Abstract
Anlama tümör klonalite tumorigenezden ve hastalığın ilerlemesi yer alan mekanizmaların anlaşılması için önemlidir. Buna ek olarak, belirli bir mikro-ortam veya uygulamaya yanıt olarak bir tümör içinde meydana klonal bir bileşim değişiklikleri anlama tümör hücrelerini yok etmek için daha gelişmiş ve etkili yöntem tasarımına yol açabilir. Ancak, izleme tümör klonal alt popülasyonları nedeniyle ayırt belirteçlerin eksikliği zor olmuştur. Bu sorunu çözmek için, bir VDJ seq protokol VDJ rekombinasyonu ve somatik hipermutasyona (SHM), B hücreli lenfomalarda iki benzersiz özellikleri istismar ederek diffüz büyük B hücreli lenfoma (DLBCL) nüks klonal evrim modellerini izlemek için oluşturuldu.
Bu protokolde, indeksleme potansiyeli ile Yeni Nesil sıralama (NGS) kütüphaneler birincil tanı ve nüks DLBCL samp çiftleri amplifiye yeniden düzenlenmiş immünoglobulin ağır zincir (IgH) VDJ bölgesinden inşa edildiles. Numune başına ortalama milyondan fazla yarısı VDJ dizileri VDJ yeniden düzenleme ve SHM bilgilerini bir arada bulunduran sıralama, sonra elde edildi On. Buna ek olarak, özel biyoinformatik boru hatları tamamen bu örneklerin içinde IgH-VDJ repertuar karakterizasyonu için sırası bilgilerini kullanmak için geliştirilmiştir. Ayrıca, boru hattı yeniden yapılanma ve tanı tümörlerinin tanı ve nüks tümör çiftleri arasındaki klonal evrim kalıpları düşüldükten içinde klonal heterojenite incelenmesini sağlayan bireysel tümörlerin klonal mimarisi, karşılaştırılmasına olanak sağlar. Birkaç tanı nüks çiftleri bu analizi uygularken, birden fazla ayırt edici tümör evrimsel modeller DLBCL nüks yol açabilecek önemli kanıtlar ortaya çıkardı. Ayrıca, bu yaklaşım, minimal rezidüel hastalığın tanımlanması, nüks ilerleme ve tedaviye yanıtı izlemek ve bağışıklık repertuarıyla soruşturma gibi diğer klinik yönlerini içine genişletilebilirolmayan lenfoma bağlamlarda es.
Introduction
Kanser klonal bir hastalıktır. Otuz yıl önce Peter C. Nowell kanseri klonal evrim modeli 1 teklif Ne zamandan beri birçok çalışma tümör örnekleri içinde klonal popülasyonları incelemek ve tumorigenezden sürecini 2 altında yatan klonal genişleme ve evrim modellerini yeniden denedim. Son zamanlarda, bütün genom dizileme klonal heterojenite ve evrim 3,4 derin bir bakmak araştırmacıları sağladı. Ancak, pek çok hücre tipinde izlenebilir belirteçlerin eksikliği nedeniyle, kesin klonal mimari ve evrimsel yolu sonucuna zordur. Neyse DLBCL dahil olmak üzere birçok lenfoid maligniteler, kaynaklandığı olgun B hücrelerinde doğal bir klonalite işareti vardır. Antijen uyarılmasına tepki olarak bu segmentlerin büyük bir havuzdan bir araya segmenti, her bir B-hücresi V H (değişken), D (çeşitlilik) katılarak tek bir üretim IgH VDJ sekansı meydana getirebilir, ve J, H (birleştirme). Bu pr sırasındakapsayabilecektir orijinal dizisinin küçük porsiyonlarda silinebilir ve ek olmayan şablonu nükleotidleri benzersiz VDJ yeniden düzenlenmesini oluşturmak için ilave edilebilir. Bu özel VDJ yeniden düzenlenmesi, bu nedenle bireysel olgun B-hücresi ve yavrular 5 etiketleme, bu B-hücre tüm yavrularında kalıtsal olabilir. Bundan başka, antikor, SHM havuz genişlemesi ve antikor afinite 6 arttırılması için ek mutasyonlar dahil etmek için daha sonra germinal merkez (GC) reaksiyonunda rekombine VDJ sekanslarda ortaya çıkar. Bu nedenle, karşılaştırma ve bu işlemleri geçirmiş lenfoma örnekleri VDJ ve SHM desen karşılaştırarak, tümör içi heterojenlik tarif edilebilir ve hastalığın gelişimi klonal yolu saptanabilecektir.
Daha önce, VDJ yeniden düzenlenme ve SHM sekans bilgilerini elde etmek için PCR ürünleri, ve daha sonra Sanger sıklıklaştırıcı klonlama, rekombine bölgeleri amplifiye PCR ile tespit edilebilir. Bu yaklaşım, iTüm rekombine VDJ repertuarının, sadece çok küçük bir bölümünü almak ve belirli bir örnek içinde klonal nüfusun genel temsil karakterizasyonu engelleyen, düşük verimlilik ve düşük bir verim s. Modifiye yaklaşım VDJ PCR ürünlerinden NGS endeksli sıralama kütüphaneleri üreten ve numune başına daha yarım milyondan fazla rekombine VDJ dizileri elde etmek için PE 2x150 bp sıralama yapılarak oluşturuldu. Buna ek olarak, özel bir boru hattı filtre VDJ dizileme her okuma düzenlenmeleri ve SHMS belirlemek ve her numunenin klonal mimarisi üzerine filogenetik analizi gerçekleştirmek için okur, kalite kontrol (QC) gerçekleştirmek hizalamak için geliştirilmiştir. Buna ek olarak, yeni bir yaklaşım daha çeşitli hastalık evrelerinde toplanan örneklerin klonal evrim modellerini karakterize etmek kurulmuştur.
