением и inhabitaсть клеток в больших, объемных шаблонов для ремонта массивных скелетные дефекты.
Protocol
1. Полиуретан (ПУ) Губка Подготовка как шаблон
- Используйте PU губки, чтобы произвести гидроксиапатита шаблоны, содержащие соединительные поры. Используйте каждый губку, чтобы обеспечить первичное трабекулы для формирования шаблона стоек, а также к образованию микроканалов в трабекул.
- Вырезать и обрезать 80 PPI (пор на дюйм) губки в 2 бридж-форм с размерами 3,5 см в высоту х 5 см в длину х 1,5 см в ширину.
Примечание: размеры и формы могут быть выбраны в соответствии с требуемым размером пор первичной: 100 PPI, 80 PPI и 60 пор на дюйм. - Сделать 100 мл 4% (масса / объем) раствора NaOH с использованием 150-мл химический стакан, Затем погрузить и сжать до подготовленные губки не полностью всасывается.
- После замачивания, поместите в стакан с губками в ультразвукового дезинтегратора (42 кГц).
- Ультразвуком до лечения губки PU для 15-20 мин без тепла, чтобы изменить свойства поверхности.
- Промыть дистиллированнойвода в течение 5-10 мин. В то время как промывка, сжать губки и дать им возможность расширить 5 до 7 раз, чтобы удалить остаточный NaOH внутри губки.
- Сжать губки с бумажными полотенцами, чтобы удалить избыток воды; затем высушить их в печи при 60-80 ° С.
2. гидроксиапатита (ГА) шламовые Подготовка к Coating
- Перед тем, как суспензии HA, измерить вес стакан с магнитной мешалкой. Это измерение будет использоваться, чтобы вычислить соотношение порошок / жидкость.
- Измерьте 10 г нано-HA порошка.
- Добавьте 20 мл дистиллированной воды в химическом стакане на 50 мл. Тепло для 120-140 ° С и перемешать, используя горячую плиту магнитной мешалки.
- Добавить 0,3 г (3% вес / вес) поливинилового спирта (ПВС) (89,000-98,000 МВт) на порошка в дистиллированной воде при перемешивании при 300-400 оборотов в минуту.
- Перемешать до ПВА не полностью растворяется. Решение должно быть ясно после полного растворения ПВС.
- Включите оFF тепло и добавить 0,1 г (1% вес / вес) от натрий-карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) (со сверхнизким вязкость) для порошка при перемешивании при 400-500 оборотов в минуту. Решение должно быть ясно после полного растворения ПВС.
- Перемешать до КМЦ не полностью растворяется и остыть до комнатной температуры.
- Добавить 0,3 г (3% вес / вес) полиакрилата аммония диспергатора в порошок при перемешивании при 300-400 оборотов в минуту. Перемешать до полного растворения.
- Добавить 0,2 г (2% вес / вес) глицерина в порошок при перемешивании при 300-400 оборотов в минуту. Перемешать до полного растворения.
- Медленно диспергирования порошка HA в раствор при перемешивании при 600-900 оборотов в минуту и держать перемешивании в течение 5 мин.
- Ультразвук в течение 5 мин с помощью ультразвукового дезинтегратора, чтобы обеспечить дисперсию любой агломерации порошка HA.
- Добавим дополнительные 5 мл дистиллированной воды в смесь при перемешивании при 600-900 оборотов в минуту и тепла при 90-100 ° С.
- Хранить перемешивания смеси с помощью магнитной мешалки при 600-800 оборотов в минуту при 90-100 ° С в Ordэр испаряться содержание воды.
- Измерьте всю тяжесть включая стакане и смесь время от времени, пока порошок / жидкость отношение 1,75-1,8 получается.
- Форматирование соотношение порошок / жидкость, разделить массу порошка на общую массу смеси (2.14), в том числе порошка, реагентов и воды, минус вес стакана и мешалкой (2.1), и минус порошок HA (2.2).
Примечание: Например, если А (вся смесь порошка в том числе, реагентов и воды) 49.05 G, B (стакан с мешалкой) составляет 33,5 г, а затем C (HA порошок) 10 г.
С / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 - Дайте суспензии остыть до комнатной температуры перед использованием покрытия.
3. ГК покрытие, сушка, спекание и
- Шерсть подготовленные губки PU с покрытием суспензией HA не используя нержавеющей шпателем до тех пор, суспензии равномерно распределены по всей губки PU на стеклянную пластину.
Примечание: После удаления избытка пятноRy, некоторые из пор еще могут быть забиты суспензии из-за высокой вязкости суспензии. - В целях обеспечения возможности присоединения, однородность и открытые поры, слегка дуть шаблоны HA покрытие с использованием воздушного компрессора. Этот процесс гарантирует, что шаблоны однородно покрыты как внутри, так и наружных поверхностей губки PU.
Примечание: Если однородный покрытие не достигнуто, шаблоны HA покрытием рухнет в процессе спекания, а также может треснуть при обращении из-за низкой механической прочности. Кроме того, однородное покрытие имеет решающее значение в создании микроканалы внутри трабекул. - Высушите шаблоны ха покрытием в течение как минимум 5 часов в условиях охлаждения (20-25 ° C) с нежным циркуляции воздуха. Тем не менее, увеличение времени сушки на основе размера шаблона.
Примечание: После сушки шаблонов Ха покрытием, как правило, сжать приблизительно 8% до 10% в каждом измерении. - После сушки, разместить HAс покрытием шаблоны на окиси алюминия. тигле Затем поместите их в печи при высокой температуре и использовать следующую 8 спекания анкету.
- Тепло 2 ° С / мин до 230 ° С.
- Тепло 1 ° С / мин до 280 ° С.
- Нагреть 0,5 ° С / мин до 400 ° С.
- Тепло 3 ° С / мин до 600 ° С. Хранить при 600 ° С в течение 1 часа.
- Тепло 5 ° С / мин до 1230 ° С. Хранить 1230 ° C в течение 3 часов.
- Холодный 5 ° С / мин до комнатной температуры.
Примечание: Спекание будет дальше сокращаться ха покрытием шаблоны губка около 22% - 25% в каждом измерении.
4. Степень и обитания клеток в шаблоне
- Культура предварительно остеобластические MC3T3 клеток в не-остеогенной сред, состоящей из альфа-MEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков (стрептомицин и пенициллин) при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO 2 ,
- Добавить 10 млиз клеточной суспензии на 2 х 10 6 клеток в плотности одной скважины в пределах 6-луночный планшет.
- Поместите шаблон Bridge-образный на 3 см х 4 см х 1 см вертикально в 6-луночный планшет. Поместите одну ногу шаблона в пластину, содержащую суспензию клеток, и другой ногой в соседнюю пустую лунку.
- Разрешить шаблон для поглощения суспензии клеток в течение 10 мин.
- Добавьте 5 мл среды после этого колодца, который был первоначально заполненной с клеточной суспензии.
- Пополнять среду в обеих скважинах каждые 2 или 3 дня до 7 дней не прошло.
- Определить эффективность клеточной подвижности с помощью гематоксилином и эозином 11.
- Зафиксировать клетки и каркас путем погружения в 100% EtOH в течение 20-30 мин.
- Пятно гематоксилином в течение 1-2 мин.
- Промыть дистиллированной водой в течение 1-2 мин в два раза.
- Высушить погружением в 70%, то 95%, то 100% EtOH в течение 1-2 мин каждую.
- Пятно с эозином 20-30 сек,
- Промыть дистиллированной водой в течение 12 мин в два раза.
- Высушить погружением в 70%, 80%, 90% и 100% этанола в течение 1-2 мин каждую.
- Вставить эшафот в акриловой смолы для секционирования и обработки изображений.
- Определить жизнеспособность клеток с 3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенил тетразолия бромидом (МТТ) жизнеспособности клеток анализом и Live / Мертвое анализа (Live / мертвых клеток окрашиванием комплекта МРТР) в момент времени точек дня 3 и 7 11.
Примечание: Схема протоколов изготовления шаблона кости, как представлены в "репрезентативные результаты" сессии.
