Abstract
Clonalidad tumor comprensión es fundamental para la comprensión de los mecanismos implicados en la tumorigénesis y la progresión de la enfermedad. Además, la comprensión de los cambios en la composición clonal que se producen dentro de un tumor en respuesta a ciertos micro-entorno o tratamientos puede conducir al diseño de los enfoques más sofisticados y eficaces para erradicar las células tumorales. Sin embargo, el seguimiento de tumores clonales subpoblaciones ha sido difícil debido a la falta de marcadores distinguibles. Para abordar este problema, un protocolo VDJ-ss fue creado para rastrear los patrones de evolución clonal de linfoma de células grandes B (DLBCL) recaída difusa mediante la explotación de recombinación VDJ e hipermutación somática (SHM), dos características únicas de los linfomas de células B.
En este protocolo, la secuenciación de próxima generación (NGS) bibliotecas con potencial de indexación se construyeron a partir de la cadena pesada de inmunoglobulina amplificado reordenado (CIB) región VDJ de pares de diagnóstico primario y la recaída samp DLBCLles. En promedio se obtuvieron más de medio millón de secuencias VDJ por muestra después de la secuenciación, que contienen tanto VDJ reordenamiento e información SHM. Además, se desarrollaron tuberías bioinformática personalizadas para utilizar plenamente la información de secuencia para la caracterización de CIB-VDJ repertorio dentro de estas muestras. Además, la tubería permite la reconstrucción y la comparación de la arquitectura clonal de los tumores individuales, lo que permite el examen de la heterogeneidad clonal dentro de los tumores de diagnóstico y deducción de los patrones de evolución clonal entre diagnóstico y pares de recaída del tumor. Al aplicar este análisis a varios pares diagnóstico de recaída, descubrimos evidencia clave de que múltiples patrones evolutivos tumorales distintivo podrían llevar a DLBCL recaída. Además, este enfoque se puede ampliar a otros aspectos clínicos, como la identificación de la enfermedad residual mínima, seguimiento de los avances recaída y la respuesta al tratamiento y la investigación de repertorio inmunológicoes en contextos no-Hodgkin.
Introduction
El cáncer es una enfermedad clonal. Desde hace treinta años, cuando Peter C. Nowell propuso el modelo de evolución clonal del cáncer 1, muchos estudios han tratado de diseccionar poblaciones clonales dentro de las muestras tumorales y reconstruir los patrones de expansión y evolución clonal que subyacen en el proceso de tumorigénesis 2. Recientemente, la secuenciación del genoma ha permitido a los investigadores a tener una mirada profunda a la heterogeneidad clonal y evolución 3,4. Sin embargo, debido a la falta de marcadores tratables en muchos tipos de células, es difícil para inferir la arquitectura clonal precisa y la ruta evolutiva. Afortunadamente hay un marcador clonalidad natural en células B maduras de las que muchas neoplasias linfoides, incluyendo DLBCL, originan. En respuesta a la estimulación antigénica, cada una de las células B puede formar una sola productiva secuencia IgH VDJ uniéndose a un V H (variable), un D (diversidad) y J H (unión) segmento juntos desde un gran número de estos segmentos. Durante este proceso, pequeñas porciones de la secuencia original pueden ser borrados y los nucleótidos no moldeados adicionales pueden añadirse para crear un reordenamiento VDJ único. Este reordenamiento VDJ específico puede ser heredado en toda la progenie de esta célula B, por lo tanto, el etiquetado de las células B individuo maduro y su descendencia 5. Además, SHM se produce en las secuencias VDJ recombinados en la reacción subsiguiente del centro germinal (GC) para introducir mutaciones adicionales para la expansión de la piscina de anticuerpos y la mejora de la afinidad de anticuerpos 6. Por lo tanto, comparando y contrastando los patrones de muestras de linfoma que se han sometido a estos procesos VDJ y SHM, la heterogeneidad intra-tumor podría ser delineado y ruta de evolución clonal de la enfermedad puede ser deducida.
Anteriormente, VDJ reordenamiento y SHM podrían ser identificados por PCR amplificando las regiones recombinados, la clonación de los productos de PCR, y posteriormente secuenciación de Sanger para obtener información de la secuencia. Este enfoque is de bajo rendimiento y bajo rendimiento, la recuperación de sólo una muy pequeña parte de todo el repertorio VDJ recombinado, y dificultando la caracterización de la representación general de la población clonal dentro de una muestra dada. Un enfoque modificado fue creado mediante la generación de bibliotecas de secuenciación NGS indexadas a partir de productos de PCR VDJ y la realización de PE secuenciación pb 2x150 para obtener más de medio millón de secuencias VDJ recombinados por muestra. Además, una canalización personalizada fue desarrollado para llevar a cabo control de calidad (QC), alinear, secuenciación VDJ filtro lee para identificar reordenamientos y SHMS de cada lectura, y llevar a cabo el análisis filogenético en la arquitectura clonal de cada muestra. Además, un nuevo enfoque ha sido establecido para caracterizar adicionalmente los patrones de evolución clonal para las muestras recogidas en diferentes etapas de la enfermedad.