Biz DBBHL hasta numunelerinin için bu tekniği uyguladık. DBBHL kadar bir inci sık nüks ile non-Hodgkin lenfoma saldırgan formudurHastaların 7 ird. Yaklaşık 5 yıl 8 sonra meydana rağmen DLBCL nüksler normalde ilk tanı 2 ila 3 yıl içinde erken ortaya çıkar. Nüksetmiş hastalarda prognoz sadece% 10 nedeni tedavi seçenekleri kısıtlı 3 yıllık progresyonsuz sağkalım elde kötüdür. Bu DBBHL nüks 9,10 tedavisinde yeni yaklaşımlar için acil ihtiyaç için temeldir. Ancak, DBBHL nüks ile ilişkili moleküler mekanizmalar henüz tam olarak bilinmemektedir. Özellikle, DBBHL nüks gelişimi sırasında tanı ve klonal evrim de klonal heterojenite rolü, halen uncharacterized olan zor nüks tahmin etmek doğru ve yararlı bir biyobelirteci tanımlamak için yapım. Bu soruları gidermek için, biz eşleşti primer tanı nüks DBBHL örnek çiftlerinden birden çiftleri bizim VDJ-sıralama yaklaşımı uygulandı. Nüks İki farklı klonal evrim senaryoları tanı ve nüks samp arasındaki klonal mimarileri karşılaştırıldığında ortaya çıkanBirden moleküler mekanizmaları öneriyor les DLBCL nüks tutulabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. VDJ Büyütme
Tümör Örneklerinden 1.1) DNA Ekstraksiyon
- Donmuş Ekim gömülü normal veya malign dokuların ince kesitlerinin (10-20 mikron) DNA ayıklayın.
- Proteinaz K ile (0.5 mg / ml, son konsantrasyon elde 4 mi Nükleik Lizis Tamponu (; 0.3 M NaCl 0.002 M Na2EDTA 0,0075 M Tris HCI, pH 8.2) bir kriyostat mikrotom ile kesilmiş gömülü doku 10-30 ince kesitler Digest ) ve gece boyunca bir 37 ° C su banyosu içinde, 15 ml santrifüj tüpü içinde 0,625% SDS.
- Sindirim karışımı, doymuş NaCl (5 M) 1 ml ilave edilir ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1100 x g'de santrifüjleyin.
- Yeni bir 15 ml santrifüj tüpüne süpernatant aktarın ve 100% etanolden iki hacmin ilave edin.
- Tüpü 6-8 kez tersine çevirerek karıştın. 4 ° C'de 60 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüjleyin Çökelen DNA toplamak.
- % 70 etanol ile iki kez DNA pelet yıkayın. Centr15 dakika pelet toplamak için her zaman için 5.000 xg'de ifuge.
- Bir çalkalama gece boyunca oda sıcaklığında 100-400 ul TE tampon maddesi içinde DNA içinde çözülür. DNA verimi doku boyutuna bağlı olarak 5 ila 200 ug (50-500 ng / ul arasında nihai konsantrasyon)
- Formalinle sabitlenmiş, parafin gömülü (FFPE), normal veya habis doku ince bölümler (10-20 um) DNA ekstrakte edin.
- Iki kez 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 10 dakika, her seferinde, oda sıcaklığında de-paraffinize ksilen 1 ml parafin kesitleri inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13.000 x g'de iplik doku bölümleri toplayın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika tortu, ksilenler çıkarmak için her iki kez 1 ml% 100 etanol içinde bölümleri inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13.000 x g'de iplik doku bölümleri toplayın. Parafin tamamen bu noktada çözülür ve sadece doku bölümü ayakta durmaktadır.
- Oda te de bölümleri Hava kuruması10-15 dakika boyunca mperature.
- (Nükleaz içermeyen su ile 10x PCR tamponu seyreltilmiş), 1x PCR tampon maddesi ile bir 0.5 mg / ml Proteinaz K solüsyonu sağlayın. 50-100 ul'lik bir nihai hacim içinde örnekleri Proteinaz K solüsyonu ilave edin ve gece boyunca 37 ° C enkübe edilir.
- Proteinaz K. inaktive etmek için 10 dakika boyunca 95 ° C 'de ısıtınız örnekleri
Not: Bu adımda, örnek DNA, PCR tampon maddesi içinde çözülmüş ve direkt Adım 1.2 ve 1.3 'de kullanılabilir. DNA verimi doku boyutuna bağlı olarak 0.5 ila 20 ug (10-200 ng / ul arasında nihai konsantrasyon).
1.2) DNA Kalite Değerlendirmesi
- PCR tüpünde ticari merdiven kiti ana karışımı 45 ul 0,25 ul Taq DNA polimeraz karıştırın.
- PCR tüpüne 1.1.1.7 veya 1.1.2.5 hazırlanabilir 5 ul DNA ekleyin ve en az 5 kez pipetleme aşağı iyice karıştırın.
- 95 ° C için: DNA'yı büyütmek için aşağıdaki şartları kullanın7 dakika; 95 ° C, 60 ° C 'de 45 saniye ve 72 ° C'de 90 saniye, 45 saniye 35 döngü, ardından; daha sonra 10 dakika boyunca 72 ° C ve 15 ° C 'de sabit.
