Summary
Um método de alto rendimento para um passo de purificação negativa recombinante de Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (NAP-HP) sobre-expresso em Escherichia coli usando resinas dietilaminoetilo no modo de lote é descrito. HP-NAP purificada por este método é benéfico para o desenvolvimento de vacinas, medicamentos, ou diagnóstico de H. pylori -associated doenças.
Abstract
Helicobacter pylori proteína de activação de neutrófilos (HP-NAP) é um importante fator de virulência de Helicobacter pylori (H. pylori). Ela desempenha um papel crítico em H. pylori induzida por inflamação gástrica, activando vários leucócitos inatas, incluindo neutrófilos, monócitos, mastócitos e células. As propriedades imunogênicas e imunomoduladores da HP-NAP torná-lo um candidato potencial de diagnóstico e vacinas para H. pylori e uma nova droga candidatos para a terapia do cancro. A fim de obter quantidades substanciais de HP-NAP purificada utilizada para as suas aplicações clínicas, um método eficiente para purificar esta proteína com elevado rendimento e grau de pureza deve ser estabelecida.
Neste protocolo, nós descrevemos um processo para um passo de purificação cromatográfica negativa recombinante de HP-PNA sobre-expresso em Escherichia coli (E. coli) usando dietilaminoetilo resinas de permuta iónica (DEAE) (por ex., Sephadex) iModo lote n. Recombinante HP-NAP constitui quase 70% do total de proteínas em E. coli e é quase totalmente recuperada na fracção solúvel após a lise celular, a pH 9,0. Sob a condição óptima a pH 8,0, a maioria dos HP-NAP é recuperada na fracção não ligada enquanto as proteínas endógenas da E. coli são eficientemente removida pela resina.
Este método de purificação utilizando cromatograf ia em lotes modo negativo com resinas de permuta iónica em DEAE produz funcional HP-NAP a partir de E. coli, na sua forma nativa com elevado rendimento e pureza. A HP-NAP purificada pode ser ainda utilizado para a prevenção, tratamento e prognóstico do H. pylori -associated doenças, bem como a terapia do cancro.
Introduction
Helicobacter pylori (H. pylori) é uma das principais causas de gastrite e úlcera péptica. Esta bactéria também foi classificado como cancerígeno em humanos pela Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer, parte da Organização Mundial da Saúde, em 1994. Estima-se que a prevalência de H. pylori é de 70% nos países em desenvolvimento e 30-40% nos países industrializados 1. Mesmo que a taxa de infecção de H. pylori está diminuindo nos países industrializados, a taxa de infecção de H. pylori em países em desenvolvimento ainda é alto 2. O tratamento padrão para erradicar H. pylori consiste na administração de um inibidor da bomba de protões, IPP, e dois antibióticos, amoxicilina ou claritromicina mais metronidazole 3. No entanto, o aumento da resistência aos antibióticos em H. pylori relacionados com a terapia de úlcera insta o desenvolvimento de novas estratégias para prevenir oR curar a infecção. O desenvolvimento de vacina preventiva e / ou terapêutica contra o H. pylori pode proporcionar uma abordagem alternativa para controlar H. pylori.
