Abstract
Clonalité tumeur compréhension est essentielle pour comprendre les mécanismes impliqués dans la tumorigenèse et progression de la maladie. En outre, la compréhension des changements de composition de clones qui se produisent dans une tumeur en réponse à certains micro-environnement ou traitements peut conduire à la conception d'approches plus sophistiquées et efficaces pour éradiquer les cellules tumorales. Cependant, le suivi des tumeurs sous-populations clonales a été difficile en raison du manque de marqueurs distinguables. Pour résoudre ce problème, un protocole VDJ-seq a été créé pour suivre les tendances de l'évolution clonale de lymphome à grandes cellules B (LMNH-B) rechute diffuse en exploitant recombinaison VDJ et hypermutation somatique (SHM), deux caractéristiques uniques de lymphomes à cellules B.
Dans ce protocole, le séquençage de prochaine génération (NGS) bibliothèques ayant un potentiel d'indexation ont été construits à partir amplifié immunoglobuline réarrangé chaîne lourde (IgH) région VDJ de paires de diagnostic primaire et de rechute samp DLBCLles. En moyenne, plus de la moitié millions séquences VDJ par échantillon ont été obtenus après le séquençage, qui contiennent à la fois réarrangement VDJ et informations SHM. En outre, les pipelines bioinformatiques personnalisés ont été développés pour utiliser pleinement l'information de séquence pour la caractérisation des IgH-VDJ répertoire au sein de ces échantillons. En outre, le pipeline permet la reconstruction et la comparaison de l'architecture clonale de tumeurs individuelles, ce qui permet l'examen de l'hétérogénéité clonale dans les tumeurs de diagnostic et de déduction de motifs de l'évolution clonale entre le diagnostic de tumeurs et des paires de rechute. Lors de l'application de cette analyse à plusieurs paires diagnostic-rechute, nous avons découvert des preuves essentielles que de multiples tumeurs distinctif des modèles évolutifs pourraient conduire à DLBCL rechute. En outre, cette approche peut être étendu à d'autres aspects cliniques, tels que l'identification de la maladie résiduelle minimale, le suivi des progrès de la rechute et la réponse au traitement, et l'enquête de repertoire immunitairees dans des contextes non-lymphome.
Introduction
Le cancer est une maladie clonale. Depuis, il ya trente ans, lorsque Peter C. Nowell a proposé le cancer clonale modèle d'évolution 1, de nombreuses études ont tenté de disséquer populations clonales dans les échantillons de tumeurs et de reconstruire les modèles d'expansion et l'évolution clonale qui sous-tendent le processus de tumorigenèse 2. Récemment, le séquençage du génome entier a permis aux enquêteurs de prendre un regard profond sur l'hétérogénéité et l'évolution clonale 3,4. Toutefois, en raison de l'absence de marqueurs traitables dans de nombreux types de cellules, il est difficile d'en déduire l'architecture clonale chemin précis et évolutif. Heureusement, il est un marqueur de clonalité naturelle dans les cellules B matures à partir de laquelle de nombreuses tumeurs malignes lymphoïdes, y compris DLBCL, sont originaires. En réponse à la stimulation antigénique, chaque cellule B peut former une séquence productive seule IgH VDJ en rejoignant un V H (variable), un D (diversité), et un J H (rejoindre) le segment ensemble à partir d'une grande piscine de ces segments. Au cours de cette prPROCESSUS, de petites portions de la séquence d'origine peuvent être supprimés et les nucleotides non basés sur des modèles supplémentaires peuvent être ajoutées pour créer un réarrangement VDJ unique. Ce réarrangement VDJ spécifique peut être hérité dans toute la descendance de cette cellule B, marquage donc lymphocytes B matures individuelle et sa progéniture 5. En outre, SHM se produit sur les séquences VDJ recombinés dans le centre germinatif (GC) réaction ultérieure pour introduire des mutations supplémentaires pour l'expansion de la piscine de l'anticorps et la mise en valeur des anticorps d'affinité 6. Par conséquent, en comparant et contrastant VDJ SHM et des motifs d'échantillons de lymphome qui ont subi ces procédés, l'hétérogénéité intra-tumorale pourrait être délimitée et voie d'évolution clonale de la maladie peut être déduite.
Auparavant, le réarrangement VDJ et SHM pourraient être identifiés par amplification par PCR les régions recombinés, le clonage des produits de PCR, puis séquençage de Sanger pour obtenir des informations de séquence. Cette approche is à faible débit et faible rendement, récupérer seulement une très petite partie de l'ensemble du répertoire de VDJ recombiné, et d'entraver la caractérisation de la représentation globale de la population clonale dans un échantillon donné. Une approche modifiée a été créée en générant END indexés bibliothèques de séquençage de produits PCR et VDJ effectuer PE séquençage 2x150 pb pour obtenir plus d'un demi-million de séquences VDJ recombinées par échantillon. En outre, un pipeline personnalisé a été développé pour effectuer un contrôle de qualité (QC), aligner, séquençage filtre VDJ lit d'identifier réarrangements et SHM de chaque lecture, et effectuer une analyse phylogénétique sur l'architecture clonale de chaque échantillon. En outre, une nouvelle approche a été établi afin de mieux caractériser les modèles de l'évolution clonale pour les échantillons prélevés à divers stades de la maladie.
