Introduction
植物細胞壁は動的な構造です。増殖している細胞は、一次細胞壁、細胞を拡大することを可能にする組織で囲まれています。堆積物を植物の機械的支持を強化し、より剛性の二次壁を成長させることやめる細胞。両方の細胞壁は、異なる発達段階や組織1,2間で異なる別の構造（例えば 、ヘミセルロースおよびペクチン）の多糖類のマトリックス中に埋め込 まれたセルロースミクロフィブリルで構成されています。セルロースはしっかり結晶構造のミクロフィブリルを形成するように整列されている（1,4）-β-D-グルカンの鎖として合成されます。アモルファスセルロースはグルカン鎖が少ない順序付けられている領域を意味します。結晶と非晶質領域との間の比が3それぞれ、機械的強度及び粘弾性特性を提供することにより、細胞壁の機械的特性に影響を与えると考えられて一つのパラメータです。いくつかの方法がありましたX線回折及び交差分極/固体NMR 4を回転マジック角を検出し、それらのうち、セルロース配置の二つの形態を定量化するために開発されました。 X線回折は、試料5中の非晶質セルロースドメインに対する結晶の割合を決定するために用いることができます。別の方法は、それぞれ、結晶質および非晶質セルロースまたは他のポリマーとの間で区別するために、酸不溶および酸可溶性物質に細胞壁コンテンツの分画を使用しています。このアプローチでは、標識グルコース（[14 C]グルコース）の組み込みは、セルロース6,7を定量化するために使用されます。これらの方法は、せいぜい、全臓器分析のための植物材料を大量に必要とし、従って、細胞壁構造における組織特異的な変化に対して不十分敏感です。セルラー解像度でセルロースミクロフィブリルの可視化の変化を同定することができる蛍光色素8,9、と組み合わせるライブイメージング研究で達成することができますセルロースミクロフィブリルの向き。これらの色素を定量化するために使用されていないが、それらは結晶セルロースに特異的ではなく、細胞壁8の正常な構造を妨害し得ます。 Polscopeは、光ビームを分割し、光10の一部を遅延させる結晶セルロースの能力に依存イメージング技術です。光の位相差は、光の伝播方向に垂直に横たわるミクロフィブリルのために最強です。同様の配向のミクロフィブリルのために、光のリターダンス11より大きい、結晶化度が高いです。したがって、polscope、セルロースミクロフィブリルの相対的なレベルと方向の両方を研究するために使用されます。
彼らは急速に12を展開する前に、根は、細胞分裂のシリーズを受け、根の先端に、細胞は、幹細胞ニッチに由来その間線形成長を示します。ルートを含む細胞は、単方向（異方性）に拡大します方法、セル壁13の特性に影響を与える小分子シグナル伝達ホルモンによって指示されます。ホルモンに対する微分応答は、時間と空間に、バランスのとれた臓器成長14を確保する手段を提供します。したがって、細胞壁構造の高分解能の分析は、より良い全体の臓器の成長に細胞型特異的応答との間の接続を理解するために必要な重要な情報を提供することができます。ここで、我々は高品質の解剖学のセクションで観察されるように、 シロイヌナズナの根に結晶セルロースの組織特異的な蓄積を研究するpolscopeの実装を報告しています。この方法は、最近、ホルモン活性15の空間的な摂動に応答して、結晶セルロースの細胞型特異的蓄積を明らかにしました。
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Protocol
1.植物成長
- 表面の種子を滅菌します。
- 湿式または乾式法により（30ミリグラムまで）の種子を滅菌します。例として、乾燥滅菌法のために、少なくとも4時間、一晩まで、閉じたデシケーター中でガラスビーカーに、50ミリリットル漂白剤に1ミリリットルの氷のHCl 37％を追加します。化学フード内で、この手順を実行します。
- 0.5×ムラシゲ＆スクーグ（MS）培地中の0.8％植物寒天を含むプレート上で無菌種子を広げます。パラフィルムまたは多孔質テープでプレートを包み、アルミホイルでカバーしています。
- 均一な発芽を促進するために4日 - 1 4℃でプレートを保管してください。