Representative Results
Общая структура ТКМ имеет уникальную трехмерную шаблон с трабекулярных внутренних костных структур, как. БМТ содержит макро-поры, микроканалы, и нано-поры. Очистить конфигурации полностью взаимосвязанных макропор (средний размер 320 мкм), микроканалы (средний диаметр 50 мкм), и нанопор (средний размер 100 нм) были проверены с помощью сканирующего электронного микроскопа (EVO-40; Zeiss), а также через микро-томографии.
Рисунок 1 показывает пошаговые подробные протоколы в создании BMT. Через точного управления протоколами от подготовки губок ПУ в процессе спекания (P1 - P7; рисунок 1), следующие функции могут быть достигнуты: очень плотная и гладкая поверхность после HA покрытия и сушки; Точно форму и размеры 3-D шаблон; полностью взаимосвязаны пористая сеть трабекул похож на губчатой кости; и микро-каналов остроумиехин друг трабекула, которые имитируют внутри костных каналов, таких как гаверсовых каналов и каналов Фолькмана (рис 2 и 3). Кроме того, относительно высокая механическая прочность (~ 3,8 МПа) аналогично человеческой трабекулярной кости измеряли с помощью теста прочности на сжатие. Высоко подобные Гистоморфометрические параметры с тех человеческого поясничных позвонков губчатой кости были подтверждены анализом микро-КТ 12. Различные величины капиллярного действия были продемонстрированы с помощью различных диаметров капиллярных на рисунке 4, используя компьютерное моделирование. С помощью этих симуляций, мы прогнозировали, что БМТ будет проявлять различные скорости поглощения в первичной поры (300-400 мкм) и микро-каналов (25-70 мкм) на основе диаметра. Меньшие капилляры выставлены сильные возможности поглощения. Это предположение было подтверждено в данном эксперименте, как показано на рисунке 5.
БМТ выставлены весьма эффективнымПоглощение жидкости и удерживания через капиллярного действия структуры микро-канала; синева stevenel был использован в качестве текучей среды легко отслеживать поток (рисунок 5). На основании компьютерного моделирования, БМТ с этих конфигураций были замечены поглощать и удерживать клеточные суспензии до 8,5 см в общей дистанции в пределах 10 сек. Благодаря сильному капиллярного действия, индуцированного внутренних структур, окрашенный среднего достигли противоположный конец 3 см (высота) х 4 см (длина) х (ширина) шаблон Bridge-образный 1 см в течение 1 мин и 40 сек. Кроме того, мобилизация активная ячейка и включение в ТКМ наблюдается (рисунок 6). Впоследствии, мобилизация однородной клеток и привязанность в результате усиленной пролиферации и формирования матрицы в равномерно распределенной образования. Кроме того, междугородной (~ 10 см) миграция клеток через BMT был утвержден сразу после ТКМ был насыщен клеточной суспензии. Се EDED клетки выжили в сегменте шаблона, который был на воздухе, а не погружена в культуральную среду. В этом эксперименте, культуральную среду при условии, к клеткам исключительно в лунках, коснувшись ноги каркасом. Капиллярное действие выставлены микроканалов затем дают свежей среде достичь вершины, мост часть эшафот. После 3 дней культуры, шаблон стали принимать участие в быстро пролиферирующих клеток. После 7 дней культивирования каждую трабекулы была обернута внеклеточных матриц и встроенных с клетками 13.