Hemos aplicado esta técnica para las muestras de pacientes con DLBCL. DLBCL es una forma agresiva de linfoma no Hodgkin con recaídas frecuentes en hasta un ªIRD de los pacientes 7. Recaídas DLBCL normalmente ocurren temprano, en un plazo de 2 a 3 años del diagnóstico inicial, aunque algunos no se dan después de 5 años 8. El pronóstico para los pacientes con recidiva es pobre, con sólo el 10% el logro de 3 años la supervivencia libre de progresión, debido a las opciones de tratamiento limitadas. Esta es la base de la urgente necesidad de nuevos enfoques para el tratamiento de la recaída DLBCL 9,10. Sin embargo, los mecanismos moleculares asociados con DLBCL recaídas siguen siendo en gran parte desconocido. En particular, el papel de la heterogeneidad clonal el momento del diagnóstico y la evolución clonal durante el desarrollo de recaídas DLBCL son actualmente no caracterizado, por lo que es difícil definir un biomarcador precisa y útil para predecir la recaída. Para abordar estas cuestiones, hemos aplicado nuestro enfoque VDJ-secuenciación de múltiples pares de diagnóstico de recaída primaria pares de muestras DLBCL emparejados. Dos escenarios de evolución clonales distintas de recaída surgieron de la comparación de las arquitecturas clonales entre el diagnóstico y samp recaídales sugiere que múltiples mecanismos moleculares puede estar implicada en DLBCL recaída.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. VDJ amplificación
1.1) La extracción de ADN a partir de muestras de tumores
- Extraer el ADN de las secciones delgadas (10 a 20 micras) de OCT tejidos normales o malignas incrustados congelados.
- Digerir 10-30 secciones delgadas de tejido embebido cortada por un micrótomo criostato en 4 ml de tampón de lisis nucleico (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2; NaCl 0,3 M; 0,002 M Na 2 EDTA) con proteinasa K (0,5 mg / ml, concentración final ) y 0,625% SDS en un tubo de centrífuga de 15 ml en un baño de 37 ° C el agua durante la noche.
- Añadir 1 ml de NaCl saturado (5 M) a la mezcla de digestión y agitar vigorosamente durante 15 s.
- Centrifugar a 1100 xg durante 15 min a temperatura ambiente.
- Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml y añadir dos volúmenes de etanol al 100%.
- Mezclar invirtiendo el tubo 6-8 veces. Centrifugar a 5000 xg durante 60 min a 4 ° C para recoger el ADN precipitado.
- Lavar el sedimento de ADN dos veces con etanol 70%. Centrifuge a 5000 xg durante 15 min cada vez para recoger el sedimento.
- Disolver el ADN en tampón TE de 100-400 l a temperatura ambiente en un agitador durante toda la noche. El rendimiento de ADN es de 5 a 200 g (concentración final de 50-500 entre ng / l), dependiendo del tamaño del tejido
- Extraer el ADN de las secciones delgadas (10-20 M) de, incorporado (FFPE) tejido normal o maligno en parafina fijado con formalina.
- Incubar las secciones de parafina en 1 ml de xileno dos veces a temperatura ambiente durante 10 min cada vez en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para de-paraffinize. Recoger las secciones de tejido haciendo girar a 13.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Incubar las secciones en etanol al 1% dos veces 100 ml a temperatura ambiente, 10 minutos cada vez para eliminar residuos xilenos. Recoger las secciones de tejido haciendo girar a 13.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. La parafina se disuelve completamente en este punto y sólo la sección de tejido restante.
- Seque las secciones en sala de temperatura durante 10-15 min.
- Hacer una solución 0,5 mg / ml de proteinasa K con tampón de PCR 1X (diluido a partir de 10x tampón de PCR con agua libre de nucleasa). Añadir la solución de proteinasa K a las muestras en un volumen final de de 50-100 l e incubar durante la noche a 37 ° C.
- Calentar las muestras a 95 ° C durante 10 min para inactivar la proteinasa K.
Nota: En este paso, se disuelve ADN de la muestra en el tampón de PCR y se puede utilizar en los pasos 1.2 y 1.3 directamente. El rendimiento de ADN es de 0,5 a 20 g (concentración final de 10-200 entre ng / l) en función del tamaño del tejido.
1.2) Evaluación de la Calidad de ADN
- Mezclar 0,25 l de ADN polimerasa Taq con 45 l de mezcla maestra del kit escalera comercial en un tubo de PCR.
- Añadir 5 l de ADN preparado a partir 1.1.1.7 o 1.1.2.5 en el tubo de PCR y mezcle bien pipeteando arriba y abajo durante al menos 5 veces.
- Utilice las siguientes condiciones para amplificar el ADN: 95 ° C durante7 min; seguido por 35 ciclos de 45 segundos a 95 ° C, 45 segundos a 60 ° C y 90 segundos a 72 ° C; luego 72 ° C durante 10 minutos y mantenga a 15 ° C.
