Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של Published: June 18, 2016 doi: 10.3791/54043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Institute of Molecular and Cellular Biology, National Tsing Hua University, 2Department of Life Science, National Tsing Hua University

Summary

שיטת תשואה גבוהה לטיהור שלילית חד-שלבית של רקומביננטי הליקובקטר פילורי חלבון ההפעלה-נויטרופילים (HP-NAP) ביתר coli Escherichia באמצעות שרפי diethylaminoethyl במצב תצווה מתואר. HP-NAP מטוהר בשיטה זו מועיל לפיתוח של חיסונים, תרופות, או אבחון עבור H. פילורי -associated מחלות.

Abstract

חלבון הליקובקטר פילורי הפעיל-נויטרופילים (HP-NAP) היא גורמת ארסיויות גדולות של הליקובקטר פילורי (H. pylori). הוא ממלא תפקיד קריטי H. פילורי -induced דלקת קיבה ידי הפעלת מספר לויקוציטים מולד כולל נויטרופילים, מונוציטים, ותאי פיטום. מאפייני immunogenic ואת המערכת החיסונית של HP-NAP הופכים אותו למועמד אבחון חיסון פוטנציאל H. פילורי ומועמד תרופה חדשה לטיפול בסרטן. על מנת לקבל כמויות ניכרות של NAP HP המטוהר המשמש ליישומים הקליניים שלה, שיטה יעילה לטהר חלבון זה עם תשואה וטוהרת גבוהות צריכה להיות הוקם.

בפרוטוקול זה, שתיארנו שיטה לטיהור chromatographic שלילית חד-שלבית של NAP HP רקומביננטי ביתר Escherichia coli (E. coli) באמצעות diethylaminoethyl (DEAE) חילופי יונים בעזרת שרפים (למשל., Sephadex) iבמצב יצווה n. HP-NAP רקומביננטי מהווה כמעט 70% של החלבון הכולל ב E. coli, והוא התאושש כמעט לחלוטין בשבריר מסיס על תמוגה התא ב- pH 9.0. תחת במצב אופטימלי ב- pH 8.0, רוב HP-NAP הוא התאושש בשבריר מאוגד בעוד חלבונים אנדוגניים מ E. coli מוסרים ביעילות על ידי שרף.

שיטת טיהור זה באמצעות כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עם שרפי יון-חילוף DEAE מניב HP-NAP ומתפקד מ E. coli בצורתו המקורית עם תשואה וטוהר גבוהה. HP-NAP מטוהרים יכול להיות מנוצל נוספת עבור מניעה, טיפול, ופרוגנוזה של H. פילורי -associated מחלות כמו גם בטיפול בסרטן.

Introduction

הליקובקטר פילורי (H. pylori) הוא גורם עיקרי של גסטריטיס כיב פפטי. חיידק זה גם סווג קרצינוגן בבני אדם על ידי הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן, כחלק מארגון הבריאות העולמי, בשנת 1994. הערכה היא כי השכיחות של H. זיהום פילורי הוא 70% במדינות המתפתחות ו 30-40% במדינות המתועשות 1. למרות שיעור הזיהום של H. פילורי הולך ופוחת במדינות המתועשות, שיעור הזיהום של H. פילורי במדינות המתפתחות עדיין גבוה 2. הטיפול המקובל למגר H. זיהום פילורי מורכב של המינהל מעכב משאבת פרוטונים, PPI, ושני אנטיביוטיקה, clarithromycin בתוספת אמוקסיצילין או metronidazole 3. עם זאת, העלייה של עמידות לאנטיביוטיקה ב H. פילורי -related טיפול כיב קורא לפיתוח אסטרטגיות חדשות כדי למנוע or לרפא את הזיהום. פיתוח של חיסון מונע ו / או טיפולי נגד H. פילורי יכול לספק גישה חלופית לשלוט H. זיהום פילורי.