Helicobacter pylori proteína de activação de neutrófilos (HP-NAP), um importante fator de virulência do H. pylori, foi identificado pela primeira vez em extratos aquosos de H. pylori com a capacidade de activar os neutrófilos a aderir às células endoteliais e produzem espécies reactivas de oxigénio (ROS) 4. A infiltração de neutrófilos na mucosa gástrica encontrada em H. pylori pacientes infectados com gastrite ativa pode resultar em inflamação e danos nos tecidos do estômago. Assim, HP-PNA pode desempenhar um papel patológico através da activação de neutrófilos para induzir a inflamação gástrica, o que provoca ainda mais úlcera ou H. pylori -associated doenças gástricas. No entanto, HP-NAP é um candidato potencial para aplicações clínicas 5,6. Devido à pró imunogénica e imunomoduladorpriedades de HP-PNA, esta proteína pode ser utilizada para o desenvolvimento de vacinas, agentes terapêuticos, e ferramentas de diagnóstico. Um ensaio clínico foi conduzido para a utilização recombinante HP-NAP como um dos componentes de uma vacina contra a proteína H. pylori. Esta vacina consiste de recombinante HP-PNA, associado citotoxina-gene A (CagA), e proteínas citotoxina vacuolar A (VacA) formulado com hidróxido de alumínio e ainda tem sido demonstrado ser segura e imunogénica em humanos 7. Além disso, a HP-NAP actua como um potente imunomodulador para desencadear T auxiliar tipo 1 (Th1) -polarized respostas imunitárias para a terapia do cancro e 8 para regular negativamente as respostas imunitárias mediadas por Th2 provocadas por reacções alérgicas e infecções parasitárias 9,10. Como para o diagnóstico, com base ELISA-HP-NAP recombinante tem sido utilizada para a detecção de anticorpos séricos contra o HP-PNA em H. pylori pacientes infectados 11. Um estudo mostrou que o nível de anticorpos específicos de HP-NAP em soros de H. pyLori pacientes infectados com carcinoma gástrico foi significativamente mais elevada do que a partir de pacientes com gastrite crónica 12. Outro estudo também mostrou que os anticorpos séricos contra HP-PNA estão associados com a presença de não-cárdia adenocarcinoma gástrico 13. Assim, ELISA baseado em HP-NAP recombinante pode ser utilizada para a detecção de anticorpos séricos contra o HP-PNA para o prognóstico do cancro gástrico em H. pylori pacientes infectados. Tomados em conjunto, o HP-NAP purificada pode ser ainda utilizado para a prevenção, tratamento e prognóstico do H. pylori -associated doenças, bem como a terapia do cancro.
Entre os vários métodos utilizados para a purificação do HP-NAP recombinante expressa em Escherichia coli (E. coli) na sua forma nativa relatados até agora, uma cromatograf ia de filtração em gel segundo passo de purificação envolvendo é necessária para se obter elevada pureza HP-NAP 14-16 . Aqui, um método utilizando a cromatografia modo descontínuo com negativodietilaminoetilo (DEAE) resinas de permuta iónica é descrito para a purificação do HP-PNA sobre-expresso em E. coli com elevado rendimento e elevada pureza. Esta técnica de purificação foi baseado na ligação de proteínas e / ou que não sejam HP-PNA para a resina de impurezas da célula hospedeira. A pH 8,0, quase sem outras proteínas, exceto HP-NAP são recuperados a partir da fracção livre. Esta abordagem purificação utilizando cromatografia de troca iônica DEAE no modo negativo é simples e economia de tempo, permitindo a purificação do recombinante HP-NAP através de cromatografia de uma etapa, através da recolha da fracção livre. Além de HP-PNA, várias outras biomoléculas, tais como vírus 17, Imunoglobulina G (IgG) 18, hemoglobina 19, fosfatase de proteína 20, e factor de virulência flagelina 21, também tem sido relatado para ser purificado por cromatografia de permuta iónica em negativo modo. O modo negativo é o preferido para a cromatografia de permuta iónica se as impurezas são o menorcomponentes presentes na amostra submetida a ser purificada 22. A aplicação de cromatografia negativa em purificação de biomoléculas naturais ou recombinantes foi recentemente revista 23.
O presente relatório fornece um passo a passo de protocolo para a expressão de recombinante HP-NAP em E. coli, a lise das células, e a purificação do HP-PNA utilizando cromatografia lote modo negativo com resinas de permuta iónica em DEAE. Se uma proteína desejada para a purificação é adequada para cromatografia de permuta iónica em modo negativo, o protocolo descrito também pode ser adaptado como um ponto de partida para o desenvolvimento de um processo de purificação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O sangue humano foi coletado de voluntários saudáveis com o consentimento informado por escrito antes e aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade Nacional Tsing Hua, Hsinchu, Taiwan.