Nous avons appliqué cette technique à des échantillons de patients DLBCL. LMNH-B est une forme agressive de lymphome non hodgkinien à la rechute fréquente dans près d'un eIRD des patients 7. Rechutes surviennent normalement DLBCL début, dans les 2 à 3 ans suivant le diagnostic initial, bien que certains ne se produisent après 5 ans 8. Pronostic pour les patients en rechute est faible, avec seulement 10% la réalisation de trois années de survie sans progression due à des options de traitement limitées. Ceci est la base de la nécessité urgente de nouvelles approches pour traiter DLBCL rechute 9,10. Cependant, les mécanismes moléculaires associés à la rechute LMNH-B sont encore largement inconnu. En particulier, le rôle de l'hétérogénéité clonale au moment du diagnostic et l'évolution clonale au cours du développement de rechute LMNH-B sont actuellement non caractérisé, ce qui rend difficile de définir un biomarqueur précis et plus utile pour prédire une rechute. Pour répondre à ces questions, nous avons appliqué notre approche VDJ-séquençage sur plusieurs paires de paires d'échantillons de diagnostic LMNH-rechute primaire appariés. Deux scénarios évolutifs clonales distinctes de rechute ont émergé de la comparaison des architectures clonales entre le diagnostic et le samp rechuteles mécanismes moléculaires qui suggère multiples peut être impliqué dans DLBCL rechute.
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Protocol
1. Amplification VDJ
1.1) Extraction d'ADN des échantillons de tumeurs
- Extraire l'ADN des sections minces (10-20 um) de PTOM tissus normaux ou malignes embarqués gelés.
- Digest 10-30 coupes minces de tissu enrobé par une coupe au microtome de cryostat dans 4 ml de tampon de lyse nucléique (Tris-HCl 0,0075 M, pH 8,2; 0,3 M de NaCl; 0,002 M Na 2 EDTA) avec de la proteinase K (0,5 mg / ml, concentration finale ) et 0,625% de SDS dans un tube de centrifugation de 15 ml dans un bain d'eau à 37 ° pendant une nuit.
- Ajouter 1 ml de NaCl saturé (5 M) au mélange de digestion et agiter vigoureusement pendant 15 sec.
- Centrifuger à 1100 g pendant 15 min à température ambiante.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation de 15 ml et ajouter deux volumes d'éthanol à 100%.
- Mélanger en retournant le tube 6-8 fois. Centrifuger à 5000 xg pendant 60 min à 4 ° C pour recueillir le précipité d'ADN.
- Laver le culot d'ADN à deux reprises avec 70% d'éthanol. Centrifuge à 5000 g pendant 15 min à chaque fois pour recueillir le culot.
- Dissoudre l'ADN dans un tampon TE 100-400 pi à la température ambiante sur une nuit d'agitation. Le rendement en ADN est de 5 à 200 ug (de concentration finale comprise entre 50 à 500 ng / ul) en fonction de la taille du tissu
- Extraire l'ADN à partir de sections minces (10 à 20 um) d'fixés à la formaline, noyés (FFPE) un tissu normal ou maligne paraffin-.
- Incuber les coupes de paraffine dans 1 ml de xylène deux fois à la température ambiante pendant 10 min à chaque fois dans un tube de 1,5 ml à De-paraffinize. Recueillir les coupes de tissu par centrifugation à 13 000 xg pendant 5 min à température ambiante.
- Incuber les coupes dans 1 ml d'éthanol à 100% deux fois à la température ambiante, 10 min à chaque fois pour éliminer les xylènes de résidus. Recueillir les coupes de tissu par centrifugation à 13 000 xg pendant 5 min à température ambiante. La paraffine est complètement dissous à ce point et que la section de tissu est restants.
- Air-sécher les sections de chambre température pendant 10-15 min.
- Faire une solution à 0,5 mg / ml protéinase K avec un tampon 1x PCR (dilué à partir du tampon 10x PCR avec de l'eau sans nucléase). Ajouter la solution de Proteinase K échantillons dans un volume final de 50 à 100 ul et incuber une nuit à 37 ° C.
- Chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 10 minutes pour inactiver la proteinase K.
Remarque: Lors de cette étape, l'ADN de l'échantillon est dissous dans le tampon de PCR et peut être utilisé dans les étapes 1.2 et 1.3 directement. Le rendement en ADN est de 0,5 à 20 ug (de concentration finale comprise entre 10 à 200 ng / ul) en fonction de la taille du tissu.
1.2) d'évaluation de la qualité de l'ADN
- Mélanger 0,25 ul ADN polymérase Taq avec 45 pi de mélange maître de la trousse de l'échelle commerciale dans un tube PCR.
- Ajouter 5 ul ADN préparé à partir de 1.1.1.7 ou 1.1.2.5 dans le tube PCR et bien mélanger par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois.
- Utiliser les conditions suivantes pour amplifier l'ADN: 95 ° C pendant7 min; suivie par 35 cycles de 45 s à 95 ° C, 45 s à 60 ° C et 90 sec à 72 ° C; puis 72 ° C pendant 10 min et maintenez à 15 ° C.