חלבון הליקובקטר פילורי הפעיל-נויטרופילים (HP-NAP), גורם ארסיויות גדולות של הליקובקטר פילורי, זוהה לראשונה בשנת תמציות מים של H. פילורי עם היכולת להפעיל נויטרופילים לדבוק לתאי אנדותל ולהפיק (reactive oxygen species ROS) 4. חדירת נויטרופילים של רירית הקיבה למצוא במאמרם של ה' pylori- חולים שנדבקו עם גסטריטיס פעיל עלול לגרום לדלקת ולנזק ברקמות של הקיבה. לפיכך, HP-NAP עשוי לשחק תפקיד פתולוגי ידי הפעלת נויטרופילים לגרום דלקת קיבה, אשר עוד גורם כיב או H. פילורי -associated מחלות קיבה. אף על פי כן, HP-NAP הוא מועמד פוטנציאלי עבור יישומים קליניים 5,6. בשל פרו immunogenic ואת המערכת החיסוניתperties של HP-NAP, חלבון זה יכול לשמש כדי לפתח חיסונים, סוכנים טיפוליים, וכלי אבחון. ניסוי קליני נערך לשימוש רקומביננטי HP-NAP כאחד המרכיבים של חיסון חלבון נגד H. פילורי. חיסון זה מורכב רקומביננטי HP-NAP, גן הקשור-cytotoxin (cagA), ו- A cytotoxin vacuolating (Vaca) חלבונים גיבש עם הידרוקסיד אלומיניום הודגמה עוד יותר כדי להיות בטוח immunogenic בבני אדם 7. כמו כן, HP-NAP משמש immunomodulator חזק כדי לעורר T מסייעים מסוג 1 (Th1) -polarized התגובה החיסונית לטיפול בסרטן 8 וכדי למטה לווסת את התגובות החיסוניות בתיווך Th2 שהושרו על ידי תגובות אלרגיות וזיהומים טפיליים 9,10. באשר אבחון, רקומביננטי HP-NAP המבוסס ELISA יושם לאיתור נוגדנים בנסיוב נגד HP-NAP ב- H. פילורי -infected חולים 11. מחקר אחד הראה כי רמת נוגדנים-NAP הספציפי של HP ב- סר מן H. pyלורי -infected בחולים עם סרטן קיבה היה גבוה משמעותית מזה של חולים עם דלקת קיבה כרונית 12. גם מחקר אחר הראה כי נוגדנים בנסיוב נגד HP-NAP המשויכים בנוכחות אדנוקרצינומה בקיבה הלא הקיבה 13. לפיכך, רקומביננטי HP-NAP המבוסס ELISA ניתן להחיל לאיתור נוגדנים בנסיוב נגד HP-NAP עבור הפרוגנוזה של סרטן קיבה אצל ח פילורי -infected חולים. יחדיו, HP-NAP מטוהרים יכול להיות מנוצל נוספת עבור מניעה, טיפול, ופרוגנוזה של H. פילורי -associated מחלות כמו גם בטיפול בסרטן.

בין מספר השיטות השתמשו לטיהור רקומביננטי HP-NAP לידי ביטוי Escherichia coli (E. coli) בצורתו המקורית שדווח עד כה, צעד טיהור שני כרומטוגרפיה ג'ל-סינון מעורב נדרש כדי להשיג מאוד טהור HP-NAP 14-16 . כאן, שיטה באמצעות כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עםdiethylaminoethyl (DEAE) חילופי יונים בעזרת שרפים מתוארים לטיהור HP-NAP ביתר E. coli עם תשואה גבוהה וטוהר גבוה. טכניקת טיהור זו התבססה על הכריכה של חלבוני תא מארח ו / או זיהומים אחרים מאשר HP-NAP שרף. בשעת 8.0 pH, כמעט ללא חלבונים אחרים למעט HP-NAP הם התאוששו מן השבר המאוגד. גישת טיהור זה באמצעות כרומטוגרפיה יון-חילוף DEAE במצב שלילי היא פשוט חוסך זמן בכך שהוא מאפשר טיהור של HP-NAP רקומביננטי באמצעות כרומטוגרפיה צעד אחד באמצעות האיסוף של השבריר המאוגד. בנוסף HP-NAP, כמה ביומולקולות אחרים, כגון וירוסים 17, אימונוגלובולין G (IgG) 18, המוגלובין 19, phosphatase חלבון 20, ו גורם ארסיות flagellin 21, דווחו גם להיטהר על ידי כרומטוגרפיה-חילוף יונים בנגטיב מצב. המצב השלילי עדיף כרומטוגרפיה יון-חילופי אם זיהומים הם הקטיןרכיבים נוכחיים במדגם הנתון להיטהר 22. היישום של כרומטוגרפיה שלילית בטהרת ביומולקולות טבעית או רקומביננטי נבדק לאחרונה 23.