1. Expressão Recombinante de HP-PNA em E. coli
- Prepara-se o plasmídeo pET42a-PNA contendo a sequência de ADN de HP-NAP de H. pylori 26695 estirpe como descrito anteriormente 16. Prepare os plasmídeos contendo a sequência de ADN de HP-NAP com as mutações pontuais desejadas como descrito (ver protocolo, passo 8).
- Transformar 10 ng dos plasmídeos de DNA acima referidas em E. coli BL21 (DE3) células competentes por choque térmico durante 45 segundos a 42 ° C, as células raia no caldo de lisogenia (LB) agar contendo 50 ug / ml de canamicina, e incubar as placas a 37 ° C durante 16 horas.
- Inocular colónias individuais em tubos individuais contendo 5 ml de caldo de LB com 50 ug / ml de canamicina e crescem-los como pré-culturas em três7 ° C durante 16 horas com agitação a 170 rpm.
- Inocular 2 ml de células de pré-cultura acima em 200 ml de caldo LB contendo 50 ug / ml de canamicina num balão de 1 L. Incubar o balão de cultura inoculado a 37 ° C durante 2 horas com agitação a 170 rpm até que a absorvância a 600 nm atingir aproximadamente 0,4-0,5 detectado por um UV / VIS.
- Adicionar 80 ul de 1 M de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para a cultura acima, para uma concentração final de 0,4 mM para induzir a expressão de HP-NAP. Incubar a cultura durante 3 h até que a absorvância a 600 nm atingir aproximadamente 1,6-1,7.
- Centrifugar as células a 6000 xg, a 4 ° C durante 15 minutos para remover o sobrenadante. Armazenar o sedimento de células à temperatura de -70 ° C até à purificação.
2. Preparação da fracção de proteína solúvel contendo HP-NAP
Nota: Todos os passos seguintes são realizados a 4 ° C.
- Ressuspender 50 ml da célula pEllet preparado no protocolo passo 1.6 em 20 mL de Tris-HCl a 20, pH 9,0, NaCl 50 mM contendo 0,13 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,03 mM de N-alf a-tosil-L-lisinil-clorometilcetona (TLCK), e 0,03 mM de N-tosil-L-f enilalaninil-clorometilcetona (TPCK), a 4 ° C como previamente descrito 16.
- À dissociação das células das bactérias fazendo passar a suspensão bacteriana por meio de um homogeneizador de alta pressão operado a uma gama de 15.000 a 20.000 psi durante 7 vezes a 4 ° C.
- Centrifugar o lisado celular a 30000 x g a 4 ° C durante 1 h para separar as fracções proteicas solúveis e insolúveis usando uma ultracentrífuga. Transferir o sobrenadante como a fracção de proteína solúvel para uma proveta.
- Medir a concentração de proteína da fracção da proteína solúvel pelo método de Bradford, utilizando um kit comercial, com albumina de soro de bovino (ASB) como o padrão de acordo com as instruções do fabricante.
- Adicionar 177,6 mL de HCl 1 N em 20 ml de the fracção de proteína solúvel obtida a partir de 2,3 protocolo passo para ajustar o valor de pH a partir de pH 9,0 para pH 8,0.
- Adicionar Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 50 mM à solução de proteína acima para fazer a concentração de proteína final seja 0,5 mg / ml.
3. A purificação do recombinante HP-NAP a partir de E. coli por Cromatografia Modo Batch Negativo com DEAE Resinas de permuta iónica
- Preparar 15 ml de resinas DEAE.
- Pesar 0,6 g de pó seco de resinas DEAE e suspendê-lo em 30 ml de Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 50 mM à temperatura ambiente durante pelo menos 1 dia.
- Centrifugar a resina a 10.000 x g a 4 ° C durante 1 min.
- Retirar e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 15 ml de Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 50 mM.
- Repita os passos Protocolo 3.1.2 a 3.1.4 quatro vezes mais.
- Armazenar as 15 ml de resina assente (pasta a 50% em 30 ml de tampão de Tris) a 4 ° C para utilização subsequente.