- Préparation d'un gel d'agarose à 2% dans du TBE (Tris / Borate / EDTA).
- Mélanger réaction de PCR de 20 pi avec 4 ul de colorant de charge 6x, et charger sur un gel d'agarose à 2%.
- Colorer le gel d'agarose avec 0,5 pg / ml de bromure d'éthidium solution et détecter les produits de PCR avec un système de gel de l'imagination. Remarque: les échantillons qui donnent des 5 produits de PCR à des tailles de 100, 200, 300, 400 et 600 pb sera continué à générer des amplicons VDJ.
ATTENTION: Le bromure d'éthidium est un mutagène puissant. S'il vous plaît manipuler avec une extrême prudence en portant des équipements de protection, gants à savoir, et d'en disposer dans des conteneurs spécifiques par les directives de l'institution.
1.3) VDJ PCR
1.3.1) Amplify recombiné IgH VDJ segment de la Région cadre 1 (IgVHFR1)
- Mélanger 45 ul mélange maître de l'étiquette du tubeed comme "Mix 2" d'une hypermutation somatique IGH dosage pour la détection Gel kit commercial, 0,25 ul de l'ADN polymerase Taq, l'ADN de l'échantillon et 5 ul préparé à partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou dans un tube PCR.
- Utiliser les conditions suivantes pour amplifier l'ADN: 95 ° C pendant 7 min; suivie par 35 cycles de 45 s à 95 ° C, 45 s à 60 ° C et 90 sec à 72 ° C; puis 72 ° C pendant 10 min et maintenez à 15 ° C.
- Résoudre le produit de PCR dans un ensemble de gel agarose à 2% par électrophorèse.
- Colorer le gel d'agarose avec 0,5 pg / ml de bromure d'éthidium solution et détecter les produits de PCR avec un système d'imagerie de gel. Un amplicon monoclonal est prévu avec la gamme de taille de 310 à 380 pb.
- Exciser la partie de gel contenant l'amplicon monoclonal entre 310-380 pb.
- Purifier l'ADN excisé à partir du gel en utilisant un kit d'extraction de gel norme selon le protocole du fabricant. Remarque: pour les échantillons qui FR1 fragments ont pu être obtenus, il n'y a pas besoin de amplement IgVHFR2 et IgVHFR3.
1.3.2) Amplify recombiné IgH VDJ segment de cadre Région 2 (IgVHFR2)
- Mélanger 45 ul de mélange-maître à partir du tube appelée "Tube B" d'un commercial IGH Gene Clonality Assay kit de détection de gel, 0,25 ul de l'ADN polymerase Taq, l'ADN de l'échantillon et 5 ul préparé à partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou dans un tube PCR .
- Utiliser les conditions suivantes pour amplifier l'ADN: 95 ° C pendant 7 min; suivie par 35 cycles de 45 s à 95 ° C, 45 s à 60 ° C et 90 sec à 72 ° C; puis 72 ° C pendant 10 min et laisser à 15 ° C.
- Résoudre le produit de PCR dans un ensemble de gel agarose à 2% par électrophorèse.
- Visualiser le produit (s) PCR de 0,5 pg / ml de bromure d'éthidium coloration. Un amplicon monoclonal peut être observé dans la plage de taille de 250 à 295 pb.
- Exciser la partie de gel contenant l'amplicon monoclonal entre 250 à 295 pb.
- Purifier l'ADN à partir de gel excisée en utilisant un extrait de normale GelKit ion selon le protocole du fabricant.
1.4) Optimiser VDJ PCR
- Les conditions de PCR modifiés suivants pour amplifier IgVHFR1 et IgVHFR2 utilisant de l'ADN sous-optimale: 95 ° C pendant 7 min, 40 cycles de 95 ° C pendant 60 sec, 60 ° C pendant 60 sec, et 72 ° C pendant 90 sec, extension finale à 72 ° C pendant 10 min.
2. VDJ Amplicon Bibliothèque Préparation et séquençage
2.1) Préparation Bibliothèque
2.1.1) Fin de réparation
- Transférer le produit PCR VDJ de 1,3 dans un tube PCR et ajouter Resuspension tampon de l'ADN échantillon trousse de préparation pour élever le volume à 60 pi.
- Ajouter 40 pi de réparation de Fin Mix de Kit de préparation de l'ADN de l'échantillon et bien mélanger.
- Incuber la réaction à 30 ° C pendant 30 minutes dans un thermocycleur préchauffé (30 ° C) avec un couvercle préchauffé à 100 ° C.
- Mélanger 136 pi billes magnétiques et 24 ul g PCRl'eau rade d'abord dans un tube de 1,5 ml, puis transférer la totalité de la réaction en fin de réparation à 2.1.1.3 dans le tube de 1,5 ml et bien mélanger avec la solution de perles.
- Placer les tubes sur un support magnétique pendant 2 min pour permettre la séparation des billes de la solution. Aspirer le surnageant et laver les perles avec 80% EtOH frais préparé deux fois tandis que le tube est sur le support magnétique.