הדו"ח הנוכחי מספק צעד אחר צעד פרוטוקול עבור ביטוי רקומביננטי HP-NAP ב E. coli, תמוגה של התאים, וטיהור-NAP HP באמצעות כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עם שרפי יון-חילוף DEAE. אם החלבון הרצוי לטיהור מתאים כרומטוגרפיה-חילוף יונים במצב שלילי, פרוטוקול המתואר יכול גם להיות מותאם כנקודת מוצא לפיתוח של תהליך טיהור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דם אדם נאסף מתנדב בריאים עם הסכמה מדעת ובכתב אישור דירקטוריון הסקירה המוסדית של האוניברסיטה הלאומית צינג הואה, Hsinchu, טייוואן.

הביטוי 1. רקומביננטי HP-NAP ב E. coli

  1. הכן את pET42a-NAP פלסמיד המכיל את רצף ה- DNA של HP-NAP מ H. פילורי 26,695 זן כפי שתואר לעיל 16. הכן את פלסמידים המכילים את רצף ה- DNA של HP-NAP עם מוטציות נקודתיות הרצויות כמתואר (ראה פרוטוקול, שלב 8).
  2. Transform 10 ng של פלסמידים DNA הנ"ל לתוך E. BL21 coli (DE3) תאים המוסמכת על ידי הלם חום במשך 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס, פס התאים על מרק lysogeny (LB) אגר צלחות המכילות 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin, דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
  3. לחסן מושבות אחת צינורות בודדים המכיל 5 מ"ל של מרק LB עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin ולגדל אותם כמו precultures ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות עם רועד ב 170 סל"ד.
  4. לחסן 2 מ"ל של תאים טרום התרבות הנ"ל לתוך 200 מ"ל של מרק LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin בבקבוק L 1. דגירת בקבוק התרבות המחוסנת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות עם הרועד ב 170 סל"ד עד הספיגה ב 600 ננומטר ומגיע לכ 0.4-0.5 זוהה על ידי ספקטרופוטומטר UV / VIS.
  5. הוסף 80 μl של 1 M איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לתוך התרבות מעל לריכוז סופי של 0.4 מ"מ כדי להשרות את הביטוי של HP-NAP. דגירת ההתרבות עבור 3 שעות עד הספיגה ב 600 ננומטר ומגיע לכ 1.6-1.7.
  6. צנטריפוגה התאים ב 6000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להסיר את supernatant. אחסן את התא גלולה ב -70 ° C עד לטיהור.

2. הכנת שבר חלבון מסיס המכיל HP-NAP

הערה: כל הצעדים הבאים מתבצעים על 4 מעלות צלזיוס.

  1. Resuspend 50 מ"ל של התא pellet מוכן בשלב פרוטוקול 1.6 ב 20 מ"ל של 20 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM NaCl המכילים פלואוריד 0.13 מ"מ phenylmethylsulfonyl (PMSF), 0.03 מ"מ N-אלפא-Tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK), ו 0.03 מ"מ N-Tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) בשעה 4 מעלות צלזיוס כפי שתואר לעיל 16.
  2. לשבש את תאי חיידקים על ידי העברת ההשעיה חיידקי באמצעות homogenizer בלחץ גבוה פעל בטווח של 15,000 עד 20,000 psi במשך 7 פעמים ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. צנטריפוגה lysate התא g 30,000 × ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להפריד את השברים חלבון מסיסים ובחלקם לא מסיסים באמצעות ultracentrifuge. מעביר את supernatant כמו שבר החלבון המסיס כדי מבחנה.
  4. למדוד את ריכוז החלבון של שבר החלבון המסיס בשיטה ברדפורד באמצעות ערכה מסחרית עם אלבומין בסרום שור (BSA) כתקן לפי הוראות היצרן.
  5. הוסף 177.6 μl של 1 N HCl לתוך 20 מ"ל של הדואר חלבון מסיס חלק המתקבל פרוטוקול צעד 2.3 להתאים ערך ה- pH שלה pH 9.0 ל 8.0 pH.
  6. הוסף 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl לפתרון חלבון לעיל כדי להפוך את ריכוז החלבון הסופי להיות 0.5 מ"ג / מ"ל.