- TBE (Tris / borat / EDTA) ve% 2 agaroz jeli hazırlayın.
- 4 ul 6x yükleme boyası ile 20 ul PCR reaksiyon karışımı, bir% 2 agaroz jeli üzerine yüklenir.
- 0.5 ug / ml etidyum bromür solüsyonu ile agaroz jel leke ve bir jel hayal sistemi ile PCR ürünleri algılar. Not: 100, 200, 300, 400 ve 600 bp ebatlarda 5 PCR ürünleri elde edildi örnekleri VDJ amplikonları oluşturmak için devam edilecektir.
DİKKAT: Etidyum bromür güçlü bir mutajen olduğunu. Koruyucu dişliler, yani eldiven giyerek son derece dikkatli ele ve kurumun kurallarına göre belirli kaplara atın.
1,3) VDJ PCR
1.3.1) Çerçeve Bölgesinde 1 Amplify recombined IgH VDJ Segmenti (IgVHFR1)
- Tüp etiketi 45 ul ana karışımı karıştırıned ticari bir somatik IGH Hipermutasyon Deneyi Jel Tespiti için kitin "karışımı 2", Taq DNA polimeraz ul 0.25, ve bir PCR tüpü içinde 1.1.1.7 veya 1.1.2.5 hazırlanabilir 5 ul numune DNA kullanılabilir.
- DNA'yı büyütmek için aşağıdaki koşullar kullanın: 7 dakika boyunca 95 ° C; 95 ° C, 60 ° C 'de 45 saniye ve 72 ° C'de 90 saniye, 45 saniye 35 döngü, ardından; daha sonra 10 dakika boyunca 72 ° C ve 15 ° C 'de sabit.
- Elektroforez ile% 2 agaroz jeli içinde bütün PCR ürünü giderin.
- 0.5 ug / ml etidyum bromür solüsyonu ile agaroz jel leke ve bir jel görüntüleme sistemi ile PCR ürünleri algılar. Bir monoklonal amplikon 310-380 bp boyut aralığı ile tahmin edilmektedir.
- 310-380 bp arasındaki monoklonal amplikonu içeren jel bölümü tüketim.
- Üreticinin protokolüne göre, standart bir Gel Extraction Kit, çıkarılan jel DNA saflaştınlır. Not: FR1 fragmanları elde edilebilir örnekleri için, iGV bol miktarda olan gerek yokturHFR2 ve IgVHFR3.
1.3.2) Çerçeve Bölgesinde 2 Amplify recombined IgH VDJ Segmenti (IgVHFR2)
- PCR tüpü içinde 1.1.1.7 veya 1.1.2.5 hazırlanabilir jel Tespit kiti ticari bir IGH Gen Klonalite Testinin "Tüp B", Taq DNA polimeraz ul 0,25 ve 5 ul örnek DNA olarak adlandırılan tüp 45 ul ana karışımı karıştırın .
- DNA'yı büyütmek için aşağıdaki koşullar kullanın: 7 dakika boyunca 95 ° C; 95 ° C, 60 ° C 'de 45 saniye ve 72 ° C'de 90 saniye, 45 saniye 35 döngü, ardından; daha sonra 10 dakika boyunca 72 ° C ve 15 ° C 'de bırakın.
- Elektroforez ile% 2 agaroz jeli içinde bütün PCR ürünü giderin.
- 0,5 ug / ml etidyum bromür boyama PCR ürün (ler) görselleştirme. Bir monoklonal amplikon 250-295 bp büyüklüğünde bir aralık içinde görülebilir.
- 250-295 bp arasındaki monoklonal amplikonu içeren jel bölümü tüketim.
- Standart Jel Özü kullanılarak eksize jelden DNA arındırmaküreticinin protokolüne uygun iyon Kit.
1.4) Optimize VDJ PCR
- 7 dakika, 60 saniye, 60 saniye boyunca 60 ° C, 95 ° C 40 döngü, 90 saniye için 72 ° C sıcaklıkta son uzatma, 95 ° C: IgVHFR1 ve IgVHFR2 optimal DNA kullanılarak amplifiye etmek için, aşağıdaki tadil edilmiş PCR koşulları kullanarak 10 dakika boyunca 72 ° C.
2. VDJ Amplikon Kütüphane hazırlanması ve Sekanslanması
2,1) Kütüphane hazırlanması
2.1.1) End-onarım
- PCR tüp içine 1.3 VDJ PCR ürünü aktarın ve 60 ul hacim getirmek için DNA Numune Hazırlama Seti Tekrar Süspansiyonu Buffer ekleyin.
- DNA Numune Hazırlama Seti sonu Onarım Mix 40 ul ekleyin ve iyice karıştırın.
- 100 ° C'de önceden ısıtılmış bir kapak ile önceden ısıtılmış bir ısıl çevrim (30 ° C) 'de 30 dakika süre ile 30 ° C' de reaksiyon inkübe edin.
- 136 ul manyetik boncuk ve 24 ul PCR g MixRade Suyun ilk olarak 1.5 ml bir tüp içinde, daha sonra 1,5 ml tüp içine 2.1.1.3'de tamamını sonu tamir reaksiyonunu aktarmak ve boncuk çözeltisi ile iyice karıştırılır.
- 2 dakika için bir manyetik stand üzerine yerleştirin borular çözeltiden boncuk ayrılmasını sağlamak için. Süpernatantı aspire ve tüp manyetik standında açıkken iki kez% 80 taze hazırlanmış EtOH ile boncuk yıkayın.