Рисунок 1. Общий изготовления шаблона протокола кости, как с предварительной обработки PU губки (Р1) до окончательной термообработки (Р7). Поддержание точного профиля спекания после Р7 имеет решающее значение в достижении благоприятного механическую прочность.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
. Рисунок 2 Представитель стерео микроскоп (AmScope; SM-2TZ-М) изображения (x4) из 80 точек на дюйм размером ПУ губка (слева), HA покрытием и сушат BMT (средний), и спеченного BMT (справа) (Размер: 3. см в высоту х 4 см в длину х 1 см в ширину). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. СЭМ и микро-КТ изображения биогенного шаблона: (а) общий имидж биогенного шаблона,
. Рисунок 4. Вычислительная расчет капиллярного действия с диаметром канала различных В тот же период времени (0,4 мс), в то время крупнейшей капилляра (D = 300 мкм: относится к первичной поры) поглощается среду (синий) до 0,16 мм в Высота, наименьшее капиллярной (d = 30 мкм: относится к микро-канал) всасывается в среду до 0,415 мм в высоту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Изображения показали различия возможностей поглощения капиллярного действия, основанные на различных размеров первичной поры и микро-каналов (размер первичного пор относится к среднему диаметру: 60 на дюйм ≈ 470 мкм, 80 дюйм ≈ 320 мкм, 100 точек на дюйм ≈ 200 мкм). Желтые линии представляют капиллярного действия, индуцированного комбинации первичных пор и микроканалов. Красные линии представляют капиллярное действие, вызванное главным образом микро-каналов, выставленных в каждом трабекулы. Как показано в (F), то шаблон 100 точек на дюйм индуцировали сильный капиллярное действие, в результате чего полного насыщения шаблона в 39 сек. 80 PPI и 60 PPI шаблоны были проверены после. (В) 0 сек, (С) 0,5 сек, (D), 1,5 сек, (Е) 17,0 сек, (F), 39,0 сек, (G), 50,0 сек, и (Н) 1 мин 18 сек, после погружения. (Шаблон размер: 1см х 1 см х 4 см в высоту) кубический. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. входе и иммиграция клеток из посеянных скважин (часть I), чтобы Unseeded скважин (часть V) через биогенных шаблонов, вызванных действием капиллярных сил. В изначально посеяны клетки достигли конца без затравки ногу (часть V), сразу же после полного насыщения. После 3 дней, слияния клеток было видно на протяжении всего шаблона. После 7 дней, формирование пространственно-временной коллагеновой матрицы произошло в клеточных популяций (Н & Е пятно). (Шаблон размер: 3 см в высоту х 4 см в длину х 1 см в ширину). Пожалуйста, клИк здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Шаблон по многокомпонентный включая клетки, факторы роста, питательных веществ и т.д. необходимо для успешной регенерации кости и функциональное восстановление критических размеров крупных костных дефектов. В рамках этих факторов, анатомически соответствующие требованиям биологические свойства имеют важное значение. Для достижения биологической функциональности, шаблон должен обладать биосовместимостью, Остеокондуктивность, механическую целостность, достаточную площадь поверхности, достаточную текстуру поверхности, и средство для кислорода и питательных веществ транспортировки. На клеточном уровне, следующие функции особенно важно для восстановления функционального массивных костных дефектов: облегченного проникновения в шаблоне (активная вербовка), равномерное распределение по всей шаблона (удержания), ускоренного распространения и высокой жизнеспособностью (жилья). Наконец, последующее формирование значительного внеклеточного матрикса и срабатывание экспрессии генов играют решающую роль в существенных биологических процессов, таких как быстрое васкуляризации ай остеогенеза.
Много различных типов синтетических заменителей уже было предложено заменить авто- / алло- костных имплантатов. Тем не менее, нынешняя организация леса не проявляют внутреннюю микросреду, содержащий микро-каналов и нано-поры, и, следовательно, не активно способствовать клеток инфильтрации, распределение и обитания глубоко в синтетических заменителей, которые больше, чем 10 мм. Они не обеспечивают физические сигналы для новаторской клетки эффективно, быстро и равномерно мигрируют глубоко в шаблон кости. Вместо этого, ограничено пассивное набор клеток создает неравномерное распределенных клеточных популяций между наружной и внутренней областях каркасом. Это не только усиливает начальный вызов клеток, достигающих внутреннее ядро шаблона, но также препятствует поток питательных веществ и клеток связь с другого конца синтетический заменитель. Этот тип набора и Проживание результатов непропорциональное клеток в клетки Death и неполной кости роста после эшафот был имплантирован в тело 14,15.
Таким образом, мы ввели понятие капиллярного действия в качестве основного физического сигнала к решению этих препятствий. Мы тщательно разработаны микроканалы в ТКМ, чтобы побудить капиллярное действие, что будет приходиться основной сила торможения ответственно для активно набирают клетки глубоко в ТКМ.
