Introduction
시험 관내 모델 시스템에 사용하는 능력은 크게 신경 생물학 및 신경 과학 분야를 강화하고있다. 배양 세포가 감염 질병의 병리를 이해하고, 예비 약물 시험 평가를 수행하는 단백질의 기능 및 분자 기전 특정 현상을 특징 효율적인 플랫폼을 제공한다. 신경 생물학에서 세포 배양 모델의 주요 유형은 쥐 B35 세포 5 신경 2A 마우스 세포 6, 랫트 PC12 세포는 7 쥐 및 신경 아세포종 세포주 유래의 주요 신경 배양 물을 포함한다. 이러한 세포주의 사용이 크게 필드 진행 하였지만, 비 - 인간 세포 및 조직 처리와 연관된 여러 교란 요인이있다. 인간과 비교했을 때 이러한 이해 종 특이 대사 과정의 차이, 질병 증상 및 발병 기전의 표현형을 포함한다. 이 점에 유의하는 것이 중요하다설치류 모델 제약 경로는 설치류와 인간 사이에서 보존되는 8-11 이해 중요성 강조 마우스 및 인간의 유전자 발현 및 전사 인자 신호 사이에 상당한 차이가 다시한다. 기타 N-테라 -2- (NT2) 인간 기형 암종 세포주 유도 성 및 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 포함한 인간 신경 세포 라인의 사용을 채용 하였다. 이 세포주는 체외 인간의 시스템에 대한 좋은 모델을 제공합니다. 그러나, 레티노 산 (RA) 신경 교세포의 혼합 집단의 생성을 초래하고 추가의 정제 공정을 필요 반경 신경교 세포 (12)와 NT2 세포의 분화 신경 세포 집단을 순수 얻었다. 또한 NT2 세포는 세포의 72 %보다 큰 60 염색체와 매우 가변적 핵형 13 보여준다. iPSCs는 다른 세포 라인 사이의 차별화에 다양성을 보여 분화 효율에 차이가 14. 이들 대안을 편안하게 일관되고 재현 인간 신경 세포 모델을 갖는 것이 바람직하다.
SH-SY5Y의 neuroblast 같은 세포는 부모의 신경 모세포종 세포주 SK-N-SH의 서브 클론입니다. 부모 세포주 neuroblast 같은 상피 세포 형 (15)을 모두 포함하는 골수 생검 1970에서 발생 하였다. SH-SY5Y 세포를 47 염색체 이루어진 안정한 핵형을 가지고, 다른 RA의 사용을 포함하는 메커니즘, 포르 볼 에스테르 및 뇌 유래 특정 뉴로 통해 다양한 성숙한 인간 뉴런에 neuroblast 같은 상태로부터 구별 될 수있다 신경 영양 인자 (BDNF). 선행 증거는 다른 방법의 사용은 아드레날린, 콜린성 및 도파민 뉴런 16,17 특정 신경 세포 아형에 대해 선택할 수있는 제안한다. 이 후자의 측면은 신경 생물학 실험의 다수 유용 SH-SY5Y 세포를 만든다.
ontent는 "> 여러 연구는 미분화와 차별화 된 지역에서의 SH-SY5Y 세포 사이의 중요한 차이점을 지적했다. 때 SH-SY5Y 세포는 미분화, 그들은 빠르게 증식과 거의 짧은 프로세스와, 비 편광 것으로 보인다. 그들은 종종 성장 분화시 미성숙 뉴런 18,19 나타내는 덩어리 및 발현 마커. 이러한 세포는 긴 분지 프로세스 증식의 저하를 확장하고, 어떤 경우에는 2,18을 편광. 완전히 분화 된 SH-SY5Y 세포는 이전에 표현하는 것으로 입증되었다 성장 관련 단백질 (GAP-43), 신경 핵 (NeuN), synaptophysin에 (SYN), 시냅스 소포 단백질 II (SV2), 신경 세포 특이에 놀라 (NSE)와 미세 소관 연관 단백질 (MAP)를 포함하여 성숙한 신경 세포의 다른 마커의 다양한 2,16,17,20, 이러한 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 4 등의 폐해 마커의 발현을 부족합니다. SH-SY5Y 세포가 represe 차별화 추가 지원에NT 균질 신경 인구 BDNF를 제거하여 세포 사멸 4 초래한다. 이는 차별화 된 SH-SY5Y 세포의 생존 신경 세포를 성숙 비슷한 영양 요인에 따라 달라집니다 것이 좋습니다.서브 클론 1978 3 년에 설립 된 이후 SH-SY5Y 세포의 사용은 증가하고있다. 그 사용의 예는 파킨슨 병 (17), 알츠하이머 병 (21), 및 폴리오 바이러스 (22), 엔테로 바이러스 71 (EV71)를 포함하는 바이러스 감염의 병인 (23, 24)을 조사 포함 수두 - 대상 포진 바이러스 (VZV) 1, 인간 거대 세포 바이러스 (25), 및 단순 포진 바이러스 (HSV) 2,26. 특히 neurovirology 27-36 분야, SH-SY5Y 세포는 미분화 형태로 이들 세포를 사용하여 한 것을 여러 연구가 중요하다. 분화 된 SH-SY5Y 세포에 비해 미분화 관찰 된 표현형의 차이 whe에 의문을 제기THER 감염의 진행을 관찰 성숙한 분화 된 신경 세포에서 상이한 것이다. 예를 들어, 분화 된 SH-SY5Y 세포에 의한 HSV 결합 미분화 SH-SY5Y 세포를 2 엔트리를 변조 표면 수용체의 부족 일 수있다 분화, 증식 SH-SY5Y 세포, 대 HSV-1 흡수 높은 효율을 갖는다. 이는 시험관 내에서 신경 세포를 테스트에 초점을 맞춘 실험을 설계 할 때, SH-SY5Y 세포를 생체 내 모델로 변환하고 비교에 대한 가장 정확한 결과를 얻기 위하여 구별되어야 함 때문에 중요하다.