- Tamamen etanol çözeltisi aspire ve 15 dakika için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca havada kurumaya boncuklar verir.
- 17.5 ul Tekrar Süspansiyonu Tampon manyetik standı ve tekrar süspansiyon boncuk kapalı tüp atın.
- Geri Tekrar Süspansiyonu Tampon ayrı boncuk 2 dakika süreyle manyetik stand üzerine yerleştirin tüpleri. Temiz bir PCR tüpüne Tekrar Süspansiyonu Buffer (Son onarım ürünü şimdi Tekrar Süspansiyonu tamponunda yeniden süspanse) çıkarın.
2.1.2) A-atık
- Son onarım ürünü ihtiva eden PCR tüpüne 12.5 ul A-atık karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. 100 ° C 'de bir ön-ısıtılmış kapak ile, bir önceden ısıtılmış bir ısıl çevrim (37 ° C)' de 30 dakika süre ile 37 ° C 'de, PCR tüpü inkübe edin.
2.1.3) Adaptör ligasyonu
- A-atık reaksiyona 2.5 ul Tekrar Süspansiyonu Buffer, 2.5 ul ligasyon Mix ve 2.5 ul DNA Adaptör Endeksi ekleyin.
- 100 ° C'de önceden ısıtılmış bir kapak ile önceden ısıtılmış bir ısıl çevrim (30 ° C) 'de 30 minl 30 ° C' de reaksiyon inkübe edin.
- Her reaksiyon içine 5 ul Dur ligasyon Buffer ekleyin ve iyice karıştırın.
- 2.1.1.5 2.1.1.8 adımları aşağıdaki reaksiyonu temizlemek için 42.5 ul iyi karıştırılmış manyetik boncuk karıştırın. 'Adaptörü bağlı ürünü elüte etmek için 50 ul Tekrar süspansiyona, Tamponu ekleyin.
- 50 ul iyi karıştırılmış AMPure XP boncuklar kullanılarak ikinci bir defa 'adaptörü bağlı ürün temizleme ve temiz bir PCR tüpüne 25 ul Tekrar süspansiyona, Tamponu içinde, ürünü yıkamak.
2.1.4) Genişletme DNA Fragments
- Adaptör bağlandı ürünü içeren PCR tüp 5 ul PCR Primer Kokteyl ve 25 ul PCR Master Mix ekleyin ve iyice karıştırın.
- Aşağıdaki koşullar ile önceden programlanmış bir PCR amplifikasyon yapın: 30 saniye için 98 ° C; 10 sn için 98 ° C 10 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 30 sn için 72 ° C; Daha sonra 5 dakika boyunca 72 ° C ve 10 ° C'de tutun.
- 50 ul iyi karıştırılmış manyetik boncuklar kullanarak tepkisini temizleyin ve 30 ul Tekrar Süspansiyonu Tampon nihai ürün Zehir.
2.1.5) Kütüphane Doğrulama
- Üreticinin protokolü kullanılarak bir florometre ile nihai ürünü ölçmek. Nihai kütüphanesi konsantrasyonu 2,5 ila 20 ng / ul arasındadır.
- Üreticinin protokolüne göre Yüksek Hassasiyet DNA çip ile bir analitik araç kullanılarak nihai ürünün kalitesini değerlendirmek. IGVHFR1, IGVHFR2 ya IGVHFR3 biri için umulan boyutta tek bir bant bekliyoruz. SanaKütüphane ürünün xpected boyutu orijinal VDJ amplikonun boyutunu artı adaptörleri (~ 125 bp) boyutunu eşittir.
2.2) VDJ-PCR Kütüphane havuzu ve Sıralama
- Aşağıdaki formül kullanılarak her bir kütüphane fraksiyonu molaritesini hesaplayın: nM = [(ng / 1000) / bp * 660] ng adımda 2.1.5.1 ölçülen VDJ-PCR kütüphane konsantrasyonu 10 9 x ve bp doruğudur VDJ-PCR kütüphanenin ebadı adım 2.1.5.2 kaydedilmiştir.
- DNaz içermeyen su ile 2 nM (10 ul toplam) kütüphaneyi seyreltin.
- Birlikte bir 1,5 ml tüp içine seyreltildi 2 nM kütüphanelerinin 10 ul birleştirin.
- 1,5 ml tüp içine phix başak kontrol eşit hacim.
- Bir akış hücresi üzerine 07:00 konsantrasyonda havuz yükleyin.
- Üreticinin protokolüne göre eşleştirilmiş uç 150 çevrim sequencer kullanarak kütüphaneleri sırası.
3. Veri Analizi
Not: SummBu bölümde kullanılan biyoinformatik Dizelerin li bir Ek kod dosyası olarak bulunabilir.
3.1) Uyum ve QC
- Harita paired-end dizileme, bir insan IGH V karşı okur 2 aralık açık cezası, 1 aralık uzatma cezası ile NCBI temin 'BLASTN' dayalı bir uyarlanmış nükleotid blast algoritmasını kullanarak IMGT web sitesinden 11 indirilen Ge ve J bölge veritabanı, 7 sözcük uzunluğu ve 10 -4 e-değeri eşik. Bir IGH V ve J bölge hem eşleşmiyor okuma-çifti atın.