- Preparar un gel de agarosa al 2% en TBE (Tris / borato / EDTA).
- Mezclar 20 l de reacción de PCR con 4 l de colorante de carga 6x, y cargar en un gel de agarosa al 2%.
- Tinción del gel de agarosa con 0,5 mg ml de bromuro de etidio solución / y detectar productos de PCR con un sistema de imaginación gel. Nota: las muestras que producen productos de PCR en 5 tamaños de 100, 200, 300, 400, y 600 pb se continuará para generar amplicones VDJ.
PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un mutágeno potente. Por favor, manejar con extrema precaución con el uso de equipo de protección, es decir, guantes, y disponer en contenedores específicos según las pautas de la institución.
1.3) VDJ PCR
1.3.1) Amplify recombinado IgH VDJ Segmento de marco Región 1 (IgVHFR1)
- Mezclar mezcla maestra 45 l de la etiqueta del tuboed como "Mix 2" de una somática Hipermutación Ensayo IGH para la detección del gel kit comercial, 0,25 l de ADN polimerasa Taq, y el ADN de la muestra 5 l preparado a partir 1.1.1.7 o 1.1.2.5 en un tubo de PCR.
- Utilice las siguientes condiciones para amplificar el ADN: 95 ° C durante 7 minutos; seguido por 35 ciclos de 45 segundos a 95 ° C, 45 segundos a 60 ° C y 90 segundos a 72 ° C; luego 72 ° C durante 10 minutos y mantenga a 15 ° C.
- Resolver la totalidad del producto de la PCR en un gel de agarosa al 2% por electroforesis.
- Tinción del gel de agarosa con 0,5 mg ml de bromuro de etidio solución / y detectar productos de PCR con un sistema de imágenes de gel. Un amplicón monoclonal se espera que con el rango de tamaño de 310 a 380 pb.
- Extirpar la porción de gel que contiene el amplicón monoclonal entre 310 hasta 380 pb.
- Se purifica el ADN a partir de gel escindido utilizando un kit de extracción en gel estándar de acuerdo con el protocolo del fabricante. Nota: para muestras que los fragmentos FR1 pudieron obtenerse, no hay necesidad de ampliamente IgVHFR2 y IgVHFR3.
1.3.2) Amplify recombinado IgH VDJ Segmento de marco Región 2 (IgVHFR2)
- Mezclar mezcla maestra 45 l del tubo etiquetado como "Tube B" de un Clonalidad Ensayo IGH gen comercial para el kit de detección de Gel, 0,25 l de ADN polimerasa Taq, y el ADN de la muestra 5 l preparado a partir 1.1.1.7 o 1.1.2.5 en un tubo de PCR .
- Utilice las siguientes condiciones para amplificar el ADN: 95 ° C durante 7 minutos; seguido por 35 ciclos de 45 segundos a 95 ° C, 45 segundos a 60 ° C y 90 segundos a 72 ° C; luego 72 ° C durante 10 minutos y dejar a 15 ° C.
- Resolver la totalidad del producto de la PCR en un gel de agarosa al 2% por electroforesis.
- Visualice producto de PCR (s) en 0,5 g / ml de bromuro de etidio tinción. Un amplicón monoclonal se puede observar dentro de la gama de 250 a 295 pb de tamaño.
- Extirpar la porción de gel que contiene el amplicón monoclonal entre 250-295 pb.
- Se purifica el ADN a partir de gel escindido usando un extracto estándar de Gelion Kit según el protocolo del fabricante.
1.4) Optimizar VDJ PCR
- Utilice las siguientes condiciones de PCR modificados para amplificar IgVHFR1 y IgVHFR2 utilizando ADN subóptima: 95 ° C por 7 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 60 segundos, 60ºC durante 60 segundos y 72 ° C durante 90 segundos, extensión final a 72 ° C durante 10 min.
2. VDJ Amplicon Biblioteca Preparación y secuenciación
2.1) Preparación Biblioteca
2.1.1) Fin de reparación
- Traslado VDJ producto de PCR de 1,3 en un tubo de PCR y añadir tampón de resuspensión de ADN Preparación de muestras Kit para llevar el volumen hasta 60 l.
- Añadir 40 l de reparación Final Mix de Kit de Preparación de ADN de la muestra y mezclar bien.
- Incubar la reacción a 30 ° C durante 30 min en un termociclador precalentado (30 ° C) con una tapa pre-calentado a 100 ° C.
- Mezclar 136 l perlas magnéticas y 24 g l PCRagua Rade primero en un tubo de 1,5 ml, a continuación, transferir toda la reacción End-reparación de 2.1.1.3 en el tubo de 1,5 ml y mezclar bien con la solución de perlas.
- Colocar los tubos en un soporte magnético durante 2 minutos para permitir la separación de las perlas de la solución. Aspirar el sobrenadante y lavar las perlas con 80% fresca preparada EtOH dos veces mientras el tubo está en el soporte magnético.