Nota: Todo o passo seguintes são realizados a 4 ° C.
- Adicionar 45 ml de as proteínas solúveis preparadas de protocolo passo 2,6-15 ml da resina e agita-se a pasta de proteína / resina com um agitador magnético a 4 ° C durante 1 h.
- Verter a pasta de proteína / resina para uma coluna de plástico ou de vidro equipado com uma torneira de passagem. Permitir que a resina se contentar por gravidade.
- Abrir a torneira para permitir que a solução de proteína para correr através da coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna é um pouco acima da resina. Recolhe-se o fluxo de passagem como a fracção não ligada, que contém o HP-NAP purificada.
- Adicionar 15 mL de gelo frio de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl a 50 mM para a coluna.
- Abrir a torneira para permitir que o tampão de lavagem para ser executado através da coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna é um pouco acima da resina. Recolhe-se o fluxo de passagem como a fracção de lavagem.
- Repita Protocolo passos 3.5 a 3.6 mais quatro vezes para recolher as fracções de lavagem adicionais.
- Adicionar 15 mL de gelo frio de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl a 1 M em uma coluna.
- Abrir a torneira para permitir que o tampão de eluição de correr através da coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna é um pouco acima da resina. Recolhe-se o fluxo de passagem como a fracção de eluição.
- Repita os passos Protocolo de 3.8 a 3.9 mais quatro vezes para recolher as fracções de eluição adicionais.
4. Tampão do Exchange e endotoxina remoção do HP-NAP purificado por cromatografia Modo Batch Negativo com DEAE Resinas
Nota: O purificada HP-NAP expressa em E. coli tem de ser sujeita a troca de tampão e a remoção de endotoxina antes de estimular os neutrófilos.
- Executar a diálise para mudar o tampão do HP-NAP purificada a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, a 4 ° C utilizando tubo de diálise com corte de peso molecular de 14 kDa, tal como previamente descrito 24.
- Filtrar a HP-NAP dialisada através de uma syringe filtro com uma membrana carregada positivamente, hidrófila ligada a uma seringa descartável de 20 ml com caudais que vão de 2,5 a 4 ml / minuto a 4 ° C para remover a endotoxina.
5. Caracterização das propriedades moleculares do Purificada Recombinante HP-NAP por Sodium Dodecyl de poliacrilamida eletroforese em gel (SDS-PAGE), Western Blot, Native-PAGE, Gel Filtration Chromatography, e Dicroísmo Circular Spectroscopy
- Analisar o HP-NAP recombinante purificada por SDS-PAGE e Western blotting com sobrenadantes de cultura de hibridoma contendo anticorpo monoclonal de rato MAb 16F4 25 como previamente descrito 24.
- Analisar o HP-NAP purificada por PAGE nativa e cromatografia de filtração em gel para examinar o seu estado oligomérico como descrito anteriormente 26.
- Analisar o recombinante HP-NAP purificada por espectroscopia de dicroísmo circular para examinar a sua estrutura secundária, como anteriormente descrito 26.
6. Avaliação da Pureza de HP-NAP por coloração com prata de um gel de SDS-PAGE
- Preparar a solução de fixação, solução, solução de prata, a solução de desenvolvimento de sensibilização, solução de paragem, e a solução de lavagem de acordo com as instruções do fabricante de um kit de coloração com prata.
- Realização da coloração de prata de um gel de SDS-PAGE de acordo com as instruções do fabricante de um kit de coloração com prata.
- Obter a imagem do gel com um sistema de imagem.
7. Medição de ROS produção a partir de neutrófilos induzida por HP-NAP
- Isolar os neutrófilos humanos a partir de sangue humano heparinizado por sedimentação de dextrano seguido por centrifugação em gradiente de densidade, como previamente descrito 24.
- Medição da produção de ROS por neutrófilos estimulados com HP-NAP usando um ensaio de quimioluminescência dependente de luminol.
- Ligar um leitor de placas e ajustar a temperatura a 37 ° C. coloque umplaca vazia de fundo plano de 96 poços branca dentro da câmara de leitor de placas, permitindo-a aquecer até 37 ° C.