인간 신경 세포 배양 물을 생성하는 신뢰할 수있는 방법의 개발이 연구 정확하게 인간 신경계 병진 모델 실험을 수행 할 수 있도록하는 것이 필수적이다. 여기에 제시된 프로토콜은 차별화되는 인간의 신경 세포에 대한 풍부 이전의 방법 1-4에서 파생 된 모범 사례를 묘사 절차레티노 산을 사용.
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Protocol
1. 일반 고려 사항
- 필요한 시약의 목록을 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. 엄격한 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다.
- FBS를 포함하는 모든 미디어 준비에 대한 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (hiFBS)를 사용합니다. 열 - 불 활성화, 10 분마다 반전, 30 분 동안 56 ° C에서의 FBS 50 ㎖ 분취 량을 따뜻하게 (또한하기 표 1 참조).
주 : FBS가 열 불 활성화없이 사용하는 경우에는, 상피 같은 표현형 SH-SY5Y 세포의 배양에 걸쳐보다 빠르게 진행한다. - 사용하기 전에는 미디어가 따뜻하게 모든 단계 전에 적절한 산도 균형을 설정하는 인큐베이터에서 평형 수 있습니다. 예를 들어, 매체의 50 ㎖ 완전히 평형을 약 1 시간 소요 (pH가 7, 37 ° C, 5 % CO 2).
주 :이 프로토콜은 트립신 처리하고 다시 도금 될 편미분 SH-SY5Y 세포를 필요로하는 두 단계의 분리 방법을 사용한다. 이것은 스트레스이러한 매우 깨지기 쉬운 세포에 대한 처리. 따라서, 최소의 시간 트립신에 세포를 배양 중요하다. 이것은 여전히 접시에 부착 된 상피 - 유사 세포를 떠나, 신경 세포의 특혜 리프트 오프 (lift-off)를 허용합니다. - 서서히 세포를 함유하는 원뿔형 튜브의 바닥에 대해 팁 10 ㎖ 플라스틱 피펫으로 분화 된 세포의 분쇄를 수행한다. 상하 더 느린 속도로 다섯번 이상 분쇄를 수행한다.
SH-SY5Y 유지 관리 문화의 2. 통과
- 세포를 70-80 %의 컨 플루 언시에 도달하고, 10 ~ 15 유로를 초과하지 않는 분리 유지 배양. 문화는 일반적으로 (가정 문화가 분할 동안 5 배 이상 희석되지 않음) 모든 3-5일를 계대 할 필요가있다.
- T-75 플라스크에서 통과 셀에 다음 PBS 1X 약 10 ㎖로 씻어, 미디어를 대기음.
참고 : 우리는 SH-SY5Y 유지 보수 문화 쿵푸을 분할하지 않는 것이 좋습니다1보다 rther : 5 계대 동안이 세포가 낮은 컨 플루로 인해 사망 원인이 될 수 있기 때문이다. - 대기음 PBS는 다음 2.5 ml의 0.05 % 트립신 - EDTA (1 배)를 추가합니다.
- 배양기에서 2-3 분 인큐베이션하고 플라스크의 표면으로부터 세포를 분리 부드럽게 팁.
- 10 ml의 기본 성장 미디어 추가 (표 2 참조) 및 1-2 번 씹다.
- 1,000 XG에서 2 분 동안 스핀 다운, 흡인 미디어 다음, 5 ml의 기본 성장 미디어에서 펠렛을 재현 탁.
- T-75 플라스크에서 일반 도금 20 ML의 총 부피 5, 또는 분화 (섹션 5)에 대한 계산과 판 : 1 ~ 3 : 1에서 세포를 희석.