- Tüm örnek üzerinde sıralama çalışmadan elde edilen çiftleri okumak karşısında VJ kombinasyonları eşleşen frekanslarını elde etmek için IGH V ve J eşlemeleri var kalan okuma-çiftleri sayın. Bir IGH V ve J geninin hem eşleştirilmiş ise salt çifti sayın ve sonra belirli VJ kombinasyonu gelen saymak onun alel ekleyin.
- Yüksekten 3.1.2 elde edilen her bir rekombine VDJ bölge için sayıları Ranken est. VDJ bölgesi en yüksek sayısı önemli bir yeniden düzenleme kombinasyonu olarak tanımlanır okur vardır.
- 3.1.3 tanımlanan etki büyük düzenlenmesi az% 35 kapsayacak hizalanmış dizileri atın.
3.2) SHM Profili Kimlik
- Adım 3.1.3 okur genelinde tüm SHM desenleri güvenin. Bir alt klon olarak her SHM desen tanımlayın.
- Farklı benzersiz SHM desenleri karşılık olan alt grupların sayısını ve bireysel altklonları eşlenen okur sayısını.
Sonuçların 3.3) Grafik Temsil
- Üreticinin protokolüne göre R paketi "maymun" dan yöntemini birleştiren bir mahalle kullanarak gelen SHM kalıplarını kullanarak altklonları üzerinde filogenetik analizi yapın. V tohum çizgisi dizisine köklü altklonüs soyoluşu yeniden bireysel farklı hizalamaları bir mesafe matrisi hesaplayınHer paired sample seti için söz konusu J kombinasyonu.
- Karakter vektör olarak, her alt klonun nükleotit sıklığı kullanımı ve iki eşleştirmede arasındaki mesafe d, x, y ile verilir matematiksel tanı ve Levenshtein mesafe ölçüsünü kullanılarak ilgili nüks numuneler için önemli bir yeniden düzenleme VJ tüm alt-klonları arasındaki yaklaşık dize mesafenin hesaplanması (i, j) d x, y (i, j) = 1 i j ≠ 0, aksi takdirde, ardından dizileri i ve j nükleotid karşılık gelen dize uzunluğu boyunca bu işlevi toplamı ise nerede.
- Grafiksel aşağıdaki iki yolla altklonüs mesafeler ve bunlara karşılık gelen altklonüs sayıları çıkan matris görüntüler:
- R paketi kullanın "MASS" üreticinin protokolüne göre altklonüs mesafe matris boyutlu ölçekleme uygulamak ve iki boyutlu bir ilke oluşturmak için daha sonra logaritma ile birlikte çizilmiştir harita, koordinatlardairenin yarıçapı olarak subclonal sayar.
- Köşeleri büyük VJ düzenlenmesi kaynaklanan her farklı alt klon karşılık Levenshtein mesafe dayalı bir yönsüz grafik oluşturun.
Not: Bir, daha sonra bu iki köşe arasındaki bir kenar bulunduğunu iki ayrı klonlar arasındaki mesafe eşit ise. Uzaktan bir daha büyük ise, daha sonra bunları bağlayan herhangi bir kenarı vardır. - Üreticinin protokolüne uygun olarak Kamada Kawai düzeni "iGRAPH" R paketinde tkplot fonksiyonunu kullanarak 3.3.3.2 grafiği çizilir. Köşe yarıçapı kendisine eşlenen klonların toplam sayısının küp kökü ile orantılıdır ve gölgeleme ya Tanı (mavi) veya nüks (kırmızı) örneklere ait klonların oranını belirtmek için kırmızı ve mavi aralığını kullanır .
3.4) Heterojenite (Entropi) Ölçüm
- Numaralarını ve altklonüs sayıları inceleyinHer biri için en önemli VJ düzenlenmesi meydana gelen somatik hipermutasyon bireysel desenler numunelerin set eşleştirilmiş.
- Standart histogram tabanlı entropi tahmin kullanarak her numunedeki farklı klonların sayısı için ayarlanmış ampirik entropi ve artık ampirik entropi hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA izolasyonu da dahil olmak üzere VDJ sekanslama (VDJ seq), genel prosedür, işleme ve filogenetik analizi okur VDJ bölgesi amplifikasyon ve saflaştırma, sıralama belge konstrüksiyon rekombine, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Rutin 5-200 ug DNA alınabilir dondurulmuş katı doku bölümleri veya formalin ile fikse parafine gömülü doku bölümleri 0,5-20 mg DNA. Kalite, yeniden düzenleme desen, ve tek tek numunelerin SHM derecesine bağlı olarak, farklı örneklerden VDJ PCR ürünlerinin çeşitli elde edilebilir (Şekil 2), IGVHFR1 (310-380 bp), FR2 (250-295 bp) ve da dahil olmak üzere FR3 (70-120 bp). Sadece FR3 fragmanı VDJ PCR'den elde edilebilir örnekler nedeniyle alt veri analizi amacıyla sekans bilgilerinin yeterli miktarda sağlamaz, kısa bir ürün geri kalan çalışma dışında tutuldu. Büyük FR1 veya FR2 PCR ürünü th görsel edilebileceği Sadece örneklerie agaroz jel dizileme kütüphaneleri oluşturmak için işlenir. Jel saflaştırma işleminden sonra ana PCR ürününün verimi, 10, toplam 50 ng arasında değişir.