Техника ПУ губка покрытие представлены несколько уникальных свойств. Во-первых, это позволяет легко подготовки контролируемых пористых структур трабекулярных, которые сами по себе зависят от предопределенных шаблонов структур (т.е. 80 пор на дюйм для шаблона 300-400 мкм). Это очень важно для оптимизации размера пор для остеобластов инфильтрации 15. Во-вторых, метод позволяет строительство соединенных микроканалов, на долю которых приходится значительная роль инициализации переселение клеток 11, В-третьих, почти нет ограничения при использовании губки PU в плане создания пользовательских форм и размеров шаблонов. Производитель может использовать ножницы для простых форм или даже компьютерной лазерной резки сложных геометрий. Используя эти точно контролируемых технологий, мы создали BMT. HA был выбран в качестве исходного материала из-за его биосовместимости и способности остеокондуктивные 17.
В этом исследовании, есть несколько важных шагов, которые должны быть выделены. При подготовке HA суспензии, если температура слишком высока, и скорости перемешивания слишком мала, суспензию HA будет застревать в нижних краев стакан и высыхают. После процесса нанесения покрытия, когда дует лишнюю суспензию HA, слишком высокой давлении воздуха может вызвать трещины на поверхности ТКМ. Важно, чтобы держать давление воздуха относительно низкое, чтобы должным образом проветривать только избыток HA суспензии. Наконец, второй и третий этапы процесса спеканияНаиболее важным (Тепло 1 ° С / мин до 280 ° C и тепловой 0,5 ° C / мин до 400 ° С). В этом температурном диапазоне, губка PU полностью сгореть в то время как HA становится плотной. Если этот протокол не внимательно следил, БМТ будет свёрнуто или рассыпалась после спекания.
БМТ описано в данном исследовании предлагается ряд преимуществ. Во-первых, взаимосвязаны макропоры (300-400 мкм) сходны человека губчатой кости и позволяет плавного потока костного мозга. Во-вторых, шаблоны состоят из микроканалов (25-50 мкм) в пределах каждого трабекулярной перегородки, чтобы ускорить начальную попадание костных клеток посредством капиллярного действия. Как показано с помощью компьютерного моделирования 13, если шаблон был только 300 мкм поры (первичный поры) и не микроканалов, капиллярное действие будет недостаточно для полного насыщения шаблона с костного мозга. Это особенно справедливо и для больших дефектов размером, что потребует лШаблоны размер АРГЕ. Микрометр размера каналы демонстрируют высокую эффективность поглощения жидкости, и, таким образом, мы ожидали, что микро-каналы, чтобы быть в первую очередь ответственны за капиллярного действия в нашем исследовании. В-третьих, наши BMTs стратегически размещены нано-поры. Данные литературы свидетельствуют о том, что клетки особенно чувствительны к нано-моделей 18,19; Поэтому, мы ожидали, что нано-поры на стенах микроканалов играть роль в увеличении прикрепление клеток. Наноразмерные поры (100-400 нм) на поверхности губчатой перегородками позволило иммобилизованных клеток на якорь. В целом, совокупное воздействие этих трех внутренних структур в результате мобилизации повышенной адгезии клеток и во всем шаблоне. Тем не менее, существуют некоторые ограничения протокола и критические шаги, чтобы изготовить идеальный BMT. Например, часто существует большое количество HA суспензии, полученной из-за трудности поддержания однородного вязкость то время как покрытие. Также существует ограничение в принятиишаблоны больше, чем 5 см 3 в объеме из-за работы время, пока покрытие. Толщина покрытия является критическим, которые варьируется в зависимости от методов инструкций по.
Результаты нашего исследования показывают, что БМТ способны поглощать и удерживать клетки будут предлагать потенциальные преимущества по сравнению с обычными аллопластических (или синтетических) лесов. Проспективное исследование рассматривается проверить преимущества трансплантации костного мозга на остеогенеза и / или ангиогенеза наряду с костей, связанных с факторами роста. Таким образом, мы утверждаем, что наша уникальная признакам БМТ эшафот можете обратиться основные барьеры проникновения недостаточно костного мозга в синтетических конструкций и неполной регенерации кости в больших дефектов.