3. 냉동 SH-SY5Y 세포
- 5 % (v / v)의 DMSO 보충 된 기본 배지에서 성장 SH-SY5Y 세포의 신경 아세포종 초기 통로 동결.
- 처음 24 시간 동안 -80 ℃에서 분취 액을 동결 한 후 장기간 저장을 위해 액체 질소로 옮긴다.
주 : 참고로 합류 (75~85%)를 T-75 플라스크에 다섯 수득 할냉동 SH-SY5Y 세포를 1 ml의 분취. 이 분취 액의 각각은 총 어디서나 2-5000000 세포를 포함해야합니다.
4. 해동 문화 미분화 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포
- 기본 성장 미디어를 준비합니다.
- 빠르게 37 ° C의 물을 욕조 (약 2 분)에 동결 된 세포를 해동.
- 15ml의 원뿔형 튜브에서 9 ㎖의 기본 성장 배지에서 세포를 재현 탁하고, 그 다음 1000 x g에서 2 분간 원심 분리.
- 기음 뜨는 10 ml의 기본 성장 미디어에서 펠렛 세포, 부드럽게 재현 탁 세포를 방해하지 않도록주의하면서.
- T-25 플라스크 또는 60mm 2 접시 위에 플레이트 세포.
- 다음 날, 죽은 세포를 제거하기 위해 미디어를 교체합니다.
5 일 0 : 차별화에 대한 도금 세포
- 차별화 일정 그림 1을 참조하십시오.
- 1X PBS, 대기음으로 미분화 세포를 씻어 후 1-2 ml를 따뜻하게 사용하여를 Trypsinize1 배 0.05 % 트립신 - EDTA.
- 세포가 트립신에있을 때, 인큐베이터에서 약 3 분 동안 품어.
- 10 ml의 기본 성장 미디어를 추가하여 트립신을 해소 플라스크 또는 접시의 측면을 씻어 부드럽게 1-3 번 씹다. 15 ML 원뿔 튜브에 내용을 전송합니다.
- 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 1,000 XG에 2 분 동안 원심 분리기, 그리고 미디어를 대기음.
- 재현 탁의 5 ml의 기본 성장 미디어에서 펠렛과 1-3 번 씹다.
- 혈구를 사용하여 세포를 계산 한 다음 / ㎖ 50,000 셀에 기본 성장 미디어를 사용하여 희석.
- 접시 2 접시 당 10 만 셀의 총 35mm 2 접시 당 세포 ㎖의 인큐베이터에 다시 배치합니다.
6. 1 일 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 1)
- 분화 매체 # 1 분취 액 50 ㎖를 (표 2 참조)를 37 ℃의 수조에서 배양한다.
- 미디어가 가온되면 (이것은 인큐베이터 평형 37 있도록° C는 5 % CO 2) 적어도 하나의 시간 동안 사용하기 전에 적절한 산도 균형을 확립한다.
- 레티노 산 (RA)를 추가 즉시 요리 미디어를 첨가하기 전에 승온시키고 평형화 미디어 (표 1 참조).
참고 : 레티노 산 민감한 빛과 4 ° C에서 어두운 병에 보관해야합니다 - 조심스럽게 된 미디어를 대기음 및 폐기합니다.
- 35mm 2 접시 당 RA와 2 ml의 차별화 미디어 # 1을 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
7. 3 일 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 1)
- 반복 섹션 6 (1-5 단계)
8. 5 일 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 1)
- 반복 섹션 6 (1-5 단계)
9 일 7 : 분할 세포 1 : 1
- RA는 따뜻하게 추가하고 즉시 요리에 미디어를 추가하기 전에 차별화 미디어 # 1 평형.
- 조심스럽게 된 미디어를 대기음 및 폐기합니다.
- 200 μl를 추가35mm 2 접시 당 0.05 % 1X 트립신 EDTA를 따뜻하게 약 2 ~ 3 분 또는 셀까지가 눈에 띄게 현미경으로 관찰 판에서 해제되는 인큐베이터 따뜻한.
- 35mm 2 접시 당 RA와 2 ml의 차별화 미디어 # 1을 추가하여 트립신을 끄다 플레이트 떨어져 신경 세포 남은 린스 미디어를 사용합니다. 그런 다음 50 ㎖ 원뿔 관에 내용을 전송합니다.
참고 : 트립신 단계 동안, 한 번에 너무 많은 요리를 Trypsinize하지 않습니다. 이 세포 독성이 될 수있는 연결을 문화가 너무 오래 트립신 배양되지 않도록하는 데 도움이됩니다. - 50 ML 원뿔 튜브에 최대 10 요리에서 내용을 결합하고 부드럽게하고 더 이상 5 배 아래로 10 ml의 플라스틱 피펫으로 천천히 씹다.
- 나누어지는 2 ml의 세포 신선한 35mm 2 요리에 매달리기와 인큐베이터로 돌아갑니다.