- Preparar as misturas de estímulo em D-PBS, pH 7,2, contendo 0,9 mM de CaCl 2, MgCl 2 0,5, e 13,3 uM de 5-amino-2,3-di-hidro-1,4-phthalazinedione (luminol), com a presença e ausência de 0,67 mM removido-endotoxina HP-NAP preparada a partir de protocolo passo 4.2.
- Ajustar a concentração de neutrófilos humanos preparados a partir de protocolo passo 7.1 a 2 x 10 6 células / ml em D-PBS, pH 7,2, contendo 5 mM de glucose.
- Adicionar 50 ul de suspensão de neutrófilos em cada cavidade de 96 poços enquanto o prato.
- Adicionar 150 ul das misturas preparadas a partir de estímulo Protocolo passo 7.2.2 em neutrófilos bem contendo em um intervalo de tempo de 5 segundos por poço.
- Medir a emissão da quimioluminescência durante 5 segundos por poço durante um período de três horas, utilizando um leitor de placas.
8.Construção de DNA plasmídeos contendo HP-NAP Mutantes por Polymerase Chain Reaction (PCR) à base de mutagênese Site-direta
Nota: mutagénese sítio-directa baseada em PCR foi gerado, basicamente, como descrito anteriormente 27, excepto que os locais de restrição "silenciosas" foram introduzidas para os iniciadores de mutagénese por mutagénese dirigida (SDM) de software -assist 28.
- Realizar a reacção de PCR.
- Adiciona-se 10 ng de plasmídeo pET42a-PNA, 1 | iM de pares iniciadores de mutagénese listados na Tabela 1, 200 uM de trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs), e 3 unidades de alta fidelidade-PCR mistura de enzima para um tubo de PCR contendo água desionizada, dando uma última volume de 25 ul.
- Iniciar os ciclos de PCR a 95 ° C durante 10 minutos para desnaturar o ADN modelo, e seguir com 12 ciclos de amplificação a 95 ° C durante 1 minuto, a T m nenhum -5 ° C durante 1 minuto, e 72 ° C durante 6 min.
- Terminar os ciclos de PCR comum passo de recozimento a T m pp -5 ° C durante 1 minuto e um passo de extensão a 72 ° C durante 30 min.
- Tratar 15 ul do produto de PCR com 0,4 ul de enzima de restrição Dpnl a 37 ° C durante 2 h e, em seguida, analisar 2 uL do produto de PCR Dpnl-tratada por electroforese em gel de agarose.
- mutantes tela.
- Transformar 2 uL do produto de PCR em E. coli DH5a células competentes por choque térmico para 45 seg a 42 ° C.
- Espalhe as células transformadas em uma placa de LB contendo 50 ug / ml de canamicina e Incubar a placa a 37 ° C durante 16 horas.
- Isolar o ADN plasmídico a partir das colónias bacterianas utilizando um kit comercial de lise alcalina de acordo com o protocolo do fabricante.
- Tratar o DNA de plasmídeo isolado no passo 8.3.3 Protocolo com a enzima de restrição Xhol para verificar a presença das mutações silenciosas desejado de acordo com o protocolo do fabricante.
