伤口划痕试验的优化来探测在小鼠间充质干细胞迁移的可溶性香烟烟雾提取物受损后

该测定的总体目标是检测可溶性香烟烟雾提取物损伤后肺间充质基质细胞迁移能力的变化。该方法可用于回答肺再生生物学领域的关键问题，包括如何提高肺祖细胞的迁移能力以帮助肺修复。该技术的主要优点是它已经过优化，可为细胞迁移提供更好的定量测量，同时仍然保持经济性且易于定制。

在该演示中，划痕测定将用于量化小鼠肺间充质基质细胞或 MSC 的迁移能力。暴露于可溶性香烟烟雾提取物后，MSC 在 60 毫米平板上的完全培养基中生长并按照方案文本中的描述受损。适当的汇合对于划痕测定很重要，因为它可以确保成像软件能够正确识别划痕的边界。

本例显示了 95% 汇合度的 MSC，适合在无菌环境中进行刮擦。从受损的 MSC 板上取下盖子，并在板的顶部边缘放置一个直边，例如消毒的塑料尺。当板稍后放置在显微镜载物台上进行成像时，直尺可最大限度地减少板所需的旋转调整量。

在不去除培养基的情况下，使用无菌 200 微升移液器吸头在无菌直边的引导下，在板上划出四个平行的划痕，相距约 5 毫米，长约 50 毫米。在 60 毫米板上产生多个划痕不会以影响 MSC 细胞迁移的方式改变微环境，但对于其他细胞类型来说可能是一个考虑因素。吸出培养基，并用两毫升预热的完全培养基轻轻洗涤板。

这可以防止细胞粘附在划痕的中心，并去除因划痕而松动的细胞。使用无菌、永久性标记标签更换为 4 毫升新鲜的完整培养基，在板底部不会干扰成像的位置划伤 1 到 4 个。必须拍摄每个划痕的划痕初始图像，因为在迁移之前和之后比较来自同一划痕的图像非常重要，因为划痕宽度可能会有所不同。

如果在多个板上进行划痕测定，建议在下一个板上进行划痕之前，先拍摄单个板上所有划痕的初始图像。使用带有摄像头的倒置相差显微镜采集分析所需的图像。将培养板放在显微镜上，并使用低倍物镜定位划痕。

第一。划痕必须在屏幕上完全水平，同时保持划痕完全水平，并在视野的中心获取尽可能多的图像，以涵盖划痕长度的 90%。从划痕的不同部分获取图像，图像之间没有重叠。

不要从划痕长度的第一个和最后 5% 拍摄图像，因为培养皿边缘的光折射会暴露图像，使其无法分析。从头开始保存图像，在文件夹中排名第一。以相同的方式获取划痕 2、3 和 4 的图像，并将每个划痕的图像保存在单独的文件夹中。

初始成像后立即将板放回培养箱中。在开始此检测之前，让细胞迁移 4 到 7 小时。下载 Image J 软件并安装伤口愈合工具插件。

在图像 J 中打开图像文件，然后单击 process 并找到边缘以突出显示伤口愈合工具的划痕周围的单元格。要计算暂存区域，请单击 图像调整 和 颜色阈值，然后在标有 threshold color 的下拉菜单中，将值更改为 BNW 在 颜色阈值 菜单中。将底部滑块完全向右移动，使图像完全变黑，然后调整顶部滑块，以便在草稿和单元格正面之间产生最大的对比度。

从左到右慢慢调整顶部亮度滑块，直到图像清晰地显示划痕的轮廓。确定划痕的边缘后，单击 更多工具.在图像 J 工具栏中，从下拉菜单中选择 MRI 伤口愈合工具，然后按 M 按钮突出显示划痕区域并输出计算区域。

在结果弹出窗口中，将结果窗口中的所有数字复制并粘贴到 Excel 电子表格中。确保将数据与单个划痕分开。细胞迁移 4 到 7 小时后，重复划痕的图像采集程序，按照划痕的顺序对板进行成像，以便每个板上的细胞具有相同的迁移时间。

细胞可以在多个时间点成像，具体取决于它们对温度和 pH 变化的敏感性。然后使用图像 J 以与初始划痕图像相同的方式分析最终的划痕图像。划痕面积也可以计算以量化迁移，正确。

汇合度对于划痕测定的成功至关重要。此处显示了在 95% 汇合处成功划伤小鼠肺 MSC。相比之下，70% 的汇合度对于成功的划痕来说太低了，并且会产生错误的边界。

这些是具有代表性的迁移前和迁移后原始图像，具有由成像软件定义的相应划痕区域边界。这些图表显示了在迁移之前或之后，暴露于 0% 或 4% 香烟烟雾提取物，在 95% 汇合处在小鼠肺 MSC 板上所做的四个划痕中的每一个的平均计算划痕面积（以像素为单位）。计算出的划痕面积平均变化的比较显示，暴露于 4% 香烟烟雾提取物后小鼠肺 MSC 的迁移较少。

在尝试此程序时，重要的是要记住优化并仔细监测我们正在处理的特定细胞类型的细胞汇合度，并练习生成划痕以确保它们尽可能均匀。在此程序之后，可以执行其他技术（如免疫组化）来回答有关可能影响细胞迁移的改变和蛋白质表达的其他问题。