10 일 8 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 2)
- RA를 추가합니다 (<강한> 표 1) 가온 즉시 요리에 미디어를 추가하기 전에 미디어를 평형합니다.
- 조심스럽게 된 미디어를 대기음 및 폐기합니다.
- 천천히 2 mL의 차별화 미디어 # 2 (표 2 참조) 추가 35mm 2 접시와 인큐베이터에 반환 당 RA와. 허용하지 않음 뉴런은 빨리 건조 수 장기간 공기에 노출된다.
11 일 9 : 세포 외 기질 (ECM)를 준비 코팅 요리
- 얼음에 ECM 솔루션 중 하나 병을 해동 1을 희석 : 100 차가운 DMEM으로.
- 각 35mm 2 접시에 혼합 2 ㎖를 분배하고 접시의 전체 염기가 포함되어 있는지 확인합니다.
- 인큐베이터에있는 장소 (37 ° C, 5 % CO 2) 1 시간 또는 하룻밤합니다.
- 기음 혼합물과 후드에서 약 1 시간 동안 공기 건조에 있습니다. 최대 2 개월 동안 실온에서 보관.
12 일 10 : 전송 세포 상ECM 코팅 된 플레이트 1 :
- RA 추가 즉시 요리 미디어를 첨가하기 전에 승온시키고 평형화 미디어 (표 1 참조).
- 조심스럽게 미디어를 대기음 및 폐기합니다.
- 각 35mm 2 접시에 트립신 가온 200 μl를 추가하고 약 1-2 분 동안 또는 신경 세포가 눈에 띄게 현미경으로 관찰 접시에서 해제 될 때까지 실온에서 배양 할 수 있습니다.
주 : 트립신 뉴런 오버 부화 손상하지 않도록하고 실온이 트립신 처리 단계를 실행한다. 뉴런은이 단계에서 상피 - 같은 세포보다 훨씬 빠른 판에서 놓습니다. - 35mm 2 접시 당 2 ml의 차별화 미디어 # 2를 추가하여 트립신을 해소하고, 플레이트 떨어져 신경 세포 남은 린스 미디어를 사용합니다. 그런 다음 50 ㎖ 원뿔 관에 내용을 전송합니다.
- 50 ML 원뿔 튜브에 최대 10 요리에서 내용을 결합하고 부드럽게 위로와 함께 더 이상 5 배 아래로 천천히 씹다10 ml의 플라스틱 피펫.
- ECM 코팅 35mm 2 요리에 2 ㎖의 세포 현탁액을 분배하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
13 일 11 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 3)
- RA 추가 즉시 요리 미디어를 첨가하기 전에 승온시키고 평형화 미디어 (표 1 참조).
- 조심스럽게 된 미디어를 대기음 및 폐기합니다.
- 천천히 35mm 2 접시 당 RA와 2 ml의 차별화 미디어 # 3 (표 2 참조) 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 허용하지 않음 뉴런 장기간 공기에 노출된다.
14 일 14 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 3)
- 반복 섹션 13 (1-3 단계)
15 일 17 : 마지막 미디어 변경 (차별화 미디어 # 3)
- 반복 섹션 13 (1-3 단계)
16 일 18 : 사용 준비 신경 문화
- 신선한의 Diff 미디어 변경3 일마다 RA와 erentiation 미디어 # 3는 신경 세포의 건강을 유지합니다.
세포가 신경 세포로 분화되어야하며, 신경 세포 표현형을 나타내는 참고. 배양 단말 분화 다음 최대 14 일 동안 일반적으로 안정, 신경 세포 생존을 지속하지만 분화의 시작에서 미분화 세포의 통과 횟수에 의존한다. 높은 통로 번호는 더 짧은 유효 수명 차별화 뉴런을 얻었다.
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Representative Results
현재, 이러한 흡수되어 최적 바이러스 2와 같은 획일적 인 SH-SY5Y 세포는 중요한 미분화 세포가 부족할 수 인간 뉴런 27-36, 표현형 및 기능에 대한 모델로서 사용되는 신경 생물학 및 neurovirology 분야의 많은 경우가있다 정확한 해석을 위해 필요한. 이 체외 신경계를 SH-SY5Y 세포를 사용하거나 다른 어떤 경우에는, 세포가 적절하게 생체 내에서 뉴런에서 발생 될 것인가의 최상의 표현 된 데이터를 획득하기 위하여, 신경 세포로 분화되는 것이 중요하다. 이후 생화학 및 이미징에 사용할 수 있습니다 십팔일 내에서 매우 실용적, 균질, 차별화의 연결을 문화 위의 프로토콜 금리는 분석한다. 미분화 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포는 (그림 2A) 외측으로 연장 다수의 짧은 프로세스와 대형 평면, 상피 같은 표현형을 보여 분화 된 세포 동안들 주변의 세포 (그림 2B)에 연결하는 여러 신경 염성 전망을 가지고있다. SH-SY5Y 세포를 분화되면 세포 만 뉴런 요리로부터 방출되도록 시간을 최소 길이 트립신 함께 배양하는 것이 중요하다. 이것은 달리 차별화 된 신경 세포 집단을 오염시킬 미분화 상피 세포의 뒤에 떠난다. 완전히 분화 된 SH-SY5Y 세포의 신경 세포의 특성은 이러한 고전 신경 마커 (도 3)의 면역 형광 검출 방법으로 입증된다.