- シロイヌナズナの苗を成長させるのに適した成長室にプレートを転送します。寒天培地の上に根の成長を維持し、侵入を防止するために、垂直方向に板を置きます。
- 7日発芽（DAG）の後固定液するために苗木を転送します。
2.固定
- 50ミリリットルリチャードソンSolutioを準備蒸留水で1％のホウ砂（緩衝剤）、1％メチレンブルーおよび1％アズール（組織学的染料）の等容量を組み合わせることにより、n個。使用前に0.22μmのPVDFフィルターユニットを駆動シリンジで濾過。
- 0.05 Mナトリウムカコジル酸（緩衝剤）中の1.25％グルタルアルデヒド：固定液の50ミリリットルを準備します。
注：これらの物質は毒性があり、化学フード内で処理する必要があります。 - 最終的な固定液を得るために、固定溶液にリチャードソン溶液100μlを（2.1を参照）（2.2を参照）を追加します。
- マーク対応するサンプル名で6ウェルプレートの各ウェル。
- 苗木、一度転送は、完全に液体で覆われるように、ウェルに（2.3を参照）3ミリリットル、最終的な固定液を - 2を配置します。
- 慎重に各ウェルに10苗まで、鉗子を使用して、転送します。パラフィルムを使用してプレートをシール。 4℃で、暗闇の中で、少なくとも一晩、一週間まで保管してください。
3.脱水
- <LI>苗を脱水します。ここに記載されているように、エタノールの濃度の増加を含む、新たな6ウェルプレートのウェル間にそれらを転送する：10％エタノールを15分間、 15分間、30％エタノール。 15分間、50％エタノール。 15分間70％エタノール。 15分間85％のエタノール。 15分間、95％エタノール。一晩、最低でも4°C、95％エタノール。慎重にプラスチックピンセットで好ましく、その子葉、によってそれらを把握することにより、苗を処理します。
4.潜入
- 浸透媒体を準備します。小さなガラス瓶で50ミリリットルの基本的な樹脂液キットでhistoresinキット活性化因子の1袋の内容物を混合。 20分間磁石をかき混ぜます。浸透媒体は、数週間、4℃で維持することができます。
- マーク・各対応するサンプル名で新しい6ウェルプレートのウェルと2でいっぱい - 浸潤培地の3ミリリットル。
- ピンセットを用いて浸透培地に95％エタノール溶液から苗木を移します。苗は府であることを確認しますLLY媒体によって覆われます。
- 植物組織に最大の浸透を確実にするために、少なくとも4日間、4℃で保管してください。
5.ブロックの準備
- 金型を埋め込むの各ウェルの中に小さなラベル、サンプル名と鉛筆でマークされたが、置きます。
- 15 mlの浸潤培地（4.1を参照）1mLの硬化剤を添加することにより培地を埋め込む準備します。重合の問題を回避するために、15ミリリットル未満のボリュームを準備しようとしないでください。
- メディアを埋め込む200μlで金型内に各ウェルの半分を記入し、金型の形状に切断オーバーヘッドフィルム片で覆いますが、それぞれの側に大きなサイズに1ミリメートル。重合を可能にするために、少なくとも2時間室温でインキュベートします。 5時間を超えないようにしてください。
- 培地を埋め込む追加のバッチを調製し（5.2を参照）、根の先端が金型内に配置されている間、重合を回避するために、氷上に保ちます。
- メスを用いて解剖スコープの下で各根端をカットし、非常に慎重に位置iトン：垂直方向の横断面または水平方向に縦断面のため、約2時 - 金型外周から3ミリメートル。オーバーヘッドフィルムで解決し、カバーを遮断して型を完全に埋めます。それが重合された後、ブロッキング溶液がわずかに縮小することに注意してください。
- 最低でも、2時間室温で保管してください。
- ブロックを乾燥させるため、乾燥シリカゲルと箱に入れて、最低でも、室温で一晩おきます。
6.セクショニング
- ナイフメーカーでガラス棒からガラスナイフを準備します。組織切片用にガラスナイフを使用してください。正方形にガラス棒をカットした後、ダイヤモンドスコアリングツールを使用して、2つのナイフを生産するために斜めの正方形をカットします。
- セクショニング機を使用して3ミクロン幅のスライス、 - 2へのセクションをブロックします。スライドガラスの上に置いてスライス、蒸留水の液滴の上に、低熱に設定したヒートブロック上にスライドを配置 - 水が蒸発するまで、（50〜60℃）。