טיהור 3. רקומביננטי HP-NAP מ E. coli על ידי כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עם שרפי DEAE יון-חליפין

  1. כן 15 מיליליטר של שרפי DEAE.
    1. תשקלי 0.6 גרם אבקה יבשה של שרפים DEAE ולהשעות אותו 30 מ"ל של 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl בטמפרטורת החדר למשך יום 1 לפחות.
    2. צנטריפוגה שרף ב 10,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
    3. הסר להתעלמות supernatant.
    4. הוסף 15 מ"ל של 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl.
    5. חזור על פרוטוקול צעדים 3.1.2 ל 3.1.4 עוד ארבע פעמים.
    6. אחסן את 15 מ"ל התיישבו שרף (slurry 50% ב 30 מ"ל טריס חיץ) בשעה 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: כל הצעד הבאהים מתבצעים על 4 מעלות צלזיוס.
  2. להוסיף 45 מ"ל של חלבונים מסיסים מוכן בשלב פרוטוקול 2.6 15 מ"ל של שרף ומערבבים את התערובת הדלילה חלבון / שרף עם בוחש מגנטי ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  3. יוצקים את התערובת הדלילה חלבון / שרף לתוך עמוד פלסטיק או זכוכית מצויידות ברזלים. אפשר שרף להתיישב תחת כוח הכבידה.
  4. פתח את השסתום לאפשר פתרון החלבון לרוץ דרך הטור ידי זרימת כוח הכביד עד רמת הנוזל בעמודה היא בדיוק מעל השרף. אסוף את הזרימה דרך השבר המאוגד, אשר מכיל את HP-NAP המטוהר.
  5. הוסף 15 מ"ל של 20 קר כקרח mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl לתוך הטור.
  6. פתח את השסתום לאפשר החיץ לשטוף לרוץ דרך הטור ידי זרימת כוח הכביד עד רמת הנוזל בעמודה היא בדיוק מעל השרף. אסוף את הזרימה דרך השבר לשטוף.
  7. חזור על פרוטוקול צעדים 3.5 ל 3.6 ארבע פעמים נוספות כדי לאסוף את השברים לשטוף נוספים.
  8. הוסף 15 מ"ל של 20 קר כקרח mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl לתוך עמוד.
  9. פתח את השסתום לאפשר למאגר elution לרוץ דרך הטור ידי זרימת כוח הכביד עד רמת הנוזל בעמודה היא בדיוק מעל השרף. אסוף את הזרימה דרך שבר elution.
  10. חזור על פרוטוקול צעדים 3.8 ל 3.9 ארבע פעמים נוספות כדי לאסוף את השברים elution נוספים.

4. ההצפה Exchange ו- הסרת אנדוטוקסינים של NAP HP מטוהרת על ידי כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עם שרפי DEAE

הערה: HP-NAP מטוהר לידי ביטוי E. coli צריך להיות נתון חיץ חליפין וסר רעלן פנימי לפני לעורר נויטרופילים.

  1. בצע דיאליזה כדי לשנות את החיץ של HP-NAP המטוהר שנאגר מלוח פוספט של Dulbecco (D-PBS), pH 7.2, ב 4 ° C. באמצעות צינורות דיאליזה עם הפסקת משקל מולקולרית של 14 kDa כפי שתואר לעיל 24.
  2. סנן את HP-NAP dialyzed באמצעות syringמסנן דואר עם קרום חיובי טעונים, הידרופילי מצורף מזרק חד פעמי 20 מ"ל ב ספיקות החל 2.5 ל 4 מ"ל / דקה ב 4 ° C כדי להסיר רעלן פנימי.

אפיון 5. המאפיינים המולקולריים של המטוהרים רקומביננטי HP-NAP ידי נתרן Dodecyl סולפט-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE), מערבי סופג, שפה-PAGE, כרומטוגרפיה סינון ג'ל, ומתארים dichroism ספקטרוסקופיה

  1. נתח את HP-NAP מטוהרים רקומביננטי על ידי SDS-PAGE ו המערבי סופג עם supernatants תרבות hybridoma המכיל נוגדנים חד שבטיים העכבר MAb 16F4 25 כפי שתואר לעיל 24.
  2. נתח את HP-NAP מטוהרים על ידי-עמוד יליד כרומטוגרפיה סינון ג'ל לבחון מצב oligomeric שלה כפי שתואר לעיל 26.
  3. נתח את HP-NAP רקומביננטי מטוהר על ידי ספקטרוסקופיה dichroism המעגלי לבחון מבנה המשני שלה כפי שתואר לעיל 26.

6. הערכה הטוהרת-NAP HP ידי כסף המכתים של ג'ל SDS-PAGE

  1. הכן את הפתרון לתקן, רגישות פתרון, פתרון כסף, פיתוח פתרון, להפסיק פתרון, ופתרון כביסה בהתאם להוראות היצרן של ערכת צביעת כסף.
  2. בצע צביעת כסף של ג'ל SDS-PAGE פי הוראות היצרן של ערכת צביעת כסף.
  3. רוכש את התמונה של הג'ל עם מערכת הדמיה.