SH-SY5Y 세포의 분화 과정에서 다른 표현형의 다양성을 증명하고 강조되는 것과 건강한 신경 세포를 식별 할 수있는 것이 중요하다. 분화 1 일에 분화 매체 # 1의 도입 이전에, 세포는 짧은 짧고 공정 (도 4a)와 편평 후퇴 표현형을 갖는다.혈청 박탈 5 일 후, SH-SY5Y 세포는 더 이상 전망을 개발하고 더 많은 신경 세포의 표현형 (그림 4B)를 설명하기 시작한다. 계대는 SH-SY5Y 세포에 대한 가혹한 과정, 즉시 계대 다음 날, 세포가 건강에 해로운 나타납니다. 이는 전지 본체 응집 적은 짧은 공정의 존재에 의해 입증된다. (이미지 전에 참조 :도 4C 및 4E, 이미지 후 :도 4D 및 4 층). 약 48 시간이 분할 다음, 세포를 복구하기 위해 나타나고, 완전히 성숙, 분화 된 신경 세포는 하루 18 (그림 2B)에서 얻을 수있다. 이는 전지 본체 응집 감소, 얇은 다수의 확장에 의해 입증되며, 종종 인접 셀에 연결 신경 염성 프로세스 분지.
재현하고 가능한 연결을 문화를 얻기에 필수적인 요소는 트립신 배양을 최소화, 열 불 활성화 FBS를 사용하여 포함시간, 부드러운 분쇄. 중요한 것은,이 프로토콜시켜 세포 혈청 결핍 상태로 부드럽게 전이를 생성 hiFBS 다양한 농도, 4 개의 다른 미디어 제제의 사용 방법에 대해 설명합니다. SH-SY5Y 성숙한 세포가 건강 할 때, 그들 주변의 뉴런 (도 5a)에 연결하는 다수의 돌기를 보여준다. 그들이 분화 과정 (도 5b)시 걸린 경우 독특한 상피 표현형이 신경 배양 추월 것을 주목해야한다. 신경 세포가 죽기 시작하면 또한, 신경 돌기가 철회되며, 세포 기관이 함께 덩어리와 라운드를 시작하며, 신경 돌기 변성에서 파편에서 세포 프로세스 주위에 축적하기 시작합니다. 도 5c는 영양 부족, 환경 다음 세포사의 자연적인 진행을 나타내지 만이 프로세스.도 5C 및 5D에서 설명되는 것에 가깝다그림 5D 10 6 PFU의 감염의 다양성 (MOI)에서 HSV-1 균주, KOS와 차별화 된 SH-SY5Y 신경 세포 4 시간 다음 감염을 보여줍니다. 이 프로토콜은 철저하게 다운 스트림 분석과 실험에 필수적인 신경 세포의 실험실 및 수율 재현, 균일 한 집단에 최적화되었습니다.
그림 1 :. 분화 과정의 시간표는 분화 과정은 18 일의 기간에 걸쳐 퍼져 11 단계로 구성됩니다. 분화 프로토콜 (0 일)의 첫 번째 날에, 25,000 내지 100,000 세포를 코팅 35mm 요리에 도금되어있다. 일 1, 3, 5, 이전 미디어가 제거되고 분화 매체 # 1이 적용된다. 차별화 미디어 # 1에 코팅 35mm 요리에 1 : 7 일에, 세포는 1 분할됩니다. 하루 8 일, 미디어는 차별화로 변경미디어 # 2, 10 일에, 세포는 다시 1 분할 : 1,하지만 차별화 미디어 # 2 ECM 코팅 35mm 요리에이 시간. 일 11, 14, 및 17 일 이전 미디어를 제거하고 차별화 미디어 # 3이 적용됩니다. 날 18 일, 차별화 된 신경 세포는 다운 스트림 애플리케이션에 사용할 준비가 된 것입니다.
그림 2 :. (B) 차별화 된 SH-SY5Y 신경 세포가 광범위하고 긴 신경 염성 전망을 보여 주 동안 미분화 차별화 된 SH-SY5Y 세포의 형태 학적 모양 (A) 미분화 SH-SY5Y 세포는 몇 돌기 평면 표현형을 가지고있다. 이미지 반전 표면 형광 현미경으로 20X 배율로 위상을 얻었다.
