Introduction
Миграция клеток высоко скоординированных и жизненно важное значение для многих физиологических процессах, таких как развитие тканей, ремонта и регенерации, а также патологических процессов, таких как метастазирование рака и атеросклероза 1. Понимание миграции клеток, в частности, отношение к возникающим лечения, используемых для восстановления поврежденных тканей и лечения патологических состояний, в том числе клеточной трансплантации и искусственных технологий ткани прививки 2. Учитывая текущую заинтересованность в роли мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в опосредовании тканей ремонт 3, количественной миграционную способность этих клеток с помощью анализа, который строго количественно, адаптации, и экономически эффективным представляет интерес. Важно отметить, что подобный анализ должен быть достаточно чувствительным, чтобы обнаружить относительно небольшие изменения в клеточной миграции емкости после повреждения. Современные методы количественной оценки миграции клеток, в том числе скретч-анализы, анализы миграции транс-а (Бойден чянтарь), micropillar массивы, и анализы клеточной зоны отчуждения обладают ряд ограничений в воспроизводимости, возможности настройки, количественного и экономической эффективности 1,4,5. Оптимизированная царапины анализа, описанного здесь демонстрирует устойчивые результаты, поддающиеся количественной оценке и на основе образа возможности анализа, рентабельность и адаптируемость к другим приложениям.
Царапины анализы были использованы в нескольких емкостей для оценки миграции клеток и пролиферации при различных экспериментальных условиях 5. Анализ влечет за собой посева назначенных клетки, растет их полное или почти полное слияние, и царапин полученной монослой стерильной иглой или кончиком пипетки 6. Анализ наиболее часто выполняется путем сравнения ширины царапины над различные моменты времени в случайно выбранных местах 7-9. Несмотря на видном использования, царапины Анализ посрамлены проблем с воспроизводимостью и количественного определения. Изменчивостьпоколение нуля не только изменяет микроокружение клеток, но также может препятствовать миграции клеток, повреждая поверхности пластины и основной внеклеточный матрикс-5. Анализы часто проводились в течение 7 до 12 часов, однако для клеточных линий отображаются медленнее и дольше миграции раз анализ, распространение становится сбивающий переменной 7,10. Наконец, стареющие клетки, созданные в процессе царапин может выпустить факторы, которые мешают внеклеточной сигнализации требуется, чтобы закрыть разрыв в монослое 1. Оптимизация царапинам анализа требует создания постоянной щели, чтобы не мешать с поверхностными свойствами, минимизируя длительность анализа и предупреждения нежелательной клеточной гибели во время манипуляции. Пробка на основе анализа является оптимизация зоны анализа клеток исключения. Этот анализ используют пробку помещают в середине скважины, что исключает рост клеток, но позволяет клеткам быть покрыты вокруг центральной зоны отчуждения.Для оценки миграции, стопор снимается, и полученный в результате зона отчуждения обеспечивает поверхность для миграции происходит. Тем не менее, этот анализ сложно настроить или адаптировать 10 и для некоторых приложений, этот метод также может быть сопряжено с запретом.
В отличие от нуля анализов и их производных, миграции и транс-анализов (или Бойдена камеры анализов) оценки миграции путем количественного определения количества клеток, которые перемещаются из одной камеры, через микропористой мембраны фильтра, в камеру, содержащую хемотаксические агентов 8,11, 12. Эта техника имеет ограниченную полезность по адгезивных клеток, таких как МСК, так как следующие миграции через пористую мембрану, клетки прилипать к стороне мембраны воздействию хемотаксиса агентов, и может быть трудно точно измерить. В то время как анализ способен исследовать некоторые трехмерные модели миграции, ограниченные типы клеток, для которых она способна точно определить их миграции клеток ограничивают ее полезность 10, Еще одной альтернативой нуля анализов использует массив микро-столб, который измеряет сотовой моторику через трехмерном пространстве с помощью способность клеток к деформации и мигрируют в массив в качестве суррогата. Polydimethlysiloxane (PDMS) эластомеры вылечить более точного форму и обрабатывают озоном и фибронектин производит однородную и неразлагаемую микросреду. Расстояние между микро-колонна также может изменяться по мере необходимости, чтобы оценить способность клеток, чтобы войти в массив 4. Форма создается с помощью глубокой реактивного ионного травления кремниевых пластин для создания отрицательного версию высокого удлинения массива 13. В то время как анализ подкрепляется его настраиваемость, возможность моделировать трехмерную миграцию и анализ через прямой визуализации мигрирующих клеток, трудности в создании микро-столба массивы экономически препятствует его широкому использованию.