- Aspirer la solution d'éthanol complètement et permettre aux billes sécher à l'air pendant 15 min à température ambiante pendant 15 min.
- Prenez le tube de la béquille et remettre les billes magnétiques dans 17,5 ul Resuspension tampon.
- Placer les tubes de retour sur le support magnétique pendant 2 min à des billes distinctes de la mémoire tampon de remise en suspension. Retirer le tampon de remise en suspension (produit Fin de réparation est remis en suspension dans le tampon Resuspension maintenant) dans un tube de PCR clean.
2.1.2) A-tailing
- Ajouter 12,5 pi A-tailing mélange dans le tube PCR contenant le produit Fin de réparation et mélanger soigneusement. Incuber le tube PCR à 37 ° C pendant 30 minutes dans un thermocycleur préchauffé (37 ° C) avec un couvercle pré-chauffé à 100 ° C.
2.1.3) Adaptateur ligature
- Ajouter 2,5 pi de tampon de remise en suspension, 2,5 pi de mélange de ligature, et 2,5 pi Index adaptateur ADN dans la réaction de A-tailing.
- Incuber la réaction à 30 ° C pendant 30 minG dans un thermocycleur préchauffé (30 ° C) avec un couvercle préchauffé à 100 ° C.
- Ajouter 5 ul arrêt Tampon ligature dans chaque réaction et mélanger soigneusement.
- Mélanger 42,5 billes magnétiques ul bien mélangés pour nettoyer la réaction suivante étapes 2.1.1.5 à 2.1.1.8. Ajouter 50 ul Resuspension tampon pour éluer le produit de l'adaptateur ligaturé.
- Nettoyez le produit de l'adaptateur ligaturé pour une deuxième fois en utilisant 50 ul bien mélangés perles AMPure XP, et on élue le produit en 25 tampon Resuspension ul dans un tube propre PCR.
2.1.4) Fragments amplifier l'ADN
- Ajouter 5 ul PCR Primer Cocktail et 25 pi PCR Master Mix au tube PCR contenant le produit de l'adaptateur ligaturé et bien mélanger.
- Effectuer une amplification dans un thermocycleur préprogrammée avec les conditions suivantes: 98 ° C pendant 30 s; 10 cycles de 98 ° C pendant 10 sec, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s; puis 72 ° C pendant 5 min et maintenez à 10 ° C.
- Nettoyer la réaction en utilisant 50 pi de billes magnétiques bien mélangés, et éluer le produit final dans 30 ul de tampon de remise en suspension.
2.1.5) Bibliothèque de validation
- Quantifier le produit final avec un fluoromètre en utilisant le protocole du fabricant. Concentration finale de bibliothèque est comprise entre 2,5 à 20 ng / ul.
- Évaluer la qualité du produit final en utilisant un instrument d'analyse de l'ADN avec puce haute sensibilité selon le protocole du fabricant. Attendez-vous à une seule bande avec la taille attendue pour soit IGVHFR1, IGVHFR2 ou IGVHFR3. Texpected taille de la bibliothèque produit correspond à la taille de l'amplicon de VDJ original et de la taille des adaptateurs (~ 125 pb).
2.2) VDJ-PCR et séquençage Bibliothèque Pooling
- Calculer la molarité de chaque fraction bibliothèque en utilisant la formule suivante: nM = [(ng / 1,000) / 660 pb *] x 10 9 où ng est la concentration de la bibliothèque VDJ-PCR mesurée à l'étape 2.1.5.1 pb et est le pic taille de la bibliothèque VDJ-PCR mesurée à l'étape 2.1.5.2.
- Diluer la bibliothèque à 2 nM (10 pi au total) avec de l'eau exempte de DNase.
- On combine les 10 ul de 2 nM de bibliothèques dilué ensemble dans un tube de 1,5 ml.
- Ajouter un volume égal de contrôle de pointe dans PhiX dans le tube de 1,5 ml.
- Chargez la piscine à une concentration de 7 pM sur une cuve à circulation.
- Séquencer les bibliothèques en utilisant un séquenceur couplé à cycle de gamme 150 selon le protocole du fabricant.
Analyse des données 3.
Remarque: Un summAry des scripts de bioinformatique utilisés dans cette section peut être trouvé comme un fichier de code supplémentaire.
3.1) Alignement et QC
- Carte jumelé fin séquençage lit contre un IGH V humaine, D et base de données de région J téléchargé à partir du site web de IMGT 11 en utilisant un algorithme BLAST nucléotidique adaptée basée sur 'blastn' disponibles à partir de NCBI avec écart pénalité d'ouverture de 2, l'écart pénalité d'extension de 1, longueur de mot de 7, et le seuil de 10 -4 e-valeur. Jeter la paire lu ne correspond pas à la fois un IGH V et une région J.
- Comptez le nombre de paires de lire restants qui ont IGH V et J correspondances pour obtenir les fréquences de correspondant combinaisons de VJ travers tous lu paires obtenues à partir de la course de séquençage sur l'échantillon. Comptez une lecture paire si elle est mappée à la fois un IGH V et J gène, puis ajouter son allèle le compte correspondant pour la combinaison de VJ particulier.