그림 3 :의 마커 신경 세포 분화. 면역 형광 완전히 차별화 된 SH-SY5Y 세포의 신경 기능을 켜집니다. (A) 안티 SMI31 (녹색)는 신경 돌기의 광범위한 네트워크의 인산화 신경 미세 섬유의 H 얼룩. (B) 항 MAP2 (적색) 신경 소마 및 신경 돌기의 기단부를 공개 미세 소관 연관 단백질 2 라벨. 각 면역 패널 대응 위상 이미지 오른쪽에 표시된다. 이미지 반전 표면 형광 현미경으로 10X 배율로 얻었다. 스케일 바, 100 μm의.
그림 4 : 분화 프로토콜의 중간 단계의 분화 (A) 1 일.. 세포는 짧은 돌기 후퇴 표현형을 유지한다. (B) 분화의 5 일. 세포는 오일에 노출 된혈청 부족의의 (차별화 미디어 # 1). 생존 세포를 신장과 이웃 셀과 연결 긴 프로세스를 형성하기 시작한다. (C) 분리하기 전에 분화 7 일. 세포는 상피와 같은 표현형을 보여주는 세포의 적은 숫자로, 긴 프로세스의 높은 숫자를 보여줍니다. (D) 주 분화 8 제 1 통로로 한 날. 분리 이후, 세포체는 덩어리와 프로세스 계대 절차의 결과로서 나타나는 짧은 형성한다. (E)의 분화 10 일, ECM - 코팅 된 플레이트 상 분리 전에. 세포는 주변 세포와의 연결을 더 이상 프로세스를 보여줍니다. 세포체 클러스터링은 명백하다. (F)의 날 차별화의 11 번째 분할 다음 일일. 세포는 제 2 통로를 다음과 같은 스트레스 많은 뉴런은 궁극적으로 손실됩니다. 그러나 나머지 인구는 가능한 균질 및 표현형에 신경이다. 세포 기관은 리터를 생산arger 클러스터 및 프로세스는 클러스터의 기지에서 방출하기 시작한다.
그림 5 :. 상피 증식 및 신경 세포의 죽음 - 분화 과정의 두 가지 대체 결과 (A) 건강은 성숙한 SH-SY5Y 신경 세포는 이웃 세포에 연결 확산 축삭 돌기 보여줍니다. 어떤 경우에는 (B)를 더 상피 같은 표현형 세포 유지 배양액 추월. 상피 - 같은 세포의이 과잉 인구는 유지 보수 문화의 드문 계대 때문일 수 있습니다. 상피 - 같은 세포가 신경 세포를 능가 계속 이러한 문화는 폐기해야합니다. 화살표는 상피 세포 등을 나타낸다. (C) 때 SH-SY5Y 세포가 건강에 해로운하고 죽기 시작, 파편의 상당한 양의 생성, 세포 기관은 반올림 및 프로세스 저하. (D (6)의 감염의 다양성 (MOI)에서 단순 포진 바이러스 1 (HSV-1) KOS의 변형 감염 다음 4 시간 PFU.
| 구성 요소 | 세부 | 스톡 | 명령 | ||||
| 10 μm의 RA | 올 - 트랜스 레티노 산 | 5 밀리미터 | 33.3 ml의 95 % EtOH로 50 mg을 RA를 재현 탁. RA는 열, 빛, 공기에 민감합니다. 최대 6 주 동안 4 ° C에서 어두운 병에 저장하십시오. 1 사용 : 500 희석 사용하기 직전에 차별화 매체로 희석 | ||||
| (300.44 g / 몰) | |||||||
| 1 배 B-27 | B-27 보충 | 50 배 | -80 ° C에서 1 ~ 10 ml의 병 나누어 나머지 하나의 사용 1 ml의 분취 량에 저장을 해동. 스토어 10 ml의 병 -20 ° C에서 | ||||
| 20 mM의 KCl을 | 칼륨 염화물 | 1 M | 18.6 g의 KCl과 살균 필터에 250 ml의 물을 추가합니다. 실온에서 보관 | ||||
| (74.55 g / 몰) | |||||||
| 2 MM의 DB-캠프 | dibutyryl 사이 클릭 AMP | 1 M | 2.04 ml의 물 1g에 DB-캠프를 추가하여 전체 병을 재현 탁. 빛과 습기에 민감한. 중 -20 ° C 또는 100 μL 200 μL의 분취 량에 보관 -80 ° C | ||||
| (491.37 g / 몰) | |||||||
| 50 NG / ㎖ BDNF | 뇌 유래 신경영 양인자 (BDNF) | - | 원심 분리기 유리 병은 바닥에 분말을 얻을 수 있습니다.(60); 1 ml의로 Neurobasal 10 μg의 병을 재현 탁 + 1 배 B27 또는 5 0.5 ml의로 Neurobasal + 1 배 B27에 μg의 유리 병 10 μg의 / ㎖를 얻을 수 있습니다. (200) 희석 : 1에서 사용합니다. -80 ° C에서 보관 작업을 분취 (예 : 250 μL) | ||||
| hiFBS | 열 활성화 된 우 태아 혈청 | - | 나누어지는 50 ML 원뿔 튜브에 FBS를 해동. 30 분 동안 수욕에서 56 ℃에서 가열한다. 제거하고 -20 ° C에서 근무하는 분취 액을 동결 | ||||
표 1 : 주식 솔루션 및 구성 요소.