- Aspirar la solución de etanol por completo y permitir que las perlas se sequen al aire durante 15 min a temperatura ambiente durante 15 min.
- Tome el tubo fuera de la base y volver a suspender las perlas magnéticas en 17,5 l tampón de resuspensión.
- Colocar los tubos de nuevo en el soporte magnético durante 2 minutos para cuentas separadas de la resuspensión de búfer. Retire la resuspensión Buffer (producto final de reparación se vuelve a suspender en el tampón de resuspensión ahora) en un tubo de PCR limpio.
2.1.2) A-tizón
- Añadir 12,5 l mezcla A-tizón en el tubo de PCR que contiene el producto final de reparación y mezclar bien. Incubar el tubo de PCR a 37 ° C durante 30 min en un termociclador precalentado (37 ° C) con una tapa pre-calentado a 100 ° C.
2.1.3) Adaptador Ligadura
- Añadir 2,5 l tampón de resuspensión, 2,5 l Ligadura Mix, y 2,5 l Índice adaptador de ADN en la reacción A-tizón.
- Incubar la reacción a 30 ° C durante 30 minl en un termociclador precalentado (30 ° C) con una tapa pre-calentado a 100 ° C.
- Añadir 5 l Detener Ligadura de búfer en cada reacción y mezclar bien.
- Mezclar 42,5 perlas magnéticas l bien mezclados para limpiar la reacción siguiendo los pasos 2.1.1.5 a 2.1.1.8. Añadir 50 l tampón de resuspensión para eluir el producto ligado al adaptador.
- Limpiar el producto ligado al adaptador para un segundo tiempo mediante el uso de 50 l bien mezclados perlas AMPure XP, y eluir el producto en 25 l tampón de resuspensión en un tubo de PCR limpio.
2.1.4) Los fragmentos de ADN Amplify
- Añadir 5 l PCR Primer Cóctel y 25 l PCR Master Mix al tubo de PCR que contiene el producto ligado al adaptador y mezclar bien.
- Realizar la amplificación en un termociclador pre-programado con las siguientes condiciones: 98 ° C durante 30 s; 10 ciclos de 98 ° C durante 10 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos; luego 72 ° C durante 5 minutos y mantenga a 10 ° C.
- Limpiar la reacción mediante el uso de perlas magnéticas 50 l bien mezclados, y eluir el producto final en 30 l tampón de resuspensión.
2.1.5) Biblioteca de Validación
- Cuantificar el producto final con un fluorómetro utilizando el protocolo del fabricante. Concentración biblioteca final está entre 2.5 a 20 ng / l.
- Evaluar la calidad del producto final mediante el uso de un instrumento analítico con el chip de ADN de alta sensibilidad de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuente con una sola banda con el tamaño esperado para cualquiera IGVHFR1, IGVHFR2 o IGVHFR3. Texpected tamaño del producto biblioteca es igual al tamaño del amplicón VDJ original más el tamaño de los adaptadores (~ 125 pb).
2.2) VDJ-PCR Biblioteca Pooling y secuenciación
- Calcular la molaridad de cada fracción biblioteca utilizando la siguiente fórmula: nM = [(ng / 1.000) / BP * 660] x 10 9 donde ng es la concentración de la biblioteca VDJ-PCR medida en la etapa 2.1.5.1 y BP es el pico tamaño de la biblioteca VDJ-PCR medida en la etapa 2.1.5.2.
- Diluir la biblioteca para 2 nM (10 l en total) con agua libre de DNasa.
- Combinar los 10 l de las bibliotecas diluidas 2 nM juntos en un tubo de 1,5 ml.
- Añadir un volumen igual de control de espiga-en PhiX en el tubo de 1,5 ml.
- Cargue la piscina en la concentración de 19:00 en una celda de flujo.
- Secuenciar las bibliotecas utilizando un secuenciador de ciclo de gama emparejado 150 según el protocolo del fabricante.
Análisis 3. Datos
Nota: Un summario de los guiones bioinformáticos utilizados en esta sección se puede encontrar como un Código Archivo suplementario.
3.1) Alineación y control de calidad
- Mapa secuenciación de extremo emparejado lee contra un IGH humana V, D y J de base de datos región descargado desde el sitio web de IMGT 11 utilizando un algoritmo explosión de nucleótidos adaptada basada en 'blastn' disponible de NCBI con brecha pena de abierto de 2, penalización de extensión de 1, longitud de palabra de 7, y el umbral de e-valor de 10 -4. Deseche el par leer no asignar a la vez un IGH V y una región J.
- Cuente los restantes pares de leer que tienen IGH V y J asignaciones para obtener las frecuencias de juego combinaciones VJ en todos leen pares obtenidos de la ejecución de secuenciación en la muestra. Cuente un par de lectura si se asigna a la vez un IGH V y J gen, y luego añadir su alelo a la cuenta correspondiente a la combinación VJ particular.