- sequência doDNA do plasmídeo verificada por passo 8.3.4 Protocolo com o iniciador do promotor de T7 para confirmar a correcção das sequências de codificação mutantes de HP-NAP de acordo com o protocolo do fabricante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O diagrama esquemático do processo experimental de purificação negativa recombinante de HP-NAP expressa em E. coli, usando resinas de permuta iónica em DEAE em modo de lote é mostrado na Figura 1. Esta técnica de purificação é baseado na ligação de proteínas e / ou que não sejam HP-PNA para a resina de impurezas da célula hospedeira. A pH 8,0, quase sem outras proteínas, exceto HP-NAP na sua forma nativa são recuperados a partir da fracção não ligada (Figura 2A e B). A HP-NAP purificada na fracção não ligada foi imunodetectada pelo anticorpo contra HP-NAP (Figura 2C) e a sua pureza era superior a 97% tal como confirmado por coloração com prata (Figura 2D). Além disso, o recombinante HP-NAP purificada manteve a sua forma oligomérica como analisados por PAGE nativa (Figura 2B) e cromatografia de filtração em gel (Figura 3A). spectroscop dicroísmo circularIC análise mostrou que a proteína purificada era composta principalmente de alfa-hélices (Figura 3B). Além disso, o HP-NAP purificada foi capaz de estimular os neutrófilos humanos para produzir ROS (Figura 3C). Assim, o HP-NAP recombinante purificados por esta abordagem se encontra na sua forma nativa com actividade biológica. Além disso, este modo de cromatograf ia em lotes negativa pode ser utilizada para purificar recombinante HP-NAP com mutações pontuais em um passo. Como mostrado na Figura 4, os dois mutantes HP-NAP Y101H e HP-NAP E97GY101H recombinantes, que imitam HP-NAP de H. pylori NCTC 11639 e NCTC 11.637 estirpes, respectivamente, foram purificados por cromatografia este lote modo negativo com uma pureza superior a 95%.
Para a realização de cromatograf ia em modo batch negativa utilizando resinas DEAE para purificar HP-PNA, o valor de pH do tampão utilizado para a purificação deve ser ajustado para 8,0para garantir que a maioria dos HP-NAP está presente na fracção não ligada. Menor quantidade de HP-NAP estava presente nas fracções não ligadas, quando o valor do pH foi maior ou menor do que 8,0 (Figura 5). Mesmo que a pureza de HP-NAP presente nas fracções não ligada foi aumentado apenas um pouco como o aumento do pH 7,0-9,0, a quantidade de HP-NAP presente nas fracções não ligada foi o mais elevado, quando o valor do pH era de pH 8.0 (Figura 5). A quantidade das proteínas solúveis a partir de lisados de células carregados sobre a resina é outro factor importante para este purificação. Aqui, a relação é de 1,5 mg de proteínas por ml de resina para atingir a capacidade máxima da resina para absorver as impurezas a partir de E. coli (Figura 6). Além disso, a pureza e o rendimento de HP-PNA obtida por este modo de cromatograf ia em lotes negativo pode ser substancialmente aumentada através do aumento da quantidade de HP-NAP presente na fracção solúvel deOs lisados de E. coli. Recombinante HP-NAP foi quase totalmente recuperado na fracção solúvel após a lise celular, a pH 9,0 (Figura 7). Embora a solubilidade do recombinante HP-PNA em E. coli lisados foi marcadamente aumentada quando as células foram lisadas em tampão com o pH superior a 7,5 (Figura 7), a menos de 90% de HP-NAP estava presente como a proteína solúvel, quando as células foram lisadas em tampão com o pH inferior a 9,0.