Оптимизированная царапины анализа, описанного в этом протоколе обеспечивает эффективное, созт эффективное Способ получения в соответствии царапины, которые могут быть проанализированы с использованием свободно доступного программного обеспечения. Вместо простых измерений ширины по всей нуля до и после миграции клеток, программное обеспечение позволяет пользователю определить общей площади царапины до и после миграции. Это продвижение ограничивает вопрос, пытаясь определить, где царапина ширина измерения должны быть приняты, и будет ли ширина царапины однородно вдоль его длины. Кроме того, тщательное оптимизацию количества клеток, клеток слияния и типа и степени ущерба, нанесенного клеток обсуждается в целях дальнейшей оптимизации анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Для данного исследования, легких мезенхимальных стромальных клеток (МСК LR-) дистальной от легочной ткани были выделены либо на основе их экспрессии поверхностных маркеров клеточной (CD45 нег, CD31 нег, SCA-1 высокой, EpCam нег) 14,15, используя эксплантов из-роста 16, или с помощью ферментативного расщепления 17. Адгезивная LR-МСК культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы и глутамина, не 15% FBS, 1x антибиотика / противогрибкового и 2 мМ глутамина (далее полное носителе) и инкубировали при 37 ° С, 5% СО 2. LR-МСК пассировали 3-4 раз, чтобы убедиться популяцию клеток с относительно однородными характеристиками роста для анализа миграции.
1. Подготовка сливающийся монослой,
- Для отсоединения МСК из стандартных 100 мм культуральные чашки, мыть клетки с 10 мл 37 ° C подогретого PBS, PBS аспирации и добавить 4 мл трипсина (0,25%). Выдержите 3-5 мин в 37 ° C инкубатора. Аспирируйте Cлоктей в конической трубе, добавить равный объем полной среды и центрифуге при 300 г в течение 5 мин, чтобы осадить вниз клетки.
Примечание: Более инкубации в трипсина может изменить рецепторы клеточной поверхности и, возможно, влияет на миграцию. - Аспирируйте СМИ и ресуспендирования клеток в свежей полной информации. Граф клеток, за исключением мертвых клеток с использованием трипанового синего и пластины 500000 мезенхимальных стромальных клеток в 4 мл полной среды на 60 мм чашки для культивирования клеток.
Примечание: В зависимости от источника клеток, тесты могут быть необходимы, чтобы определить оптимальное количество клеток, необходимых. - Инкубируйте клетки до тех пор, пока пластины на 90% сплошности для оптимального прикрепления и пролиферации клеток, как правило, 48-72 ч в течение МСК.
Примечание: 100% слияния не рекомендуется, так как многие крепления зависит от клеток опыт контактного торможения, которое может изменить их миграционную способность. Пластины с менее чем 80% слияния приведет непригодных фотографий, поскольку программное обеспечение анализа изображений будет интерпретировать разрывс между клетками, как части периметра листа (рис 1D). - После того, как клетки достигли слияния 90%, повреждения клеток в зависимости от конкретной программы. Для оценки повреждения клеток после воздействия экстракта растворимого сигаретного дыма (CSE), генерировать 100% CSE опираясь дым от 1 Университет Кентукки исследований сигареты (3R4F) через 25 мл полной среды в колбе Бюхнера в течение 2 мин 18.
- Инкубируйте клетки в течение 24 ч в 4 мл 1-4% CSE, разведенного в полной среде. После инкубации промыть клетки дважды 4 мл стерильной PBS теплой, перед заменой 4 мл свежей полной среды.
Примечание: повреждения клеток с высокой концентрацией экстракта сигаретного дыма (> 5%) может существенно снизить слияния.
2. Создание царапинам
- В стерильной среде, снимите крышку с 60 мм пластины поврежденных МСК, и заложить линейку (например, стерилизовать пластиковая линейка) переменногоРосс верхний край пластины. Без снятия средств массовой информации, использовать стерильную 200 мкл пипетки наконечник руководствуясь стерильной линейкой, чтобы сделать от одного до четырех параллельных царапин через пластины примерно 5 мм друг от друга и длиной 50 мм.