מדידת 7. של ROS ייצור נויטרופילים מושרה על ידי HP-NAP

  1. לבודד נויטרופילים אדם מדם אנושי heparinized ידי שקיעת dextran ואחריו צנטריפוגה שיפוע צפיפות כפי שתואר לעיל 24.
  2. מדידת ייצור ROS מ נויטרופילים מגורים עם HP-NAP באמצעות assay chemiluminescence התלוי לומינול.
    1. הפעל קורא צלחת ולהגדיר את הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס. הוסףצלחת תחתונה 96-גם לבן שטוח ריק בתוך החדר קורא צלחת, שמאפשרת לו להתחמם עד 37 מעלות צלזיוס.
    2. מכינים את תערובת גירוי ב D-PBS, pH 7.2, המכיל 0.9 מ"מ 2 CaCl, 0.5 מ"מ MgCl 2, ו -13.3 מיקרומטר 5-אמינו-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione (לומינול) עם נוכחות והיעדרות של 0.67 HP-NAP מיקרומטר-הסיר רעלן פנימי שהוכן צעד פרוטוקול 4.2.
    3. התאם את הריכוז של נויטרופילים האדם מוכן משלב פרוטוקול 7.1 2 x 10 6 תאים / מ"ל ב D-PBS, pH 7.2, המכיל 5 גלוקוז מ"מ.
    4. הוסף 50 μl של השעיה נויטרופילים לבאר כל 96-גם בעוד הצלחת.
    5. להוסיף 150 μl של תערובות הגירוי מוכנות משלב פרוטוקול 7.2.2 לתוך נויטרופילים המכילים גם במרווח זמן של 5 שניות לכל טוב.
    6. מדוד את פליטת chemiluminescence במשך 5 שניות לכל טוב על פני תקופה של שלוש שעות באמצעות קורא צלחת.

8.בניית DNA פלסמידים מחסה HP-NAP מוטאנטים ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוססת mutagenesis אתר הישיר

הערה: mutagenesis באתר-ישיר המבוסס PCR נוצר בעצם כפי שתואר לעיל 27, למעט עובדת אתרי ההגבלה "השקטים" הוכנסו פריימרים mutagenesis ידי mutagenesis באתר ביים (SDM) -assist תוכנת 28.