Bütün saflaştırılmış PCR ürünü, sekanslama kitaplığı için daha sonra bir kütüphane yapımı için kullanılmıştır. Adaptör Ligasyondan sonra, her bir numune kendine özgü bir dizin elde edilir. Kütüphane amplifikasyon sırasında PCR 10 çevrim nihai kütüphane ürünler olarak daha çok 30 ng verim hangi yapıldı. Kütüphane kalitesi Bioanalyzer tarafından erişilen. Şekil 3'te gösterildiği gibi, ~ 125 bp kadar bir boyutu kayması kütüphane numunesi bir tek ürün adaptörün ilave gösteren orjinal VDJ PCR amplikonu ürünün oluşturulması bulunmaktadır. Her dizileme çalıştırmak için, 5-10 kütüphaneler 7 uM birlikte havuzlandı. Buna ek olarak, VDJ PCR ürünlerinin arasındaki yüksek dizi benzerliğine, kütüphane havuzu% 50 phix ile karıştırılmıştır sivri Giriş çalıştırmak ve tabanın doğru tanımlama karmaşıklığı sağlamakHer dizileme çevriminden sonra, ek. Kütüphane DNA fragmanları FR1 parçaları için VD ve DJ kavşaklar kapsayan dizi bilgilerinin yeterli miktarda alımı izin veren iki ucunda 150 bp için sıralı ve filogenetik analiz için SHM mutasyon desenleri bulundu.
Daha önce, 12 yukarıda açıklanan durumun kullanılarak (birkaç hastada birden fazla numune teşhis veya nüks aşamada ya da toplanan) 14 hastadan tanı ve nüks toplanan 32 DLBCL numuneler üzerinde VDJ sıralama yapılır. Eşleştirilmiş numuneler, bir "Erken farklı" ve DLBCL relaps ile ilişkili klonal evrim "-Geç farklı" modu arasında büyük VH DJ H düzenlenmeleri SHM profillerinin filogenetik analizi yaparak 12 tespit edilmiştir. Burada aynı yaklaşım yeni toplanmış DLBCL tanı ve nüks çifti uygulandı. FR1 bölgeleri P sonrası her iki örneklerde elde edilmiştirCR amplifikasyon. (Bioanalyzer ile ölçülen) 344 bp civarında boyutu ile önemli bir PCR ürünü, tanı ve nüks numuneler elde edilmiştir. (0.38- dizileme sonra, 0.70 milyon eşleştirilmiş-ucunun bir tanısında numune için elde edilmiştir okuması ve 0.730.000 eşleştirilmiş uç önceki çalışmada numune başına elde edilen okuma sayısına arasında değişmektedir nüks örnek için okuma 0.75 ± 0260000 ortalama 1.420.000) 12. Haritalama paired-end IMGT veritabanı karşı okuduktan sonra, her üç V hit yok okur, D ve J bölgelerinin atıldı. VH DJ H düzenlemesi her paired-end okuma atandı. 0640000 ve 0670000 VH DJ H kavşaklar toplam% 90 daha hizalama oranı temsil sırasıyla tanı ve nüks örneklerinde tespit edilmiştir. Kaç kez sayarak VH DJ H her kombinasyonu bireysel örnekler bulundu, 808 ayrı VH </ sub> DJ H kavşaklar tanı numune ve nüks numunesinde 581 ayrı VH DJ H kavşaklarda bulundu. Her iki numune baskın VH DJ H birleşim da klonal ilişkili olduğunu kanıtlar IGHV4-34 * 2 IGHD5-5 * 01 * 01 IGHJ2 olup. Bu baskın VH DJ H kavşak eşlenen VH DJ H kavşak tanı numune ve nüks numune hem okur bütünün% 97 olarak gerçekleşmiştir.
Bu DBBHL nüks durumunda klonal evrim izlemek için, tanı ve nüks örneklerinin bu çifti arasında büyük VH DJ H düzenlenmeleri SHM profillerinin filogenetik analizi yapıldı. Biz bu çiftin klonal evrim desen, "Geç farklı" yol (Şekil 4) Aşağıdaki olduğunu gözlenen filogenetik ağacın aynı dalında araya kümelenmiş tanı ve nüks tümörleri ve baskın gelen altklonlarıTanı altklonüs ve birkaç ek mutasyonlar ile benzer SHM desen paylaşılan baskın nüks altklonları nüks alt klon oluştu. Bu sonuçlar, potansiyel ya kemo-dirençli ya da tedavi kaçtı ve sonra sonunda nüks tümör haline tanı tümörün bir altklonüs olduğunu göstermektedir.
Daha fazla karakterize ve nüks sürecinde her örnekler ve klonal evrim desen klonal mimarisini görselleştirmek için, iki yeni analiz geliştirilmiştir. Bu analizlerde, her bir numune önemli VJ yeniden düzenleme alt-klon tüm seti SHM kendi kalıpları ile tanımlanan tüm altklonları arasındaki ikili dize mesafeyi hesaplamak için kullanıldı. Daha sonra çok-boyutlu bir ölçekleme (Şekil 5A, 5B) ile veya veri analizi de tarif edildiği gibi, bir yönsüz grafiği (Şekil 5C, 5D) oluşturarak, alt-klon dağılımını heterojen temsil araziler oluşturulmuştur. AsŞekil 4 'de gösterilen, MDS arsa erken farklı durumlarda (Şekil 5B) göre daha geç farklı durumlarda (Şekil 5A) önemli alt-klonları arasındaki çok daha az sekans çeşitliliği gösterir. Ayrıca, erken farklı durumda tan numunenin alt klonu ve nüks numunenin alt klonu aynı VDJ yeniden düzenlenmesi taşıyan olsa da bu tümörler arasında SHM desen benzerlik eksikliği gösteren, birbirinden tamamen ayrı . Benzer şekilde, (Şekil 5C) (Şekil 5D) 'de yönsüz grafikleri Geç farklı durumda (Şekil 5C) içinde alt klon sayısı dağılımı, erken ıraksak (Şekil 5D) farklıdır göstermektedir. İkinci teşhis nüks daha belirgin ama genetik çeşitlilik önemli klonlar vardır. Buna ek olarak, büyük tanı ve nüks klonlar arasında kenarları eksikliği ve küçük altklonları bağlantılarıErken farklı bir durumda (Şekil 5D), erken ıraksak nüks durumunda dizisi çeşitliliği doğasını göstermek.