Примечание: прямой край минимизирует количество вращательных корректировки, необходимые для пластины, когда она находится на предметном столике микроскопа. Это важно, что царапины появляются совершенно вертикальной (или по горизонтали) на экране. Создание нескольких царапин на 60 мм пластины не изменяет микроокружение таким образом, что влияет на миграцию клеток (данные не показаны), но может быть рассмотрен в других типах клеток. Применение небольших скважин не рекомендуется, поскольку изменчивость клеток, растущих близко к краю колодца становится более выраженным и может повлиять на равномерное образование царапин. - Аспирируйте СМИ и аккуратно мыть тарелки с 2 мл подогретого полный СМИ по предотвращению клетки от присоединения к центру нуля, и удалить ячейкус, что были ослаблены в царапин. Заменить 4 мл свежей полной среды.
- С помощью стерильной постоянный маркер, пометить каждый царапина от 1-4 на нижней стороне пластины на месте, не будет мешать визуализации царапины.
Примечание: Очень важно, чтобы изображения с тем же нуля сравнивают перед и после миграции, поскольку может быть изменение ширины к царапинам.
3. Принимая исходных изображений царапины
Примечание: Если царапина анализ проводят на нескольких пластин, рекомендуется, чтобы начальные образы всех царапин на одной пластине принято до царапины сделаны на следующей пластины.
- Использование инвертированного фазово-контрастного микроскопа с камерой для формирования изображения, необходимые для анализа.
- Расположите культуры пластины на микроскоп, и использовать низкую цель питания (10X), чтобы найти царапинам # 1. Если конденсат на крышке культурального планшета препятствует четкое Imagе клеток, используют нагретый сценическое до 37 ° С.
- Ведение царапины полностью горизонтальное и в центре поля зрения, получить как можно больше изображений как необходимо, чтобы охватить 90% длины нуля в. Получение изображений различных участках нуля, без перекрытия между изображениями.
Примечание: преломление света на краях чашки для культивирования overexposes изображения, делая их невозможно анализировать. Поэтому, не принимать изображения с первым и последним 5% длины нуля в. - Сохранение изображений из каждого нуля в отдельной папке.
- Повторите этапы 3.2-3.4 царапин 2, 3, 4 и.
- Вернуться пластин в инкубаторе сразу после начальной визуализации. Пусть клетки мигрируют по 4-7 ч.
Примечание: 7 ч является оптимальным при оценке МСК поврежденные с ЕГЭ. Инкубации клеток в течение более 7 ч не рекомендуется, поскольку пролиферация клеток может выступать в качестве переменной для искажающего миграции клеток (смотри ниже Необязательное Примечание 8.2).
- Скачать ImageJ и установить плагин раны целебным средством (обратитесь к таблице материаловедения / Оборудование).
- Откройте файл изображения в ImageJ, то нажмите кнопку "Process" и "Find Edges" чтобы выделить клетки, окружающие царапины для заживления ран Инструмент для расчета рабочей области (рис 2B). Затем нажмите "Image", "Adjust", "Цвет Threshold" и в выпадающем меню с надписью "Порог цвета" измените значение на "B & W".
- В меню "Цвет Threshold" отрегулируйте яркость обоих пороговых ползунки, пока оптимальный контраст между царапинам и клеточной перед пока не будет достигнута. Для обеспечения наибольшей амплитудой, когда пытается создать контраст в изображении, переместите ползунок в нижней полностью вправо (полностью черный изображения), а затем настроить верхний ползунок, чтобы генерировать максимальную контрастность.
- Медленно отрегулировать верхнюю BRIghtness слайдер слева направо, пока изображение не отображается чисто контур нуля (рис 2С). После того, как края нуля были определены, нажмите кнопку "Дополнительные инструменты" в панели инструментов ImageJ, выберите "MRI_Wound_Healing_Tool" из выпадающего меню, и нажмите кнопку "M" (который будет отображаться в панели инструментов ImageJ), чтобы выделить царапинам область и вывода компьютерной площадь в результатах вывести окно (рис 2D).
- Скопируйте и вставьте все номера в окне результатов (рис 2E) в таблицу Excel. Убедитесь, чтобы отделить данные от отдельных царапин.
5. Принимая Заключительных изображений царапины
- После того как клетки мигрировали (4-7 ч), повторите шаги 3.2-3.4. Изображение пластины в том же порядке, они были почесал так, что клетки на каждой пластине были равное время для переноса.
Примечание: клетки могут быть отображены в нескольких точках времени, в зависимости от их Сенсиность к обеим изменений температуры и рН. В качестве альтернативы, изображений живых клеток может использоваться, чтобы следовать клеток в реальном времени, поскольку они мигрируют.