Figura 1:. Desenho esquemático dos Purificação negativo de HP-NAP por DEAE Resinas no modo em lotes A purificação inicia-se com um procedimento de ligação em lotes. A fracção de proteína solúvel contendo HP-PNA obtida a partir de lisados bacterianos é adicionado à resina de DEAE pré-equilibrada com tampão Tris a pH 8,0. As proteínas / suspensões de resina são então incubadas a 4 ° C durante 1 h com mixi suaveng. Durante a incubação, as proteínas da célula hospedeira para se ligar a resina. HP-NAP presente na fracção livre é obtida por qualquer recolhendo o sobrenadante após a centrifugação ou a fração de escoamento de uma coluna dirigida por fluxo de gravidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. O resultado exemplar de Purificação de HP-NAP por Cromatografia modo em lotes negativa com resinas de permuta iónica de DEAE todo o lisado celular (W) e a fracção de proteínas solúveis (S) de E. coli BL21 (DE3) expressando HP-PNA e a fracção não ligada (L) contendo HP-NAP a partir de cromatografia de permuta iónica em DEAE foram analisadas por SDS-PAGE (A),-PAGE nativa (B), e Western blotting (C). A frac desacopladoção com a quantidade indicada de proteínas que variam de 1 ug a 10 ug foi analisado num gel de SDS-PAGE corado com prata (D). massas moleculares (m) em kDa são indicados à esquerda dos géis corados e o blot. (Adaptado da referência 24) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização estrutural e funcional de recombinante HP-NAP purificada a partir de E. coli por cromatografia modo em lotes negativo. (A) O perfil de absorvência de UV foi registado para o HP-NAP eluída a partir de uma coluna de filtração em gel. As massas moleculares dos marcadores de proteína foram indicados no cromatograma. (B) O extremo UV dicroísmo circular SPECTrum da HP-NAP foi gravado na faixa de comprimento de onda de 195 a 260 nm. (C) Os neutrófilos humanos (1 x 10 5 células) foram tratadas com 0,5 uM HP-NAP e D-PBS, pH 7,2, como um controlo negativo, a 37 ° C. O teor de ROS gerado a partir de neutrófilos foi medida continuamente utilizando um ensaio de quimioluminescência dependente de luminol-. Os dados foram representados como a média ± desvio padrão de uma experiência em triplicado. (Adaptado da referência 24) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Purificação de mutantes recombinantes HP-NAP expressa em E. coli por cromatografia modo em lotes negativo. As fracções de proteína solúvel de E. coli BL21 (DE3) expressando dois HP-NAP Y101H e HP-NAP mutantes E97GY101H recombinantes e de tipo selvagem HP-NAP foram purificados por cromatografia de modo negativo com resinas DEAE. As fracções não ligadas foram analisadas por SDS-PAGE. As massas moleculares (M) em kDa são indicados à esquerda dos géis manchadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeito do Tampão de pH na purificação do recombinante HP-NAP expressa em E. coli por Cromatografia Modo Batch negativo. A fração solúvel de E. coli BL21 (DE3) expressando HP-NAP lisadas a pH 9,0 foi ajustado para o pH indicado na gama 7,0-9,0 e uma concentração de proteína de 0,3 mg / ml. estes ajustadoAs fracções indicadas, como carga, foram, em seguida, carregou-se resinas DEAE para purificar recombinante HP-NAP por cromatografia em modo batch negativa a 4 ° C. Os, lavagem, e fracções de eluição não ligadas foram analisadas por SDS-PAGE. massas moleculares (m) em kDa são indicados à esquerda dos geles corados. (Adaptado da referência 24) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Efeito da quantidade de proteínas carregado em DEAE Resinas para a purificação recombinante HP-NAP Expressa em E. coli. As fracções de proteína solúvel de E. coli BL21 (DE3) expressando HP-NAP foram carregadas em resinas de DEAE de acordo com a a proporção indicada de proteínas mg por mililitro de resinas para purificar recombinant HP-NAP pela cromatografia modo lote negativo em pH 8,0. As proteínas solúveis, indicada como a carga (L), a fracção não ligada (A), fracção de lavagem (B), e a fracção de eluição (C) foram analisadas por SDS-PAGE. massas moleculares (m) em kDa são indicados à esquerda dos geles corados. (A partir de referência 24) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Efeito do pH sobre a solubilidade de HP-PNA em E. Os lisados coli. (A) E. coli BL21 (DE3) expressando HP-NAP foi suspenso em tampão Tris-HCl arrefecido em gelo ao pH indicado que variou de 7,0 a 9,5. As células foram lisadas e os lisados de células inteiras, em seguida, (W) foram centrifugadas tO separar fracções solúveis (S) e peletes insolúveis (I). As proteínas foram analisadas por SDS-PAGE. massas moleculares (m) em kDa são indicados à esquerda dos geles corados. (B) A percentagem de solubilidade de recombinante HP-PNA em todo o lisado celular a cada pH foi calculada a partir da intensidade da banda de HP-PNA em geles de SDS para a fracção solúvel (S) dividida pelo que, para o lisado celular total (W ). Os dados foram representados como a média ± desvio padrão de pelo menos duas experiências. (A partir de referência 24) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Os iniciadores utilizados para mutagénese. Por favor click aqui para ver uma versão maior desta tabela.