- Classez les chiffres pour chaque région VDJ recombiné obtenu à partir de 3.1.2 de la hauteEst au plus bas. La région VDJ a le plus haut lectures comptage est définie comme la combinaison majeure de réarrangement.
- Jeter séquences alignées qui couvrent moins de 35% du domaine réarrangement majeur identifié dans 3.1.3.
3.2) Profil SHM identification
- Comptez tous les modèles SHM à travers le lit de l'étape 3.1.3. Définissez chaque modèle SHM comme un sous-clone.
- Comptez le nombre de sous-clones qui sont correspondant à différents modèles uniques SHM, et le nombre de lectures qui sont mis en correspondance avec des sous-clones individuels.
3.3) représentation graphique des résultats
- Effectuer l'analyse phylogénétique sur les sous-clones en utilisant leurs modèles SHM correspondants en utilisant un quartier méthode de package R "singe" d'assemblage selon le protocole du fabricant. Calculer une matrice de distances à partir des alignements distincts individuels pour recréer la phylogénie de sous-clone ancrée à la séquence de la lignée germinale du VJ combinaison en question pour chaque ensemble de l'échantillon apparié.
- Utilisation de la séquence nucléotidique de chaque sous-clone en tant que vecteur de caractères et de calculer la distance de chaîne approximative entre tous les sous-clones dans la majeure réarrangement VJ à la fois pour le diagnostic et des échantillons de rechute correspondants en utilisant une mesure de distance de Levenshtein où mathématiquement la distance entre deux alignements est donné par d x, y (i, j) où d x, y (i, j) = 1 si i ≠ j et 0 sinon, puis additionner cette fonction sur la longueur de la chaîne correspondant à des séquences nucléotidiques I et J.
- Afficher graphiquement la matrice résultant des distances de sous-clone et le nombre de leurs sous-clone correspondantes dans les deux façons suivantes:
- Utilisez le paquet R "masse", selon le protocole du fabricant d'appliquer analyse multidimensionnelle à la matrice de distance de sous-clone et de générer un principe à deux dimensions coordonnées de carte, qui est ensuite tracée avec le logarithmesubclonal de chiffres que le rayon du cercle.
- Construire un graphe non orienté sur la base de la distance de Levenshtein, où les sommets correspondent à chaque sous-clone distinct provenant de la majeure réarrangement VJ.
Remarque: Si la distance entre deux clones distincts est égal à un, alors il existe une arête entre ces deux sommets. Si la distance est supérieure à un, alors il n'y a pas de bord en les reliant. - Le graphique du 3.3.3.2 en utilisant la fonction de tkplot dans le package de R "IGRAPH" avec la mise en page Kamada Kawai selon le protocole du fabricant. Le rayon des sommets est proportionnelle à la racine cubique du nombre total de clones mis en correspondance avec elle et l'ombrage utilise une gamme rouge et bleu pour indiquer que la proportion de clones qui soit font partie du diagnostic (bleu) ou de rechute (rouge) échantillons .
3.4) Hétérogénéité (entropie) Mesure
- Examiner les numéros et les chiffres de sous-clone de lamotifs individuels de mutations somatiques se produisent dans la majeure réarrangement VJ pour chaque ensemble d'échantillons appariés.
- Calculer l'entropie empirique et entropie empirique résiduelle ajusté pour le nombre de clones distincts dans chaque échantillon en utilisant l'estimation de l'entropie en fonction histogramme standard.
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Representative Results
La procédure globale de séquençage VDJ (VDJ-seq), y compris l'extraction d'ADN, recombiné VDJ région d'amplification et de purification, la construction de la bibliothèque de séquençage, lit le traitement et l'analyse phylogénétique, est représenté sur la figure 1. Régulièrement 5-200 pg d'ADN peut être extrait à partir de coupes de tissus congelés ou solide 0,5-20 ug d'ADN à partir de coupes de tissus inclus en paraffine fixés au formol. En fonction de la qualité, le motif de réarrangement, et le degré de SHM échantillons individuels, une série de produits de PCR provenant de différents VDJ échantillons peut être obtenue (Figure 2), y compris IGVHFR1 (310-380 pb), FR2 (pb 250-295), et FR3 (70-120 pb). Les échantillons à partir de laquelle seul fragment FR3 peuvent être obtenues auprès VDJ PCR ont été exclus de l'étude restant dû au produit à court qui ne fournit pas suffisamment d'information de séquence pour aval fins d'analyse de données. Seuls les échantillons dont un produit majeur FR1 ou FR2 PCR peut être visualisé sur egel d'agarose e sont traitées pour générer des bibliothèques de séquençage. Le rendement en le produit principal PCR après purification sur gel varie de 10 à 50 ng au total.