- 元の溶液の0.2％に（2.1を参照してください）リチャードソン液を希釈し、スライスをカバーするために、それの1ミリリットルを使用します。 5秒間ヒートブロック上に置き、次いで蒸留水で洗浄します。
- ホットプレート上でスライドを乾燥させます。解剖顕微鏡下で観察し、顕微鏡下で彼らの後に識別を容易にするために、関心のスライスの位置を示すために、マーカーでスライドの背面をマーク。
- マウンティング培地100μlを添加して、カバースリップでカバーしています。
8.画像取得
- リター情報と偏光子/干渉光学フィルタ（ 図1 AD）を得るのに適しPolscopeシステムを装備した光学顕微鏡下でルートセクションを含む覆われたスライドを配置します。
- サンプル全体の明確な可視化を可能にする選択倍率（ 例えば 、本研究では40X）と顕微鏡の焦点を合わせますブロック部が、無根元セクションが含まれている空のフィールド上の電子。無傷できれいな地域を探してみてください。背景を設定するには、この領域を使用します。
- イメージング・システムおよびソフトウェアのパラメータを設定します。設定範囲を17 nmまで。 （8.2を参照）、「自動露出」を適用し、空のフィールドから背景画像を得ます。一つの背景画像は、実験ごとに使用されます。
セルロースミクロフィブリル配向の9 Polscope分析
- 縦断面の分析。
- 顕微鏡下で長手方向部分を含むスライドを置き、それのリター画像を得ます。関心の根元部に顕微鏡の焦点を合わせます。新しいファイル名を指定します。
- 「ライブAbrio "窓からabrioの画像（位相差情報と画像）をキャプチャします。 図2Cに示すように、セルの周囲に沿って実行して染色されたセルロースによって識別することができ、細胞壁を含み、セクションをキャプチャするようにしてください。
- 画像解析。
- 画像スタック内の関連する画像をダブルクリックします。 「表示設定」タブで「オリエンテーション擬似カラー」を選択します。
- セルロースミクロフィブリル角度を推定するには、カラーホイールの場合と細胞壁の対応する陰に一致します。
注： 図2Cにおけるカラーホイールは、ミクロフィブリルの長軸に沿った方向を示しているミクロフィブリルに沿って存在する光の遅相軸を反映しています。セルロースミクロフィブリル角度、色、セルの長軸により示される角度です。たとえば、インセットで伸長細胞は、細胞の長軸に対して約90°傾いたシアン色を示します。 - 細胞壁の平均ミクロフィブリル傾角を定量化するために、ソフトウェアのツールバーから「燃性および方位角スタンプ」ツールを使用します。ツール、ポイントを選択し、一方で得られた画像中の関心領域をクリックしてください。
注：このウィル度の角度（方位）（ 図2C）の表示におけるリットル結果。 - プラグインメニューから代替オープンアクセス偏光画像解析ソフトウェアでは、ランチ「ポル・アナライザ」プラグイン。新しい開いたウィンドウで、「複屈折」タブを開いてを選択し、背景ファイルと画像ファイルを保存します。
- 画像ウィンドウでは、「仕様」を選択します。そして、「ROIのピクセルサイズを「（この研究のために5ピクセルを使用）を調整。 "仕様"でウィンドウを選択し、「結果表内の値を示して」。
- 画像ウィンドウ内の関心領域をマークするために、多角形ツールを使用してください。セルロースミクロフィブリルの配向を得るために、「オリエンテーションライン」を選択します。
注：これは度の角度（方位）の表示になります。
注：2つの方法のいずれかにより算出された平均角度は、その後、スライドに沿って根元部の位置に正規化する必要があります。からのずれを修正するにはスライドに沿って全体の根元部の水平位置、（セクションへと根の成長軸、 図2Cに沿って垂直つまり、）その長軸に沿ってセルに隣接するセル壁の平均ミクロフィブリル傾角を定量化します。根元部が正確スライドに沿って配置されている場合、この角度は180°です。ミクロフィブリル角度を計算するために、180°から隣接するセル壁の平均測定ミクロフィブリル角度を引きます。スライド上に平らに細胞壁の平均測定ミクロフィブリル角度になった違いを追加します。
結晶セルロース蓄積の10 Polscope分析