| 기본 성장 미디어 | ||
| 구성 요소 | 500 ml를위한 양 | 노동 희석 |
| EMEM | 415 ml의 EMEM | |
| 15 % hiFBS | 75 ML의 hiFBS | |
| 1X 펜 / 패 혈성 | 5 ml의 펜 / 패 혈성 | 1 : 100 |
| 2 mM의 글루타민 | 5 ML의 글루타민 | 1 : 100 |
| * 6 주 최대 유지 | ||
| 차별화 미디어 # 1 | ||
| 구성 요소 | 50 ㎖의 볼륨 | 노동 희석 |
| EMEM | 48 ml의 EMEM | |
| 2.5 %의 hiFBS | 1.3 ML의 hiFBS | |
| 1X 펜 / 패 혈성 | 500 μL 펜 / 패 혈성 | 1 : 100 |
| 2 mM의 글루타민 | 500 μL 글루타민 | 1 : 100 |
| 10 μm의 RA | 100 μL의 RA (5mM의 주) | 1 : 500 |
| *에 대한 이주 최대 보관 전에 즉시 RA를 추가사용 | ||
| * RA가 추가되면 추가 용지를 보관하지 마십시오 - RA는 불안정 | ||
| 차별화 미디어 # 2 | ||
| 구성 요소 | 50 ㎖의 볼륨 | 노동 희석 |
| EMEM | 49 ml의 EMEM | |
| 1 % hiFBS | 500 ㎕를 hiFBS | |
| 1X 펜 / 패 혈성 | 500 μL 펜 / 패 혈성 | 1 : 100 |
| 2 mM의 글루타민 | 500 μL 글루타민 | 1 : 100 |
| 10 μm의 RA | 100 μL의 RA (5mM의 주) | 1 : 500 |
| *에 대한 이주 최대로 유지하고 추가 RA 사용하기 직전에 | ||
| *에 별도의 미디어를 보관하지 마십시오RA는 불안정 - 가전의 RA가 추가됩니다 | ||
| 차별화 미디어 # 3 | ||
| 구성 요소 | 50 ㎖의 볼륨 | 노동 희석 |
| 로 Neurobasal | 47 ml의로 Neurobasal | |
| 1 배 B-27 | 1 ML의 B-27 (50X 주식) | 1시 50분 |
| 20 mM의 KCl을 | 1 ml의 KCl을 (1M 주) | 1시 50분 |
| 1X 펜 / 패 혈성 | 500 μL 펜 / 패 혈성 | 1 : 100 |
| 2 mM의 GlutamaxI | 500 ㎕를 GlutamaxI (100 배 주) | 1 : 100 |
| 50 NG / ㎖ BDNF | 250 ㎕의 BDNF의 재고 (10 μg의 / ㎖) | 1 : 200 |
| 2 mm의 사이 클릭 AMP (DB-캠프를) dibutyryl | 100 μL의 DB-캠프 (100 만 주) | 1 : 500 |
| 10 μm의 RA | 100 μL RA (5 밀리미터 주) | 1 : 500 |
| *에 대한 이주 최대로 유지하고 추가 RA 사용하기 직전에 | ||
| * RA가 추가되면 추가 용지를 보관하지 마십시오 - RA는 불안정 | ||
표 2 : 미디어 조리법.
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Discussion
위의 프로토콜은 균일하고 가능한 인간의 신경 세포 문화를 생성하는 간단하고 재현성있는 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 기술과 각각의 모범 사례를 서술하는 데 몇 이전에 발행 된 방법 1-4과 목표를 통합하는 방법을 사용합니다. SH-SY5Y 세포의 분화는 점진적으로 혈청 부족에 의존; 레티노 산, 향 신경성 인자 및 세포 외 기질 단백질의 첨가; 시리얼 분할 차별화 성숙한 부착 뉴런 선택합니다. 이 세포주는 현탁과 부착 세포의 이종 집단으로 시작한다. 이 프로토콜은 계대 또는 매체 변경 전에 PBS 세척 원천으로 두 집단을 유지하는 것을 목표로하지만, 부유 세포의 일부 손실이 데드 상피 세포의 제거를 허용 할 필요가있다. 제시된 방법은 실험을위한 차별화 된 인간의 SH-SY5Y 신경 세포의 균일 한 인구를 생성합니다.