6. Анализируя Заключительных Скретч изображений
- Повторите шаги 4.2-4.5 для конечных нуля изображений.
7. Расчет рабочей области, которая Количественно миграции
- Вычислить среднюю площадь до миграции путем усреднения начальные значения области соответствующих царапин.
- Вычислить общую сумму миграции путем вычитания окончательную область переноса для каждого изображения, рассчитанного на шаге 6, от средней области до миграции (шаг 7,1). Создание списка значений для каждого нуля, представляющего изменение в миграции.
- Бассейн данные из нескольких царапин в той же тестовой группы (то есть все тарелки и все царапины на клетки подвергаются 0% CSE). Используйте анализ отклонений тест, чтобы проанализировать различия между экспериментальными группами.
- Если клетки медленно мигрируюти требуют более длительного времени инкубации после расчесывания (более 10-12 часов), выполнить BrdU или ОБР включение анализа 19, чтобы определить, является ли клетки претерпевают любой пролиферацию в течение периода, в котором анализа миграции происходит. Выберите миграции время анализа, чтобы избежать значительного пролиферацию клеток.
8. Необязательно
- Чтобы оценить, насколько значительное старение клеток происходит в результате процедуры царапин, выполнить старение-ассоциированных бета-галактозидазы анализ на испытательную пластину в заданные моменты времени после расчесывания 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Царапина анализы, представленные здесь, были выполнены с использованием мышиных резидентов легких мезенхимальных стромальных клеток (МСК LR-) и выделяют в виде ссылки в примечаниях протокола. LR-МСК высевали при плотности 500000 клеток в 60 мм чашки для культивирования тканей, и выращивали до слияния 90% в 48 ч. Для генерации повреждений, 4% CSE (описано выше) инкубировали с клетками в течение 24 ч после начального периода посева, но до нуля анализа. Для каждого теста, царапина был создан с помощью пипетки наконечник 200 мкл. Исходные изображения были приняты после царапины были собраны, и какие-либо свободная клетки и мусор были смыты с полным СМИ. Как показано на фиг.1А и В, соответствующее слияние важно обеспечить, что программное обеспечение визуализации может правильно определить границы нуля. Как показано на фиг 1С, клетки не являются достаточно сливной (либо из-за недостаточного плотности посева, недостаточно Incubation раз, или чрезмерное повреждение), что может привести к появлению царапин с гетерогенными границами, которые не легко отличить с помощью программного обеспечения визуализации (рис 1D). Рисунок 2 демонстрирует приобретение и анализа изображений. 2А изображает исходное изображение до анализа. Рисунок 2б результат "Find Edges" инструмент в меню "Process" (Шаг 4.2) и рис 2С показывает изображение после регулировки "Цвет Порог" ползунковый регулятор (этап 4.3). Рис 2D показывает анализируемый окончательное изображение после запуска MRI_Wound_Healing_Tool Плагин (Шаг 4.4). Рис 2E представлены результаты выпадающее окно, выделяя (красный коробка) числа, которые генерируются. Представитель пред- и пост-миграционные изображения показано на рисунке 3, с соответствующей границы рабочей области, как определено с помощью программного обеспечения визуализации. Рисунок 4 гraphically иллюстрирует измененную миграционную способность увидеть в LR-МСК после повреждения с 4% CSE. На рисунке 4А и В, средние рассчитываются скретч районах (в пикселях) для каждого из 4 царапин, сделанных через пластины LR-МСК на 95% слияния либо до или после миграции, с воздействием либо 0% CSE или 4% CSE сравниваются. Рисунок 4C сравнивает вычисленное среднее изменение рабочей области (пост-сфере миграции вычитается из предварительно сфере миграции) в LR-МСК, подвергающихся или 0%, или 4% CSE, демонстрируя меньше миграции (нижний изменение средневзвешенной в рабочей области ) после воздействия до 4% CSE.