- 横（クロス）セクションを使用してください。彼らのセルロースミクロフィブリルは（9で決定されるように）同様の角度で整列しているときに、結晶セルロース蓄積が細胞のみの間で比較することができることに注意してください。
- 画像スタック内の関連する画像をダブルクリックします。 P」を選択表示設定」タブ」の「seudo色。
- 燃性を測定しました。ズームアップ画像に。 「リージョン」を選択し、関心のあるすべての領域をマークします。すべての値を「クリップボードにコピー」「測定」タブに移動します。
- Excelにデータを転送し、（リターダンスの領域を意味する）必要な情報を抽出します。データを正規化します。
注：スライス間の厚さの違いを考慮するために、スライド内の特定の細胞壁のエッジに対する相対値を表します。標準化するために、同じ画像内の異なる細胞壁の平均リターダンスによって目的の細胞壁に対応する平均燃性を分けます。例えば、外側の表皮細胞壁は、私たちの研究では、内側皮質細胞壁に正規化しました。
- Excelにデータを転送し、（リターダンスの領域を意味する）必要な情報を抽出します。データを正規化します。
- サンプルあたり3根を最小限に抑えて、ルートごとに少なくとも3つのセクションのための測定を繰り返します。
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Representative Results
私たちは、モデルの臓器15-17としてシロイヌナズナの根を使用して、ブラシノステロイド（のBR）への細胞型特異的応答の影響を研究しています。 BR受容体BRI1を対象としているときに、BRI1変異体のバックグラウンドで、非有毛細胞（ 図2A、B）と呼ばれる表皮細胞のサブセットには、隣接セルの一方向性の細胞増殖を阻害し、そして全根の成長15。 Polscope分析は、この阻害の基礎となるメカニズムを明らかにするために行きました。非有毛細胞にBRI1を発現している野生型からや線から得られたルートの縦断面は、セルロースミクロフィブリルの同様の方向性を示した（ 図2C、D、および9.2.3で説明したように）、結晶性の相対的蓄積の比較を可能にしますこれらのゾーン（ 図2E、F）から取られた断面を使用して、分裂と伸長細胞、中のセルロース。この分析は、correlatを示しましたBRI1の非有毛細胞中での発現および結晶セルロースの局所的蓄積との間のイオン。フォローアップの実験はイソキサベンの低濃度によってセルロース合成酵素の軽度の阻害は順番に、部分的に一方向性の細胞増殖と根の長さ15を促進することにより、成長阻害を復元し、これらの細胞における結晶セルロースのレベルを下げることを示しました。
図1：偏光顕微鏡システム Polscopeシステムは、光源（C）の上部に位置するCCDデジタルカメラ（B）、アナライザおよびグリーン用液晶を備えた光学顕微鏡（A）からなる（D）。 Abrioソフトウェアは、画像取得および分析のために使用した。 こちらをクリックしてくださいトンOこの図の拡大版を表示します。
図2：細胞壁組成物のPolscope分析。 （A）その構成組織の放射状組織を示すシロイヌナズナプライマリルートのクロスセクション。これらの、表皮の非有毛細胞（N）。有毛細胞（H）および皮質（C）がマークされています。バーは10μm。（B）非有毛細胞を標的とBRI1-GFPを発現する根の共焦点顕微鏡画像。細胞、グリーン、BRI1-GFPの発現をマークホワイト、PI染色。バーは20μm。（C）野生型から非有毛細胞にBRI1を発現する植物から得られた根の縦断面図。セルロースミクロフィブリルの角度（ すなわち 、根の長軸を反映する色、セル長軸の間の角度）は、二つのライン間と同様です。そのリットルに沿ってセルに隣接するセル壁オング軸が丸で囲まれています。角度マークが測定される遮光されたセル壁を表します。バー、表皮細胞壁中のセルロースミクロフィブリル角度50μmである。（D）定量。分裂組織細胞に存在する角度の高い変動に注意してください（ すなわち、分裂組織ゾーン、MZ）のボックスプロットによって反映されるように、移行帯（TZ）における細胞と比較して。非有毛細胞における野生型とBRI1を発現する植物の間で同様の平均セルロースミクロフィブリル角度は、それらの対応する発達ゾーンの細胞中の結晶セルロース蓄積の比較を可能にします。