L'ensemble du produit de PCR purifié a été utilisé pour la construction de la bibliothèque pour une bibliothèque ultérieure de séquençage. Après adaptateur ligature, chaque échantillon obtient son propre index unique. Au cours de l'amplification bibliothèque, 10 cycles de PCR ont été réalisées qui pourraient produire plus de 30 ng tant que produits finaux de la bibliothèque. La qualité de la bibliothèque a été consulté par un bioanalyseur. Comme le montre la Figure 3, il existe un seul et même produit dans l'échantillon de la bibliothèque avec un changement de taille de 125 pb ~ former le produit amplicon de PCR VDJ originale indiquant le supplémentaire de l'adaptateur. Pour chaque essai de séquençage, 5-10 bibliothèques ont été rassemblées à 7 pm. En outre, en raison de la similarité de séquence élevée entre les produits VDJ PCR, la piscine bibliothèque a été mélangé avec 50% PhiX à pic en assurer la complexité de la course et l'identification correcte de la basesupplémentaire après chaque cycle de séquençage. Bibliothèque de fragments d'ADN ont été séquences pour 150 pb sur les deux extrémités, ce qui permet la récupération d'une quantité suffisante d'information de séquence couvrant VD et DJ jonctions pour les fragments FR1, SHM et des motifs de mutation pour l'analyse phylogénétique.
Auparavant, nous avons réalisé le séquençage VDJ sur 32 échantillons prélevés au moment du diagnostic DLBCL et de rechute de 14 patients (plusieurs patients avaient de multiples échantillons prélevés à chaque étape de diagnostic ou de rechute) en utilisant la condition décrite ci-dessus 12. En effectuant l'analyse phylogénétique des profils SHM des grands réarrangements V H DJ H entre les paires d'échantillons, un «Early-divergente" et un mode "Late-divergente» de l'évolution clonale associée à la rechute LMNH-B ont été identifiés 12. Ici, la même approche a été appliquée à un diagnostic DLBCL nouvellement collecté et paire rechute. Les régions FR1 ont été obtenus dans les deux échantillons après PAmplification CR. Un produit de PCR de la taille importante avec environ 344 pb (mesuré par bioanalyseur) a été obtenu à la fois le diagnostic et les échantillons de rechute. Après séquençage, un total de 0,70 millions de paires de gamme lectures ont été obtenus pour l'échantillon de diagnostic et de 0,73 millions de paires de gamme lit pour l'échantillon de rechute, qui étaient dans la gamme du nombre de lectures obtenues par échantillon dans l'étude précédente (0.38- 1,42 million, en moyenne de 0,75 ± 0,26 million) 12. Après la cartographie jumelé fin lit contre la base de données IMGT, lit qui ne possèdent pas tous les trois coups sûrs en V, D et J régions ont été jetés. V H DJ H arrangement a été attribué à chaque lecture jumelé-end. Un total de 0,64 million et 0,67 million de V H DJ H jonctions ont été identifiés dans les échantillons de diagnostic et de rechute, respectivement, ce qui représente le taux d'alignement de plus de 90%. En comptant le nombre de fois où chaque combinaison de V H DJ H a été trouvé dans les échantillons individuels, distincts 808 V H </ sub> DJ H jonctions ont été trouvés dans l'échantillon de diagnostic et 581 jonctions distinctes V H DJ H dans l'échantillon de rechute. La jonction dominante V H DJ H dans les deux échantillons est IGHV4-34 * 2 * 01 IGHJ2 IGHD5-5 * 01, confirmant qu'ils sont liés par clonage. Cette jonction dominante V H DJ H représenté 97% de l'ensemble de V H DJ H mappé jonction lit à la fois dans l'échantillon de diagnostic et l'échantillon de rechute.
Pour retracer l'évolution clonale de ce cas de rechute LMNH-B, l'analyse phylogénétique des profils SHM des grands réarrangements V H DJ H entre cette paire d'échantillons de diagnostic et de rechute a été effectuée. Nous avons observé que le modèle de l'évolution clonale de cette paire suivait le chemin "Late-divergente" (Figure 4), que les sous-clones du diagnostic et de rechute des tumeurs regroupés sur la même branche de l'arbre phylogénétique, et la dominantesous-clone de diagnostic et les sous-clones de rechute dominantes partagées modèle SHM similaire avec quelques mutations supplémentaires ont eu lieu dans le sous-clone de rechute. Ces résultats suggèrent que il y avait potentiellement un sous-clone dans le diagnostic de la tumeur qui était soit chimio-résistants ou échappé du traitement, puis finalement développé dans la tumeur de la rechute.
Pour mieux caractériser et visualiser l'architecture clonale de chacun des échantillons et les modèles d'évolution clonale pendant le processus de rechute, deux nouvelles analyses ont été développés. Dans ces analyses, l'ensemble des sous-clones de la majeure réarrangement VJ dans chaque échantillon ont été utilisés pour calculer la distance de chaîne par paire entre tous les sous-clones tels que définis par leurs habitudes de SHM. Ensuite, à l'aide de mise à l'échelle multidimensionnelle (figure 5A, 5B) ou en construisant un graphe non orienté (figure 5C, 5D), comme décrit dans l'analyse de données, les parcelles représentant la distribution et l'hétérogénéité des sous-clones ont été créés. Commeillustré sur la figure 4, le tracé MDS présente beaucoup moins de diversité de séquence entre les principaux sous-clones dans les cas divergents retard (Figure 5A) que dans le cas divergentes début (figure 5B). En outre, les sous-clones de l'échantillon de diagnostic et les sous-clones de l'échantillon de rechute dans le cas divergent précoce séparer complètement l'une de l'autre, ce qui indique l'absence de similitude des modèles SHM entre ces tumeurs, même si elles portent le même réarrangement VDJ . De même, les graphes non orientés dans (Figure 5C) et (Figure 5D) montrent que la distribution du nombre de sous-clone à la fin du cas divergente (Figure 5C) diffère du début du divergent (Figure 5D). Ce dernier a plus éminents, mais génétiquement différentes clones majeurs du diagnostic à la rechute. En outre, l'absence de bords plus petites sous-clones et des connexions entre les grands clones de diagnostic des rechutes et de ladébut cas divergente (Figure 5D), démontrer la nature de la diversité de la séquence du début divergente cas de rechute.