Рисунок 1: Правильное слияние имеет решающее значение для генерации надежной воспроизводимой царапинам анализа. (А) Мышиные LR-МСК на 95% слияния, подходит для ЮКЖДПросмотр программы. (B) успешно царапины на 95% слияния. (С) LR-МСК при 70% слияния, слишком низким для успешного нуля. (D), приобретение изображения на 70% слияния может производить ложные границы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель изображения, демонстрирующие приобретение и анализа изображений (А) Исходное изображение.. (Б) Изображение после применения "Find Edges" инструмент в меню "Process" (этап 4.2). (С) Изображение после корректировки "Цвет Порог" ползунковый регулятор (этап 4.3). (D) Изображение после запуска плагина MRI_Wound_Healing_Tool (этап 4.4). (Е) RРЕЗУЛЬТАТЫ всплывающее окно подсветку (красный коробка) число, созданные для каждой области. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель изображения с нуля анализе сравнению почесал LR-МСК до и после миграции (A) представительство оригинал изображения до миграции.. (Б) План расчетной рабочей области до миграции. (С) представитель исходное изображение после миграции. (D), План рассчитан рабочей области после миграции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
<IMG Alt = "Рисунок 4" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 53414 / 53414fig4.jpg" />
Рисунок 4: Представительные результаты анализа царапинам по сравнению количественное рабочей области до и после LR-MSC миграции, и воздействия либо 0% или 4% CSE. (А) Графическое представление средней расчетной области царапинам (в пикселях) для каждого из 4 царапин, сделанных через пластины LR-МСК при 95% слияния либо до или после миграции, с воздействием 0% CSE, с данными, представленными в среднее значение и стандартное отклонение. (В) Графическое представление средней расчетной области царапинам (в пикселях) для каждого из 4 царапин, сделанных через пластины LR-МСК при 95% слияния либо до или после миграции, с воздействием на 4% CSE, с данными, представленными в среднее значение и стандартное отклонение. (С) Сравнение расчетных среднее изменение в рабочей области (после предварительной миграции) в LR-МСК подвергаются либо 0% или 4% CSE, демонстрируя менее миграции (среднее изменение в меньшую ЮКЖДATCH область) после воздействия до 4% CSE, с данными, представленными в виде среднего и стандартного отклонения, * Р = 2,99 х 10 -8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, обеспечивает надежную количественно, стандартизированный метод для выполнения и анализа скретч анализов. Простые скретч анализы, которые обычно используются во многих различных областях исследования для изучения клеточной миграции. Тем не менее, традиционно царапина анализ не хватало стандартизированный Установка и количественного протокол, который привел к проблемам с воспроизводимостью 7,10. Многие из модификаций и оптимизаций для улучшения царапинам анализа сократили эти вопросы, в том числе индивидуального изображений живых клеток, стандартизированных пробки на основе анализов и трехмерных микро-столб анализов 4,8,10. Тем не менее, эти анализы могут быть трудно настроить или адаптировать 10 и для некоторых применений, эти методы могут быть также недопустимое увеличение затрат.
Для получения стандартизированного протокола к царапинам анализа, есть несколько важных шагов в протоколе, представленные здесь, которые требуют конкретной информации о invol клетоквед, и оптимизация анализа на основе соответствующих клеточных характеристик. В частности, важно, чтобы оптимизировать количество клеток, необходимых и время в культуре необходимо для того, чтобы достичь равномерного монослоя при 90-100% слияния для анализа (Шаг 1.3 и Шаг 1.4). Слишком мало клеток (менее чем 90% сливной) клетки не образуют достаточное монослой. Не только это будет влиять на клеточный микросреду, но она также будет влиять на способность программного обеспечения визуализации правильно определить края нуля. В противоположность этому, слишком много клетки в монослое (100% сплошности, или сложены клетки) могут также привести к контактного ингибирования, и, следовательно, изменение характеристик мигрирующих клеток. Некоторые вариации протокола к царапинам анализа рекомендуем рост клеток до 100% слияния и не считают эту потенциальную ограничения для определенных контактных чувствительных клеток, таких как МСК 8. То же самое относится должна быть применена к степени повреждения, которая infliИДКТК на клетки (шаг 1.5). Протокол, описанный здесь, предназначен для оценки изменений в миграции клеток после повреждения воздействием растворимого сигаретного дыма на миграционных МСК мощности, но этот анализ может быть одинаково полезны в оценке влияния различных типов повреждений по миграции клеток. Важно, чтобы немощных повреждения является достаточным для обеспечения статистической различие между экспериментальной и контрольной групп. Тем не менее, слишком много повреждений может также привести к снижению слияния клеток, которые снова могут повлиять на способность программного обеспечения визуализации правильно определить края нуля.