인접 해 있지만R 에이전트 또는 콜린성 아드레날린 표현형 16,17 뉴런으로의 분화를 유도하는 데 사용될 수 RA의 사용은 SH-SY5Y 세포를 도파민 뉴런 표현형 37,38 생산 이전에 사용 된 분화한다. RA의 첨가는 사이클린 - 의존성 키나아제 (CDK) 억제제 P21 및 P27 Kip1 및 항 아폽토시스 단백질 BCL의 발현을 증가 G0 / G1에서 세포주기 진행을 체포 포함 메커니즘의 숫자를 통해 세포 분화를 유도하는 것으로 나타났다 -2 BCL-XL 및 신경 돌기 발생과 분화 (39) 역할을 PI3K / AKT 활성을 증강.
SH-SY5Y 세포의 급격한 변화에 매우 민감하다으로서이 프로토콜의 실행은 부드러운 멸균 처리 기술을 사용하여 전역이 필수적이다. 이 때문에 점진적으로 혈청 박탈 프로토콜이 의대에 빠른 변화를 요구하는 프로토콜을 통해 선호되는이 감도이다아이오와 조성입니다. 7 일 10 세포를 분리 할 때, 부분적으로 분화 된 신경 세포를 트립신에 소요되는 시간을 최소화하는 것이 중요하다. 이 손상 신경 세포의 가능성을 줄이고 분리하는 데 시간이 오래 걸릴 상피 세포에 비해 신경 세포의 특혜 방출을 촉진한다. 이는 세포의보다 균일 신경 집단을 확립하고 증식 및 분화 상피 세포의 오염을 최소화하는 데 도움이된다. 무기한 보관 일상적이 아닌 교체해야합니다 SH-SY5Y 세포의 배양 및 분화에 사용되는 시약을주의하는 것이 중요하다. 차별화 미디어가 불과 2 주까지 보관해야합니다 예를 들어, 기본 성장 미디어 6 주까지 유지 될 수있다. 이는 dbcAMP 및 BDNF 등의 시약은 신선하고 안정 보장합니다. 또한 신선한 배치가 이루어져야 전에 RA에만 최대 6 주 동안 어두운 보관해야 제조. 우리는 신경 결과의 큰 일관성 w를 관찰이주의 사항 i 번째.
성숙한 신경 세포로 분화되고 나면, 이들은 최대 2 주 후 말단 분화 유지 실험에 사용될 수있다. 터미널 차별화에 따라, 매체는 3-4 일마다에게 (차별화 미디어 # 3)을 변경해야합니다. 분화 된 뉴런 달리, 미분화 된 SH-SY5Y 세포 배양 물을 함유하는 유지 플라스크 정기적으로 계대 여러 주에 걸쳐 유지 될 수있다. 그것을 방지하기 위해 정기적으로 유지 보수 통로 배양에 중요한 이상 인구 더이상 뉴런으로 분화 할 수있는 형상의 상피 세포. 이 세포는 신경 잠재력을 가진 사람들을 능가 할 때, 혈청 기아는 세포 죽음의 불균형 금액의 원인이됩니다. 미분화 문화는 약 15 유로까지 유지 될 수있다. 문화가 15 유로 주위를 초과하면, 미분화 세포가 죽을 시작하고 거친, 건강에 해로운 모양을 가지고있다. 또한, differen적은 수의 세포가 각각의 분할을 살아남을 것 같은 높은 통로 SH-SY5Y 세포의 tiation 더 어렵고, 할 그 사람들은 종종 이후의 분석을 더 어렵게 만들고, 세포체와 축삭을 모두 집계.
많은 세포가 소실되거나 분할 프로세스를 생존하지 않는 분화 과정 중 세포 수에 현저한 감소가있다. 따라서, 분화 SH-SY5Y 세포를 포함하는 모든 실험의 초기에, 한 뉴런 30-40 %의 손실을 고려 ~ 세포의 적절한 수가 원하는 수율을 달성하기 위해 시작에 도금을 보장한다. 100,000 세포를 도금하는 것은 건강하고 성숙한 SH-SY5Y 신경을 많이 생산하고 있지만, 더 적거나 많은 수는 처음에 실험 필요에 따라 도금 될 수있다.
완전히 차별화 된 SH-SY5Y 신경 세포가보다 생체 내에서 발견 된 성숙한 인간의 신경 세포의 가까운 근사치를 제공하는 것이 분명하다 자신의 미분화 전구 세포 대응 (그림 2). 이 신경 세포는 neurotropic 바이러스의 연구를 위해, 자신의 신경 생물학의 미래 특성화를 위해 유리한 모델을 제공 할 것입니다, 또는 신경 세포에 화학 요법 독성 스크리닝 할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
References
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