Şekil 1:.. VDJ seq yaklaşımın adım akış şeması adım VDJ sıralama genel prosedür gösterilen bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: VDJ PCR amplikonu ürünleri Örnek görüntüler. Temsilcisine IgVH-FR1 (sol panel) ve IgVH-FR2 (sağ panel) lenfoma hasta numunelerinin elde DNA'dan PCR ürünleri gösteren jel ve görüntüler. Bir PCR ürünü, muhtemelen ya düşüğe Örnek 5'de elde edilememiştirPCR reaksiyonu engelli primer sitelerinde örnek DNA kalitesi veya SHM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Bioanalyzer tarafından VDJ PCR Amplikon ve sonraki sıralama kütüphanenin QC Temsilcisi Bioanalyzer kütüphane inşaatı (üst panel) önce ve kütüphane yapımı (alt panel) sonra aynı VDJ amplikonun izler. Adaptörün eklenmesini gösteren 459 bp 334 bp den boyut kayması unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: DBBHL tanı ve nüks örneklerinin bir çift ile klonal evrim analizi. "Geç farklı" klonal evrim modunu gösteren bir tanı nüks DLBCL örnek çiftinin Filogenetik analizi. Renk Şeritler mutasyon durumunu temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Yeni grafiksel yöntemler klonal evrim modellerini görselleştirmek için (A, B) gösteren SHM profilleri ve örnek çifti bir geç farklı nüks modu (A) gösteren ve örnek çifti B altklonüs sayılarını entegre boyutlu ölçekleme araziler erken farklı nüks modu. (B). Çevrelerin yarıçapı subcl saymak gösterirBelirli bir SHM profiline karşılık gelen olanlar ve teşhis (mavi) numune veya nüks (kırmızı) örneğe karşılık gelen renkler. X ve Y eksenleri MDA üst 2 bileşenlerini temsil etmektedir. (C, D) numune çifti bir erken farklı nüks modu (D) gösteren Geç farklı nüks modu (C) ve numune çifti B gösteren yönsüz grafikleri. Kenarları bir harf ayrımı dize mesafesi olan iki SHM profillerine uygun ve gölgeleme tanı (kırmızı) örnek veya nüks tekabül belirli bir SHM profiline dizileri haritalama oranını gösteren (renk ölçek çubuğu) mezun (sarı) örnek. Tıklayınız Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çünkü insan B hücrelerinin IGH loküsündeki VDJ düzenlenmesi ve SHM tarafından kodlanmış dizi bilgi iterasyon neredeyse sınırsız sayıda, yüksek hacimli derin dizileme ile tüm IGH repertuarının inceleme klonal çizmek için etkin ve kapsamlı bir yol olduğunu kanıtladı ve alt klonal B hücre popülasyonları. Bundan başka, bu strateji hastalığın çeşitli evrelerinde boyunca alınmış hasta örneklerinin klonal ve alt klonal mimarileri karşılaştırarak B hücre tümör gelişiminin remisyon ve nüksetme klonal evrimi yolu incelemek için kullanılabilir. Birincil numune DNA yeniden düzenlenmiş VDJ dizilerinin amplifikasyonu kolayca ticari olarak temin edilebilen primerler kullanılarak laboratuar ortamında gerçekleştirilir, ancak amplifikasyon verimi örnek DNA kalitesi büyük ölçüde bağlıdır. Özellikle, FFPE örnekleri elde edilen DNA, düşük büyütme etkinlik göstermiştir ve çoğu zaman sadece küçük FR3 fragmanı başarı ile amplifiye edilebilirNumuneler, bir sonraki analiz için uygun olmayacak hale getirmeyecek. Burada açıklanan çalışmamız, bir ya da birkaç büyük klonlar tümörün tamamını hakim olan bir klonal hastalıktır B hücreli lenfoma, bir klonalite anlamak için tasarlanmış bu yana, biz sadece toplanan ve büyük VDJ-PCR ürününü dizisi. Örneğin, tüm B hücresi klonal popülasyonu kataloglama ilgilenen çalışmalar, periferal kan, birden çok VDJ-PCR ürünleri (çoklu bantlar ya da jel üzerinde yayma) içeren jel daha büyük bir kısmı kesilip çıkarılmış ve sekanslanabilir. Ancak, belli SHM nerede primerler hedefe meydana gelen ve bu VDJs amplifikasyonu bozabilir çünkü tüm yeniden düzenlenmiş IGH repertuarı yakalamak mümkün olmadığını işaret etmek önemlidir. Ayrıca, son zamanlarda, ticari bir deney ile doğrudan bağlanması IGH yeniden düzenleme amplifikasyonu ve dizileme MiSeq tanıtılmıştır. Bu testte örnek hazırlama süreci kolaylaştırır. Ancak, değil beri her tümör örnekleri cins mümkün olacaktırFR1 fragmanı te, biz hala sıralama için numune havuzu önce PCR reaksiyonunun ürünü kontrol etmek için jel elektroforezi aşamasını kapsamaktadır öneririz.