Figure 1:.. Etape par organigramme de l'étape de l'approche de VDJ-seq La procédure globale de séquençage VDJ est représenté S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: des images représentatives de VDJ PCR produits d'amplification. Images de gel montrant le représentant IgVH-FR1 (panneau de gauche) et IgVH-FR2 (panneau de droite) produits de PCR de l'ADN extrait d'échantillons de lymphome patients. Un produit de PCR n'a pu être obtenu dans l'échantillon 5 probablement en raison de la faible soitla qualité de l'échantillon d'ADN ou SHM sur les sites d'amorces qui porte atteinte à la réaction PCR. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. QC amplicon de PCR et VDJ bibliothèque de séquençage ultérieur par bioanalyseur Représentant Bioanalyzer trace du même VDJ amplicon avant la construction de bibliothèque (en haut) et après la construction bibliothèque (panneau inférieur). Notez le changement de taille de 334 pb à 459 pb indiquant l'ajout de l'adaptateur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Clonale analyse de l'évolution d'une paire de DLBCL échantillons de diagnostic et de rechute. L'analyse phylogénétique d'un LMNH paire d'échantillons de diagnostic rechute montrant le mode clonale "Late-divergent" évolution. Les tickers de couleurs représentent l'état de mutation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Nouvelles méthodes graphiques pour visualiser les modèles d'évolution clonale (A, B) des parcelles de cadrage multidimensionnel intégrant profils SHM et le nombre de sous-clone de l'échantillon paire A montrant le mode de rechute tardive divergente (A) et l'échantillon paire B montrant le mode de rechute précoce-divergent. (B). Le rayon des cercles indiquent le nombre de subclceux correspondant à un profil particulier SHM et de couleurs correspondant au diagnostic (bleu) de l'échantillon ou de rechute (rouge) échantillon. Les X et Y axes représentent les 2 premiers composants de MDA. (C, D) graphes non orientés de l'échantillon paire A montrant le mode fin-divergent rechute (C) et l'échantillon B paire montrant mode de rechute précoce-divergent (D). Bords correspondent à deux profils SHM ayant une distance de chaîne d'une séparation de lettre et Dégradé (couleur barre d'échelle) indiquant la proportion de séquences cartographie à un profil SHM particulière correspondant au diagnostic (rouge) de l'échantillon ou de rechute (jaune) de l'échantillon. S'il vous plaît cliquer sur ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
En raison du nombre pratiquement illimité d'itérations de l'information de séquence codée par réarrangement VDJ et SHM au locus IGH des cellules B humaines, l'examen de l'ensemble IGH répertoire en haut débit profond séquençage avéré être un moyen efficace et complet pour délimiter clonale et les populations de cellules B sous-clones. De plus, cette stratégie peut être utilisée pour étudier la trajectoire de l'évolution clonale de développement des cellules B de la tumeur, la rémission, rechute et en comparant les architectures de clones et sous-clones des échantillons de patients collectées le long de différents stades de la maladie. Bien que l'amplification des séquences VDJ réarrangés à partir de l'ADN de l'échantillon primaire est aisément réalisée dans un environnement de laboratoire disponibles dans le commerce en utilisant des amorces, l'efficacité de l'amplification dépend largement de la qualité de l'ADN de l'échantillon. En particulier, l'ADN extrait d'échantillons FFPE présente une faible efficacité d'amplification, et souvent uniquement le petit fragment FR3 peut être amplifié avec succès à partir de ceux-ciéchantillons, ce qui les rend impropres à l'analyse ultérieure. Depuis notre étude décrit ici a été conçu pour comprendre la clonalité de lymphome B cellulaire, qui est une maladie clonale avec un ou plusieurs clones majeurs dominant la totalité de la tumeur, nous ne collecté et séquencé le produit majeur VDJ-PCR. Pour les études intéressés à cataloguer l'ensemble de la population clonale de cellules B, par exemple, le sang périphérique, une plus grande partie du gel qui contient plusieurs produits VDJ-PCR (plusieurs bandes ou un frottis sur le gel) peut être excisée et séquencé. Cependant, il est important de souligner qu'il est pas possible de capturer l'ensemble du répertoire de IGH réarrangé parce que certains SHM peut se produire au cas amorces cible et nuire à l'amplification de ces VDJs. En outre, récemment, un dosage commercial couplant directement amplification IGH de réarrangement et le séquençage MiSeq a été introduit. Ce dosage rationalise processus de préparation de l'échantillon. Cependant, étant donné que tous les échantillons non tumorales pourraient genresTe le fragment FR1, nous vous recommandons de toujours y compris l'étape d'électrophorèse sur gel de vérifier le produit de la réaction PCR avant la mise en commun des échantillons pour le séquençage.