- Clasifique los recuentos para cada región VDJ recombinado obtenido a partir de 3.1.2 de la altaest al más bajo. La región VDJ tiene el más alto recuento de lecturas se define como importante combinación reordenamiento.
- Deseche secuencias alineadas que cubren menos del 35% de la importante reorganización de dominio identificado en 3.1.3.
3.2) SHM Perfil de Identificación
- Cuente todos los patrones SHM través de las lecturas de la etapa 3.1.3. Definir cada patrón SHM como un subclon.
- Cuente el número de los subclones que se corresponden a diferentes patrones únicos SHM, y el número de lecturas que se asigna a subclones individuales.
3.3) La representación gráfica de los resultados
- Lleve a cabo el análisis filogenético de los subclones utilizando sus correspondientes patrones SHM utilizando un barrio método de unión del paquete R "mono", de acuerdo con el protocolo del fabricante. Calcula una matriz de distancia de las alineaciones distintas individuales para recrear la filogenia subclone arraigada a la secuencia de la línea germinal del VJ combinación en cuestión para cada conjunto de muestras pareadas.
- Utilice la secuencia de nucleótidos de cada subclon como vector de caracteres y calcular la distancia cadena aproximada entre todos los subclones en los principales reordenamiento VJ tanto para el diagnóstico y las muestras de recaída correspondientes utilizando una medida de distancia Levenshtein donde matemáticamente la distancia entre dos alineaciones está dada por d x, y (i, j), donde d x, y (i, j) = 1 si i ≠ j y 0 de otro modo, y luego esta función resumen sobre la longitud de la cadena correspondiente a secuencias de nucleótidos i y j.
- Gráficamente mostrar la matriz resultante de las distancias subclone y su población en subclone correspondientes en las siguientes dos maneras:
- Utilice el paquete R "MASA", de acuerdo con el protocolo del fabricante para aplicar escalamiento multidimensional a la matriz de distancia subclone y generar un principio de dos dimensiones coordenadas mapa, que luego se traza junto con el logaritmode los recuentos de subclonales como el radio del círculo.
- Construir un grafo no dirigido basado en la distancia Levenshtein, donde los vértices corresponden a cada subclon distinta que surge de la gran reordenamiento VJ.
Nota: Si la distancia entre dos clones distintos es igual a uno entonces existe un borde entre estos dos vértices. Si la distancia es mayor que uno, entonces no hay ningún borde de conexión ellos. - Trazar la gráfica de 3.3.3.2 utilizando la función tkplot en el paquete R "IGRAPH" con la disposición Kamada Kawai según el protocolo del fabricante. El radio de los vértices es proporcional a la raíz al cubo del número total de clones mapeadas a la misma y el sombreado utiliza una gama de color rojo y azul para indicar la proporción de clones que o bien pertenecen al diagnóstico (azul) o recaída (rojo) muestras .
3.4) La heterogeneidad (entropía) Medición
- Examine los números y cuenta subclone delpatrones individuales de hipermutación somática que ocurren en el reordenamiento VJ importante para cada una adscrita conjunto de muestras.
- Calcular la entropía y la entropía empírica empírica residual ajustado por el número de clones distintos en cada muestra utilizando la estimación entropía basado en histograma estándar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El procedimiento general de secuenciación VDJ (VDJ-SEC), incluyendo la extracción de ADN, recombina VDJ región de amplificación y purificación, la construcción de bibliotecas de secuenciación, se lee en el procesamiento y el análisis filogenético, está representado en la Figura 1. Rutinariamente de 5-200 g de ADN puede ser recuperada a partir de secciones de tejido sólido congelado o 0,5 a 20 g de ADN a partir de secciones de tejidos embebidos en parafina fijado en formol. Dependiendo de la calidad, patrón de reordenación, y SHM grado de muestras individuales, una variedad de productos de PCR VDJ de diferentes muestras podría obtenerse (Figura 2), incluyendo IGVHFR1 (310 a 380 bp), FR2 (250-295 pb), y FR3 (de 70-120 pb). Las muestras fueron excluidos de la que sólo fragmento FR3 puede obtenerse a partir de VDJ PCR a partir del estudio restante debido a la corta producto que no proporciona suficiente cantidad de información de secuencia para aguas abajo propósito análisis de datos. Sólo las muestras de las cuales un importante producto FR1 o FR2 PCR puede ser visualizado en el the en gel de agarosa se procesan para generar bibliotecas de secuenciación. El rendimiento del producto principal de PCR después de la purificación en gel varía de 10 a 50 ng en total.