各試料中の平均角度は赤線で示されている。光のリターダンスモードに示したこれらの同じ植物の背景の（EF）横ルートセクション、。 17 nmの - カラースケールは0の光燃性を表します。分裂組織（E）に対応する部分と伸び（F）のゾーンが示されています。バー、50μmです。外側の表皮細胞壁と内側皮質細胞壁が囲まれている。（G）のリターダンス値の定量化をpolscope画像から計算されます。値は外側の表皮細胞壁と内側皮質細胞壁との間のリターダンスの比として表されます。のみこれらの細胞でBRI1を発現する株における非有毛細胞における結晶セルロースの高い堆積ことに注意してください。 + SEを意味します。 40 <N <600; （**）P <0.01。 （***）両側t検定でP <0.001。図は15から採用され、修正された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
解剖学的情報を維持しながら、ここでは、 シロイヌナズナの根を構成する異なる組織における結晶セルロースの蓄積を決意するための方法を提示します。このように、それは、細胞の解像度で、植物の成長過程を理解することに向けた追加のステップを提供します。この方法はまた、付加的な植物種および器官の研究に適用することができます。
この方法を適用する際のポイントの数を考慮しなければなりません。彼らのセルロースミクロフィブリルの配向が類似する場合、最初に与えられた根元部における結晶セルロース蓄積は組織間、異なる遺伝子型からのセクション間や治療間で比較することができます。セルロースミクロフィブリルの向きは、セル壁18の一面を含む縦断面において決定されます。したがって、外側から最も内側のものに、根の別個の組織をカバーする長手方向の一連のセクションは、analysを有効にします指定された発達段階で、異なる組織におけるセルロースミクロフィブリルの向きです。表皮の伸長細胞の平均セルロースミクロフィブリル角度で、より組織構造を有しながら、ここに示した例では、表皮の分裂細胞は、140°の平均のセルロースミクロフィブリル角度でセルロースミクロフィブリル配向の広い範囲を持っています120°。これらの測定により、対応する細胞型および発生ゾーンにおいて、それらの相対的結晶セルロース蓄積の自信比較を可能にする、野生型および興味の変異体の間で同様でした。
第二に、異なるセクションの幅の変動は、測定された光のリターダンスのレベルに影響を与えることができます。これは、異なる組織（皮質細胞）のリターダンス測定に関心（上皮細胞）の組織の生のリターダンスの測定値を正規化することによってここに回避されます。正規化された値は、AReはその後、比較（ 図2E-Gを参照してください）。
最後に、ルートに沿った横断面では、異なる発達ゾーンをキャプチャします。断面におけるこれらのゾーンの同定は、データの解釈のために重要です。セクション内の最も外側の側根キャップ細胞層の損失は簡単なゾーンマーカを備えます。一般的には、側根キャップの最も古いセルがプログラムされた細胞死を起こしたときに細胞がその速い展開を開始し、その後、保護されていない表皮は、最も外側の組織19になります。
現在、アモルファスセルロースドメインに対する結晶の割合の細胞解像度の尺度を提供する方法が欠如しています。実際、これはまた、ここに提示される方法の一つの限界です。しかし、結晶セルロース自体の蓄積を通信する能力は、結晶セルロースの高い相対レベルのような重要な進歩は、おそらくより多くをレンダリングされます増加した引張強さと堅牢な細胞壁。高解像度ツールの開発は、正確にその機械的特性と一緒に細胞壁が今後の課題のままで組成を決定します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22 mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100 µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
References
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