Séquençage 150 pb des deux extrémités du fragment VDJ (total de l'information de séquence de 300 pb) présente les avantages suivants: 1) 300 séquençage d'pb peut couvrir la majorité de la FR1 et l'ensemble du fragment FR2, fournissant suffisamment d'informations de séquence pour identifier VDJ réarrangement et hyper-mutations somatiques; 2) La plate-forme fournit séquençage rapide demi-tour de temps qui complète l'ensemble des 300 cycles de VDJ-séquençage sous 48 h; 3) Chaque course permet un multiplexage jusqu'à 12 échantillons et atteint encore environ un million de paires de gamme lit par exemple de sortie. Parce que la similarité de séquence élevée entre les clones portant le même réarrangement VDJ, en particulier dans les échantillons de lymphome B cellulaire, il est essentiel de pic-à 20-50% PhiX pendant la course au séquençage pour permettre de définir avec précision la base appelant matrice. Récemment, le MiSeqlogiciel a été mis à jour pour répondre à cette question. Il est recommandé d'utiliser aussi peu que 5% PhiX pic-in pour le séquençage bas de la bibliothèque de la complexité. Cependant, notre installation de séquençage a connu concentration incompatible de l'ADN de contrôle de pointe dans PhiX fournies par le fabricant qui pourrait compromettre l'issue de faible séquençage de complexité. Par conséquent, dans la pratique courante, nous utilisons encore 10-20% PhiX pic-in pour le séquençage VDJ. Pour le séquençage de la totalité du sang périphérique répertoire des cellules B, qui contient normalement un grand nombre de différents arrangements de VDJ, il est possible de réduire la quantité de PhiX épi-in. Bien que le nombre de clones et sous-clones identifiés de chaque échantillon est positivement corrélée avec le nombre de lectures séquencé, la moitié d'un million de paires de gamme lectures par échantillon est suffisant pour comparer les structures clonales entre les échantillons et en déduire des modèles de l'évolution clonale entre les échantillons prélevés à différents stades de la maladie du patient 12. Même c'estpossible que PE 150 séquençage pb pourrait ne pas parvenir à une couverture suffisante de ces fragments de FR1 longues (c.-à 350-380 pb). Dans certains cas, les informations de séquence du segment D pourrait ne pas être collectées ou il pourrait ne pas être une information de séquence assez sur le segment V de différencier les sous-clones par SHM. Cependant, avec les progrès des technologies de séquençage, il est devenu possible de séquencer et plus couvrir l'ensemble amplicon FR1.
Grâce au séquençage du répertoire IGH des cellules B, il était possible de suivre l'expansion des clones individuels de cellules B et en déduire l'évolution clonale au cours du diagnostic à la rechute. Avec l'utilisation de l'analyse sur les populations des sous-clones générés par les modèles SHM, nous avons pu distinguer deux modes de progression du cancer de la rechute en examinant leurs phylogénies. Les dernières représentations graphiques en utilisant des parcelles de positionnement multidimensionnel et graphes non orientés en fonction de la distance de Levenshtein encore allow nous de comprendre 1) la composition subclonal de chaque tumeur, 2) la façon dont les sous-clones individuels sont liés les uns aux autres, et 3) la façon dont chaque sous-clone évolue au cours progression de la maladie. En outre, l'analyse statistique a montré que ces structures phylogénétiques étaient clairement différente et que les populations subclonal divergeaient quant à leur hétérogénéité. Enfin, la trajectoire d'évolution clonale obtenue par VDJ-séquençage peut être bien corrélé avec l'évolution génétique et caractérisé par l'une ou l'exome resequencing 12 ciblé. Par conséquent, la combinaison de ces deux approches a le potentiel d'identifier des mutations du pilote pendant lymphomagenèse et le lymphome rechute
En plus de définir la B IGH cellulaire répertoire et retracer l'évolution clonale de la progression du lymphome, l'approche VDJ-seq peut être potentiellement utilisé comme une méthode très sensible pour repérer maladie minimale de résidu, suivi de la réponse tumorale aux thérapies, et potentiellement identifier la présencedes clones résistant aux médicaments. Une approche similaire peut également être appliquée aux cellules T pour mapper répertoire de récepteur de lymphocyte T, et peut être utilisé pour sonder la réponse immunitaire de surveillance du cancer. En outre, VDJ-seq peut également être effectuée dans des modèles murins en utilisant des amorces disponibles à partir de Hanna et al. 13 Il est prévisible que les renseignements recueillis grâce à cette approche dans les prochaines années peut conduire à une meilleure compréhension de la dynamique de développement de la tumeur ainsi que élargir notre connaissance du système immunitaire et ses rôles dans la défense de notre organisme contre l'invasion tumorale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
| 50x TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
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- Greaves, M., Maley, C. C.
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
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- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