El producto de PCR purificado entera se utilizó para la construcción de la biblioteca para la biblioteca posterior secuenciación. Después de la ligación del adaptador, cada muestra obtiene su propio índice único. Durante la amplificación de la biblioteca, se realizaron 10 ciclos de PCR que podría producir más de 30 ng de la biblioteca como productos finales. La calidad de la biblioteca se accede por un Bioanalyzer. Como se muestra en la Figura 3, hay un solo producto en la muestra de biblioteca con un cambio de tamaño de ~ 125 pb formar el producto amplicón de PCR original de VDJ que indica el adicional de adaptador. Para cada ejecución secuenciación, 5-10 bibliotecas se agruparon en 7 M. Además, debido a la alta similitud de secuencia entre los productos de PCR VDJ, la piscina de la biblioteca se mezcló con 50% PhiX espiga-en para asegurar la complejidad de la carrera y la identificación correcta de la base deadicional después de cada ciclo de secuenciación. Fragmentos de ADN de biblioteca fueron secuenciados para 150 pb en ambos extremos, lo que permite la recuperación de la cantidad suficiente de información de la secuencia que abarca VD y DJ uniones de los fragmentos FR1, y patrones de mutación SHM para el análisis filogenético.
Previamente, se realizó secuenciación VDJ en 32 muestras DLBCL recogidos en el diagnóstico y la recaída de 14 pacientes (varios pacientes habían múltiples muestras recogidas en cada etapa de diagnóstico o recaída) usando las condiciones descritas anteriormente 12. Al realizar el análisis filogenético de los perfiles SHM de las grandes reordenamientos V H DJ H entre los pares de muestras, un "Early-divergente" y un modo de "Late divergentes" de la evolución clonal asociado con DLBCL recaída fueron identificados 12. En este documento, el mismo enfoque se aplicó a un diagnóstico DLBCL recién recogido y par recaída. Las regiones FR1 se obtuvieron en ambas muestras después de PAmplificación CR. Un producto principal de PCR con el tamaño de alrededor de 344 pb (medido por Bioanalyzer) se obtuvo a partir tanto el diagnóstico y las muestras de recaída. Después de la secuenciación, se lee se obtuvo un total de 0,70 millones de extremo emparejado para la muestra de diagnóstico y 0.73 millones de extremo emparejado lee para la muestra de la recaída, que estaban dentro de la gama del número de lecturas por muestra obtenida en el estudio anterior (0.38- 1.420.000, promedio 0.75 ± 0.26 millones) 12. Después de mapeo de gama emparejado lee contra la base de datos IMGT, dice que no tiene hits en las tres V, se descartaron las regiones D y J. Arreglo de V H DJ H se asigna a cada lectura final emparejado. Se identificaron un total de 0,64 millones y 0,67 millones de V H uniones DJ H en las muestras de diagnóstico y recaída, respectivamente, lo que representa la tasa de alineación superior al 90%. Al contar el número de veces que se encontró cada combinación de V H DJ H en las muestras individuales, 808 distinta V H </ sub> uniones DJ H se encontraron en la muestra de diagnóstico y 581 distintas uniones V H DJ H en la muestra recaída. La unión dominante V H DJ H tanto en la muestra es IGHV4-34 * 2 * 01 IGHJ2 IGHD5-5 * 01, confirmando que son clonal relacionada. Esta unión V H DJ H dominante representó el 97% de la totalidad de mapeado de unión V H DJ H lee tanto en la muestra de diagnóstico y la muestra recaída.
Para seguir la evolución clonal de este caso recaída DLBCL, se realizó un análisis filogenético de los perfiles SHM de las grandes reordenamientos V H DJ H entre este par de muestras de diagnóstico y recaída. Hemos observado que el patrón de evolución clonal de esta pareja estaba siguiendo el camino "-Late divergentes" (Figura 4), que los subclones de los tumores de diagnóstico y recaída agrupados juntos en la misma rama del árbol filogenético, y la dominantesubclón diagnóstico y los subclones de recaída dominantes compartidos SHM patrón similar con unas pocas mutaciones adicionales se produjeron en el subclon recaída. Estos resultados sugieren que potencialmente hubo un subclon en el tumor diagnóstico que era o quimio-resistentes o se escapó del tratamiento, y luego, eventualmente desarrolló en el tumor recaída.
Para caracterizar adicionalmente y visualizar la arquitectura clonal de cada uno de las muestras y los patrones de evolución clonal durante el proceso de recaída, se han desarrollado dos nuevos análisis. En estos análisis, se utilizaron todo el conjunto de subclones del importante reordenamiento VJ en cada muestra para calcular la distancia de cadena por parejas entre todos los subclones definidos por sus patrones de SHM. A continuación, mediante el uso de escalamiento multidimensional (Figura 5A, 5B) o mediante la construcción de un grafo no dirigido (Figura 5C, 5D) como se describe en análisis de datos, se crearon parcelas que representan la distribución y la heterogeneidad de subclones. Comoilustrado en la Figura 4, la trama MDS exhibe mucho menos la diversidad de secuencia entre las principales subclones en los casos divergentes finales (Figura 5A) que en los primeros casos divergentes (Figura 5B). Además, los sub-clones de la muestra de diagnóstico y los sub-clones de la muestra de la recaída en el caso divergente principios de separar completamente entre sí, lo que indica la falta de similitud de los patrones de SHM entre estos tumores a pesar de que tienen el mismo reordenamiento VDJ . Del mismo modo, los gráficos no dirigidos en la (Figura 5C) y (Figura 5D) muestran que la distribución de recuentos subclone en el caso divergente tarde (Figura 5C) difiere de la temprana divergente (Figura 5D). Este último tiene más prominentes pero genéticamente diversas principales clones desde el diagnóstico hasta la recaída. Además, las conexiones de la falta de bordes y subclones más pequeños entre los principales clones de diagnóstico y recaída en eltemprana caso divergente (Figura 5D), demostrar la naturaleza secuencia de la diversidad de los primeros casos de recaídas divergente.