Конечная цель данного исследования заключается в упрощении существующей парадигмы биоинженерии в реконструкции костей и функциональное восстановление в критическом размера костных дефектов, устраняя необходимость времени / в трудоемкой стромы костного мозгаизоляции и расширения L клетки процессов. Наконец, мы стремимся использовать анатомически соответствии 3D-конструкции с микро-каналов и нано-поры, которые вызывают быстрое поглощение клеток, равномерное распределение и обитания для реконструкции кости.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyurethan sponge | Plastifoam | PU-3215 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 167176 | |
| Hydroxyapatite Powder | Ossgen | ||
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| Carboxymethyl cellulose sodium salt | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| ammonium polyacrylate | Vanderbilt | DARVAN 821A | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G2289 |
References
- Petrie Aronin, E. C., et al. Comparative effects of scaffold pore size, pore volume, and total void volume on cranial bone healing patterns using microsphere-based scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89 (3), 632-641 (2009).
- Guzmán, R., et al. Chitosan scaffolds containing calcium phosphate salts and rhBMP-2: in vitro and in vivo testing for bone tissue regeneration. PLoS One. 9 (2), e87149 (1371).
- Cha, J. K., et al. Sinus augmentation using BMP-2 in a bovine hydroxyapatite/collagen carrier in dogs. J Clin Periodontol. 41 (1), 86-93 (2014).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue Eng Part B Rev. 19 (1), 1-13 (2013).
- Manassero, M., et al. Regeneration in Sheep Using Acropora Coral, a Natural Resorbable Scaffold, and Autologous Mesenchymal Stem Cells. Tissue Eng Part A. 19 (13-14), 1554-1563 (2013).
- Reichert, J. C., et al. A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra93 (2012).
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on The Application of Solid Freeform Fabrication Technology to The Production of Tissue Engineering Scaffolds. Eur Cell Mater. 5, 29-40 (2003).
- Woodard, J. R., et al. The mechanical properties and osteoconductivity of hydroxyapatite bone scaffolds with multi-scale porosity. Biomaterials. 28 (1), 45-54 (2007).
- Correia, C., et al. Acta Biomater. 8 (7), 2483-2492 (2012).
- Wang, H., Li, Y., Zuo, Y., Li, J., Ma, S., Cheng, L. Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nano-hydroxyapatite/polyamide composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 28 (22), 3338-3348 (2007).
- Oh, D. S., et al. Bone marrow absorption and retention properties of engineered scaffolds with micro-channels and nano-pores for tissue engineering: a proof of concept. Ceram Int. 39 (7), 8401-8410 (2013).
- Hong, M. H., Kim, Y. H., Ganbat, D., Kim, D. G., Bae, C. S., Oh, D. S. Capillary action: enrichment of retention and habitation of cells via micro-channeled scaffolds for massive bone defect regeneration.J. Mater Sci Mater Med. 25 (8), 1991-2001 (2014).
- Volkmer, E., et al. Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone. Tissue Eng. Part A. 14 (8), 1331-1340 (2008).
- Malda, J., Klein, T. J., Upton, Z. The roles of hypoxia in the in vitro engineering of tissues. Tissue Eng. 13 (9), 2153-2162 (2007).
- Macchetta, A., Turner, I. G., Bowen, C. R. Fabrication of HA/TCP scaffolds with a graded and porous structure using a camphene-based freeze-casting method. Acta Biomater. 5 (4), 1319-1327 (2009).
- Cox, S. C., Thornby, J. A., Gibbons, G. J., Williams, M. A., Mallick, K. K. 3D printing of porous hydroxyapatite scaffolds intended for use in bone tissue engineering applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 47, 237-247 (2015).
- Wan, Y., et al. Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(l-lactide). Biomaterials. 26 (21), 4453-4459 (2005).
- Zhao, L., Mei, S., Chu, P. K., Zhang, Y., Wu, Z. The influence of hierarchical hybrid micro/nano-textured titanium surface with titania nanotubes on osteoblast functions. Biomaterials. 31 (19), 5072-5082 (2010).