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A cromatografia em lote modo negativo com resinas de permuta aniónica DEAE aqui apresentado é adequado para a purificação do recombinante HP-NAP sobre-expressos em E. coli. Os valores dos tampões utilizados nos passos de lise de células e purificação de pH são muito crítica para assegurar a solubilidade de HP-PNA em E. Os lisados de E. coli e a separação eficiente de recombinante HP-NAP a partir de impurezas da célula hospedeira, respectivamente. As células bacterianas lisadas deve ser a pH 9,0, e a purificação negativa deve ser realizada a pH 8,0 para se obter HP-NAP com elevado rendimento e elevada pureza. Recuperação típica de HP-NAP é 90%, e a pureza típica é 95% 24. Uma vez que o HP-NAP está presente na fracção não ligada, uma quantidade mínima, mas suficiente da resina deve ser usada para atingir a sua capacidade máxima de absorver as impurezas. No nosso caso, a capacidade de carga máxima é de 1,5 mg de proteínas solúveis a partir de E. lisados coli por resina mililitro.
a proviprotocolo ded é projetado para a purificação do recombinante HP-NAP de um ml E. 50 cultura coli. O rendimento do HP-NAP é de cerca de 15 mg. O processo de purificação pode ser tanto em escala reduzida ou em escala-up em conformidade. Por exemplo, os dois HP-NAP Y101H e HP-NAP E97GY101H mutantes recombinantes foram purificados a partir de uma 1 ml de E. cultura coli por cromatografia utilizando este modo em lote negativo. Ambos os mutantes HP-NAP com uma pureza superior a 95% foram obtidas através da recolha da fracção não ligada (Figura 4). Esta cromatografia em modo batch negativo também foram aplicados para purificar recombinante HP-NAP a partir de uma 860 ml E. cultura coli. A recuperação do passo utilizando cromatografia de DEAE modo negativo lote atingiu 97% com pureza superior a 90%.
HP-NAP expressa em Bacillus subtilis (B. subtilis), também tem sido purificada com sucesso por este lote cromatografia DEAE modo negativoem uma única etapa 26. No nosso B. subtilis sistema de expressão, o nível de HP-NAP expressão é baixo. HP-NAP representa apenas cerca de 5% das proteínas solúveis totais a partir dos lisados bacterianos. Mesmo que o HP-NAP alvo de purificação está presente numa pequena quantidade, HP-NAP com uma pureza superior a 90% pode ser obtido através da redução da relação entre a quantidade de proteínas a partir de lisados de células carregados sobre a resina para remover eficazmente quase todo o endógena proteínas de B. subtilis 26. Assim, este método pode também ser aplicado para purificar recombinante HP-NAP expressa em outros hospedeiros bacterianos.
Vários métodos têm sido relatados para a purificação do HP-NAP recombinante na sua forma nativa 14-16. No entanto, um passo de cromatografia de filtração em gel adicional é necessário para se obter HP-PNA em alta pureza. Esta purificação cromatográfica negativo pode eficientemente produzir funcional recombinante HP-NAP com elevado grau de pureza em uma única etapa. em additina, o passo de dessalinização não é necessário devido à baixa concentração de sal na fracção não ligada. A purificação do modo de lote também poderia obviar a necessidade de uma coluna. Assim, este modo de cromatograf ia em lotes negativo utilizando uma resina DEAE oferece um método simples e eficiente para purificar HP-HAP na sua forma nativa com elevado rendimento e pureza. HP-NAP purificada por este método poderá ainda ser utilizado para o desenvolvimento de vacinas, novas drogas e diagnósticos para H. pylori relacionados com doenças ou por outras novas aplicações terapêuticas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
- Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
- de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
- Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
- Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
- Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
- Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
- Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
- Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
- Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
- Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
- Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
- Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
- Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
- Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
- Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
- Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
- Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
- Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
- Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
- Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
- Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).