Figura 1:.. Paso a paso diagrama de flujo del enfoque VDJ siguientes se muestra el procedimiento general de secuenciación VDJ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de los productos de amplificación de PCR VDJ. Gel imágenes que muestran el representante IgVH-FR1 (panel izquierdo) y IgVH-FR2 (panel derecho) productos de PCR a partir de ADN extraído de muestras de pacientes de linfoma. Un producto de PCR no se pudo obtener en la Muestra 5, probablemente, ya sea debido a la bajala calidad del ADN de la muestra o SHM en sitios de cebadores que deterioraban la reacción de PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. QC de amplicón VDJ PCR y secuenciación biblioteca posterior de bioanalizador Representante Bioanalyzer traza del mismo amplicón VDJ antes de la construcción de la biblioteca (panel superior) y después de la construcción de la biblioteca (panel inferior). Tenga en cuenta el cambio de tamaño de 334 pb a 459 pb indica la adición del adaptador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: > Análisis de la evolución clonal de un par de muestras de diagnóstico y recaída DLBCL. El análisis filogenético de un DLBCL par de muestras de diagnóstico de recaídas que muestra el modo de evolución clonal "-Late divergentes". Los teletipos de color representan el estado de la mutación. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Nuevos métodos gráficos para visualizar los patrones de evolución clonal (A, B) parcelas de escalamiento multidimensional integrando perfiles SHM y cuenta subclone de par muestra A que muestra el modo de recaída-divergente tardía (A) y el par de la muestra B que muestra el modo de recaída temprana-divergente. (B). El radio de los círculos indican el recuento de subcllos correspondientes a un perfil particular SHM y colores correspondientes al diagnóstico (azul) de la muestra o la recaída (rojo) de la muestra. Los X e Y-ejes representan las 2 mejores componentes de la MDA. (C, D) grafos no dirigidos de par muestra A que muestra el modo divergente recaída tardía (C) y el par de la muestra B que muestra el modo de recaída temprana-divergente (D). Los bordes corresponden a dos perfiles SHM que tienen una distancia de cadena de una sola separación letra y el sombreado se graduaron (barra de escala de colores) que indica la proporción de asignación de secuencias a un perfil SHM particular, correspondiente al diagnóstico (rojo) de la muestra o la recaída (amarillo) de la muestra. Por favor, haga clic en aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Debido al número casi ilimitado de iteraciones de información de la secuencia codificada por VDJ reordenamiento y SHM en el locus IGH de células B humanas, el examen de todo el repertorio IGH por alto rendimiento en alta secuenciación demostró ser una forma eficaz y completa para delinear clonal y las poblaciones de células B sub-clónicas. Además, esta estrategia se puede utilizar para estudiar la ruta de evolución clonal de desarrollo de células B tumor, remisión y recaída mediante la comparación de las arquitecturas clonales y sub-clonales de muestras de pacientes recogidos a lo largo de diversas etapas de la enfermedad. Aunque la amplificación de secuencias VDJ reordenados a partir de ADN de la muestra primaria se lleva a cabo fácilmente en un entorno de laboratorio utilizando cebadores disponibles comercialmente, la eficiencia de la amplificación depende en gran medida de la calidad del ADN de la muestra. En particular, el ADN extraído de muestras de FFPE muestra una baja eficiencia de amplificación, y con frecuencia sólo el fragmento pequeño FR3 se puede amplificar con éxito de estosmuestras, que los hace inadecuados para el análisis posterior. Dado que nuestro estudio descrito en este documento fue diseñado para comprender la clonalidad de linfoma de células B, que es una enfermedad clonal con uno o varios clones principales que domina todo el tumor, sólo recogieron y secuenciado el producto principal VDJ-PCR. Para los estudios interesados en la catalogación de toda la célula B población clonal de, por ejemplo, sangre periférica, una porción más grande del gel que contiene varios productos VDJ-PCR (múltiples bandas o una mancha en el gel) puede ser extirpado y se secuenció. Sin embargo, es importante señalar que no es posible capturar todo el repertorio IGH reordenados porque cierta SHM puede ocurrir en donde objetivo cebadores y deteriorar la amplificación de estos VDJS. Por otra parte, se ha introducido recientemente, un ensayo comercial acoplar directamente la amplificación y secuenciación reordenamiento de IGH MiSeq. Este ensayo agiliza proceso de preparación de la muestra. Sin embargo, ya que no todos muestras de tumores serían capaces de génerosTA El fragmento FR1, todavía recomendamos que incluye la etapa de electroforesis en gel para verificar el producto de la reacción de PCR antes de la puesta en común muestras para la secuenciación.