1) 300 bp dizi, FR1 ve FR2, tüm fragmanının çoğunluğunu kapsayan VDJ yeniden düzenleme belirlenmesi için yeterli dizi bilgisi sağlama ve edebilir: VDJ fragmanının (300 bp sekans bilgilerinin toplam) her iki ucunda dizilenmesi 150 bp'lik aşağıdaki avantajlara sahiptir somatik hiper-mutasyonlar; 2) Platform 48 saat altında VDJ-sıralama tamamı 300 döngüleri tamamlar hızlı sıralama dönüş süresine sağlar; 3) Her bir çalışma, 12 numuneyi çoklama kadar izin verir ve yine yaklaşık bir milyon paired-end örnek çıktı başına okur ulaşır. Özellikle B hücreli lenfoma örnekleri aynı VDJ yeniden düzenlenmesini taşıyan klonlar arasındaki yüksek dizi benzerliğine, bu spike-in% 20-50 phix dizileme çalışması sırasında izin vermek için çok önemlidir çünkü doğru bir matris arama baz tanımlar. Son zamanlarda, MiSeqYazılım bu soruyu ele almak için güncelleştirildi. Düşük karmaşıklık kütüphane sıralama için az 5% phix başak-in kullanılması tavsiye edilir. Ancak, bizim sıralama tesisi düşük karmaşıklık sıralama sonucunu taviz verecek üretici tarafından sağlanan phix başak-kontrol DNA tutarsız konsantrasyonu yaşadı. Bu nedenle, mevcut uygulamada, biz hala VDJ sıralama için% 10-20 phix başak-kullanmak. Normal olarak farklı VDJ düzenlemelerin çok sayıda içeren tüm çevresel kan B hücre repertuarından, sekanslanması için, phix başak-in miktarının azaltılması mümkündür. Her numunenin belirlenen klonlar ve alt grupların sayısı olumlu eşleştirilmiş sonu bir milyon örnek başına okur sıralı okur sayısı, yarım ile ilişkili olmasına rağmen farklı toplanan numuneler arasındaki klonal evrim modellerini örnekler arasında klonal yapılarını karşılaştırmak ve anlamak için yeterlidir Aynı hastanın 12 hastalık aşamaları. Bumümkün PE 150 bp dizileme bu uzun FR1 fragmanları (yani 350-380 bp) yeterli kapsama ulaşmak olmayabilir. Bazı durumlarda, D segmentinde dizisi bilgilerin toplanması olabilir veya SHMS tarafından altklonların ayırt etmek için V segmentinde yeterli sırası bilgilerinin olmayabilir. Ancak, sıralama teknolojileri peşin ile, daha uzun sırası ve tüm FR1 Amplikon'u kapsayacak şekilde mümkün hale gelmiştir.
B-hücrelerinin IGH repertuarı sıralanması yoluyla bireysel B hücre klonlarının genişleme izlemek ve nüks tanıdan boyunca klonal evrim anlaması mümkün oldu. SHM desenleri tarafından oluşturulan alt grupların nüfusları üzerinde analiz kullanımı ile, onların filogenezlerini inceleyerek nüks kanser ilerleme iki mod ayırt başardık. Daha Levenshtein mesafeye göre çok boyutlu ölçekleme araziler ve adressiz grafikler kullanarak en son grafik gösterimleri allotr) her tümörün subclonal bileşim 1 anlamak için, w 2) birbirinden, ve 3 ile ilgili ne kadar tek tek alt-klonlar), her alt klon hastalığın ilerlemesi sırasında ortaya çıkan kadar. Ayrıca, istatistiksel analiz bu filogenetik yapılar açıkça farklıdır ve subclonal nüfusları kendi heterojenite getirmedi olarak farklı olduğunu olduğunu gösterdi. Son olarak, VDJ-dizisi ile elde edilen klonal evrim yörüngesi, genetik evrimi ile ilişkili ve her iki exome ile karakterize edilmiş veya yeniden dizileme 12 hedeflenebilir. Bu nedenle, bu iki yaklaşımın birleştirilmesi lenfomagenezde lenfoma nüksetme sırasında sürücünün mutasyonlan tanımlamak için bir potansiyele sahiptir
Lenfoma ilerlemesi klonal B hücre gelişimini IGH repertuarı tanımlama ve izleme ek olarak, VDJ seq bir yaklaşım, potansiyel olarak, çok az artık madde hastalığı izleme tedavilerin tümör yanıtı izlemek, ve potansiyel olarak varlığını belirlemek için son derece hassas bir yöntem olarak kullanılabilirilaca dirençli klonların. Benzer bir uygulama, T hücresi reseptörü repertuarı harita T hücrelerine uygulanabilir ve kanser bağışıklık yanıtını gözetim araştırmak için kullanılabilir. Ayrıca, VDJ seq de Hanna ve diğ temin edilebilen primerler kullanılarak fare modellerinde gerçekleştirilebilir. 13 Bu önümüzdeki birkaç yılda bu yaklaşımla toplanan bilgi tümör gelişiminin dinamiklerini daha iyi anlaşılması neden olarak olabilir öngörülebilir Bağışıklık sisteminin bilgimizi ve tümör işgali vücudumuzu savunmak onun rolleri genişletin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
| 50x TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C.
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
- Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
- Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
- Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
- Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
- Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
- Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
- Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