Оба клеточное старение и клеточная пролиферация может быть искажающие факторы, которые могут ложно изменяют результаты анализа царапинам. В частности, генерация нуля следует внимательно рассмотреть, чтобы избежать чрезмерного повреждения окружающих клеток, которые могут привести к старению. Царапины с пластиковой пипетки, а не подкожной клетчаткиIC иглы или скальпель позволяет избежать избыточного повреждения, а также сохранение целостности поверхности пластины культуры в зоне миграции и внеклеточной матрицы (этап 2.1). Кроме того, длина времени, за который миграцию клеток разрешено происходят должны быть тщательно рассмотрены, чтобы избежать значительного пролиферацию клеток в искажающего переменной (этап 3,7). Для анализа LR-MSC миграции, 7 ч является оптимальным при оценке клетки поврежденных с ЕГЭ. Инкубации клеток в течение более чем 12 часов, как правило, не рекомендуется, однако это не может применяться ко всем типам клеток, особенно тех, с очень низким ставкам удвоения. Чтобы оценить как клеточное старение и клеточную пролиферацию, сочетание стареющих связаны бета-галактозидазы и BrdU или ОБР включения могут быть выполнены на клетках в конце анализа 19. Важно отметить, что протокол, описанный здесь доступна в лаборатории с ограниченным техническим потенциалом, требующих только хорошего качества перевернутой фазово-контрастного микроскопа и камеры.реагенты недороги, и ПО для обработки изображений с открытым исходным кодом. Тем не менее, для того, чтобы обеспечить оптимальные результаты этого анализа, в том числе хорошей воспроизводимостью и возможностью выполнения строгого статистического анализа, тщательной оптимизации должны быть рассмотрены для каждого нового типа клеток или экспериментальных сценария повреждения, которое баллов.
Оптимизация представлены в этому адресу протокола некоторые ограничения, присутствующих в предыдущей работе, проделанной по стандартизации скретч анализов. В то время как протоколы скретч анализа традиционно принимают измерения ширины царапины от снимка скретч 8,9, протокол, представленные здесь использует измерения площадей из снимков, сделанных по всей длине царапины увеличить статистическую строгость и принять во внимание несоответствия ширины начальная царапина. На основании повторного тестирования (данные не показаны), ширина царапины не может считать вполне соответствует всей длине. После миграции, края гое царапина стала более разнородной, что делает его все более и более трудно точно рассчитать ширину царапины, а дальше необходимость расчетов площадь. Этот протокол использует MRI_Wound_Healing_Tool, специализированной компьютерной программы, с тем чтобы уменьшить субъективность и повышения согласованности при анализе рабочей области. Пока что неизвестно, может ли простые расчеты ширина давать результаты недостаточно конкретные различать тонкие различия в миграции из-за предварительного CSE или других вредных, этот протокол демонстрирует эту чувствительность. Оптимизация, представленные в данном протоколе обновить общую царапинам анализа для устранения этих недостатков в экономически обоснованной образом, чтобы предложить варианты настройки, и обеспечить дополнительные приемы, чтобы продемонстрировать чувствительность и проверки результатов.
Оптимизированная количественный анализ царапины описано в данном протоколе по-прежнему ограничен с учетом клеточной популяции, а не отдельных клеток. Этот метод Assumэс, что популяция клеток является относительно однородным, и что это приведет к относительно однородными характеристиками миграции. В зависимости от применения, это может быть более уместно рассмотреть миграцию отдельных клеток, а не 8. Кроме того, протокол царапинам анализа, описанного здесь, зависит от популяции клеток, которые не будут размножаться достаточно быстро, чтобы смешивать анализ миграции в течение 4-7 ч. Клеточные линии, которые могут размножаться широко в течение этого короткого периода времени не будут пригодны для анализа с помощью этой методики. Несмотря на эти ограничения, этот количественный анализ протокола царапина есть потенциал для использования в различных приложениях. Например, анализ клеток повреждения основе может быть оптимизировано, а затем используется для оценки способности отдельных процедур, чтобы ограничить повреждение клеток. Кроме того, этот анализ может быть использован с клеточных линий рака для оценки потенциальных лечения, чтобы ограничить потенциал миграционную, и, следовательно, метастатический потенциал, оF этих клеток. Эта оптимизированная царапины анализ также по-прежнему ограничивается возможными нарушениями в клеточной микросреде, которые неизбежны в создании царапины. Тем не менее, путем тщательного отбора клеточном уровне слияния, увеличение апоптоза и образование листов клеток, которые частично разделенных на краю нуля можно избежать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healing plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