Secuenciación 150 pb de ambos extremos del fragmento VDJ (un total de 300 pb información de la secuencia) tiene las siguientes ventajas: 1) 300 secuenciación pb puede cubrir la mayoría de la FR1 y todo el fragmento FR2, proporcionando un amplio información de la secuencia para la identificación de VDJ reordenamiento y hiper-mutaciones somáticas; 2) La plataforma ofrece la secuenciación rápida tiempo de vuelta que se completa la totalidad de los 300 ciclos de VDJ-secuenciación bajo 48 h; 3) Cada ejecución permite la multiplexación de hasta 12 muestras y todavía alcanza alrededor de un millón de extremo emparejado lee por salida de la muestra. Debido a la gran similitud de secuencia entre clones que llevan la misma reordenamiento VDJ, especialmente en muestras de linfoma de células B, es crítico espiga-en 20-50% PhiX durante la ejecución de secuenciación para permitir definir con precisión la base llamando matriz. Recientemente, el MiSeqsoftware ha sido actualizado para abordar esta cuestión. Se recomienda el uso de tan sólo un 5% PhiX pico-in para bajo secuenciación biblioteca complejidad. Sin embargo, nuestra planta de secuenciación ha experimentado concentración incoherente del ADN de control espiga-en PhiX proporcionado por el fabricante que pueda comprometer el resultado de baja secuenciación complejidad. Por lo tanto, en la práctica actual, que todavía utilizan 10-20% PhiX pico-in para la secuenciación VDJ. Para la secuenciación de todo el repertorio de células B de sangre periférica, que normalmente contiene un gran número de diferentes arreglos VDJ, es posible reducir la cantidad de PhiX espiga-en. Aunque el número de clones y subclones identificadas de cada muestra se correlaciona positivamente con el número de lecturas secuenciado, un medio y un millón de gama emparejado lecturas por muestra es suficiente para comparar las estructuras clonales entre muestras y deducir patrones de evolución clonal entre las muestras recolectadas en diferentes etapas de la enfermedad del mismo paciente 12. esposible que la EP 150 secuenciación pb podría no lograr una cobertura suficiente de esos fragmentos FR1 largos (es decir, 350-380 pb). En algunos casos, la información de secuencia del segmento D no puede ser recogida o podría no ser suficiente información de la secuencia en el segmento V para diferenciar subclones por SHMS. Sin embargo, con el avance de las tecnologías de secuenciación, se ha vuelto posible secuencia más larga y cubrir todo el amplicón FR1.
A través de la secuenciación del repertorio IGH de las células B que era posible realizar un seguimiento de la expansión de clones de células B individuales e inferir la evolución clonal en el transcurso del diagnóstico a la recaída. Con el uso de análisis sobre las poblaciones de subclones generados por los patrones de SHM, hemos sido capaces de diferenciar dos modos de la progresión del cáncer a la recaída al examinar sus filogenias. Las últimas representaciones gráficas que utilizan parcelas de escalamiento multidimensional y grafos no dirigidos en base a la distancia Levenshtein más allow que entendamos 1) la composición subclonales de cada tumor, 2) cómo subclones individuales se relacionan entre sí, y 3) cómo cada subclon evoluciona durante la progresión de la enfermedad. Por otra parte, el análisis estadístico mostró que estas estructuras filogenéticos fueron claramente diferentes y que las poblaciones subclonales diferían en lo que respecta a su heterogeneidad. Por último, la trayectoria evolución clonal obtenido por VDJ-secuenciación puede estar bien correlacionada con la evolución genética y se caracteriza por cualquiera exoma o resecuenciación 12 dirigido. Por lo tanto, la combinación de estos dos enfoques tiene el potencial de identificar mutaciones del conductor durante lymphomagenesis y linfoma recaída
Además de la definición de la IGH célula B repertorio y trazar la evolución clonal de la progresión del linfoma, el enfoque VDJ-Seq puede utilizarse potencialmente como un método altamente sensible para el seguimiento de enfermedad mínima residuo, monitorización de la respuesta del tumor a las terapias, y potencialmente identificar la presenciade clones resistentes a los fármacos. Un enfoque similar se puede aplicar también a las células T para mapear repertorio de receptores de células T, y puede ser utilizada para explorar la respuesta vigilancia inmune al cáncer. Por otra parte, VDJ-Seq también se puede realizar en modelos murinos utilizando cebadores disponibles de Hanna et al. 13 Es previsible que la información recopilada a través de este enfoque en los próximos años puede resultar en una mejor comprensión de la dinámica del desarrollo del tumor, así como ampliar nuestro conocimiento del sistema inmune y su papel en la defensa de nuestro cuerpo de la invasión tumoral.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
| 50x TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C.
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
- Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
- Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
- Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
- Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
- Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
- Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
- Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