  1. בצע תגובת PCR.
    1. הוסף 10 ng של פלסמיד pET42a-NAP, 1 מיקרומטר של זוגות פריימר mutagenesis המפורטות בטבלה 1, 200 מיקרומטר של triphosphates deoxynucleoside (dNTPs), ו -3 יחידות של תמהיל האנזים באיכות גבוהה PCR לתוך צינור PCR המכיל מים ללא יונים, נותן הסופי נפח של 25 μl.
    2. ליזום את מחזורי PCR ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לפגל את תבנית ה- DNA, ופעל עם 12 מחזורים הגברה ב 95 מעלות צלזיוס למשך דקה 1, T מ 'לא -5 ° C למשך דקה 1, ו -72 o צלזיוס במשך 6 דקות.
    3. לסיים את מחזורי PCR עםצעד חישול ב T מ 'עמ -5 מעלות צלסיוס דקה 1 צעד הארכה על 72 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. פנקו 15 μl של מוצר ה- PCR עם 0.4 μl של אנזים הגבלה DPN אני על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ולאחר מכן לנתח 2 μl של המוצר PCR שטופלו שאני DPN ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose.
  3. מוטציות מסך.
    1. Transform 2 μl של המוצר PCR לתוך E. coli DH5α תאים המוסמכת על ידי הלם חום במשך 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס.
    2. מורחים את התאים טרנספורמציה על צלחת LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
    3. לבודד את ה- DNA פלסמיד מן מושבות חיידקים באמצעות ערכת תמוגה אלקליין מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן.
    4. פנקו את ה- DNA פלסמיד מבודד בשלב פרוטוקול 8.3.3 עם אנזים הגבלה XhoI כדי לאמת את הנוכחות של מוטציה שקטה הרצוי על פי פרוטוקול של היצרן.
    5. ברצףפלסמיד דנ"א מאומת על ידי צעד פרוטוקול 8.3.4 עם פריימר אמרגן T7 כדי לאשר את התיקון של רצפי הקידוד של מוטציות HP-NAP על פי הפרוטוקול של היצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תרשים סכמטי של הליך ניסיוני של טיהור השליליות של רקומביננטי HP-NAP לידי ביטוי E. coli באמצעות חילופי יונים בעזרת שרפי DEAE במצב תצווה מוצג באיור 1. טכניקת טיהור זה מבוסס על הכריכה של חלבוני תא מארח ו / או זיהומים אחרים מאשר HP-NAP שרף. ב- pH 8.0, כמעט ללא חלבונים אחרים למעט HP-NAP בצורה המקורית שלו הם התאוששו מן השבר המאוגד (איור 2 א 'וב'). HP-NAP מטוהר בשבריר המאוגד היה immunodetected ידי הנוגדן נגד HP-NAP (איור 2 ג), והטוהר שלה היה גבוהה מ 97% כפי שאושר על ידי צביעת כסף (איור 2 ד). בנוסף, HP-NAP רקומביננטי מטוהרים שמר טופס oligomeric שלה כמו מנותח על ידי-עמוד הילידים (איור 2 ב) ו כרומטוגרפיה סינון ג'ל (איור 3 א). spectroscop dichroism המעגליניתוח ic הראה כי החלבון המטוהר הורכב בעיקר-סלילי α (איור 3 ב). כמו כן, HP-NAP המטוהר היה מסוגל מגרת נויטרופילים אדם לייצר ROS (איור 3 ג). לפיכך, HP-NAP רקומביננטי מטוהר על ידי גישה זו הוא בצורתה המקורית בעלי פעילות ביולוגית. יתר על כן, כרומטוגרפיה אצווה מצב שלילי זה יכול לשמש כדי לטהר HP-NAP רקומביננטי עם מוטציות נקודתיות בצעד אחד. כפי שניתן לראות בתרשים 4, שני רקומביננטי HP-NAP Y101H ו- HP-NAP E97GY101H מוטנטים, המחקה את פעולת HP-NAP של H. פילורי NCTC 11639 ו NCTC 11,637 זנים, בהתאמה, היו מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה אצווה מצב שלילי זה עם טוהר גבוה מ -95%.

לביצוע כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי באמצעות שרפי DEAE לטהר HP-NAP, ערך ה- pH של למאגר המשמש לטיהור צריך להיות מותאם 8.0על מנת להבטיח כי הרוב המכריע של HP-NAP שוהה חלק מאוגד. כמות פחותה של NAP HP נכחה שברים המאוגדים כאשר ערך ה- pH של למאגר היה גבוה או נמוך מ 8.0 (איור 5). למרות הטוהר נוכחי HP-NAP את השברים המאוגדים הוגדל רק קצת כמו pH עלה מ 7.0 כדי 9.0, בסך של הווה HP-NAP את השברים המאוגדים היה הגבוה ביותר כאשר ערך ה- pH של למאגר היה pH 8.0 (איור 5). כמות החלבונים המסיסים מ lysates התא הועמסו על השרף הוא גורם חשוב נוסף עבור טיהור זה. הנה, היחס הוא 1.5 מ"ג של חלבונים לכל שרף למיליליטר להשגת קיבולת מרבית של השרף לספוג את זיהומי E. coli (איור 6). בנוסף, טוהר ואת התשואה של HP-NAP מתקבל על ידי כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי זה יכולים להיות גדל באופן משמעותי על ידי הגדלת כמות ה- HP-NAP בשבריר המסיס שלE. coli lysates. HP-NAP רקומביננטי כמעט החלים לחלוטין בשבריר מסיס על תמוגה התא ב- pH 9.0 (איור 7). למרות המסיסות של רקומביננטי HP-NAP ב E. coli lysates הוגדל באופן ניכר כאשר התאים היו lysed במאגר עם pH גבוה מ -7.5 (איור 7), פחות מ -90% של NAP HP נכח כמו חלבון מסיס כאשר התאים היו lysed במאגר עם pH נמוך מ 9.0.

איור 1
איור 1:. מתאר סכמטי של הטיהור השלילית של HP-NAP ידי DEAE שרפה במצב יצווה הטיהור מתחילה עם הליך יצווה מחייב. שבר החלבון המסיס המכיל HP-NAP המתקבל lysates חיידקים מתווסף שרף DEAE-equilibrated מראש עם טריס חיץ ב- pH 8.0. החלבונים / slurries שרף מודגרת אז על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. עם mixi עדיןng. במהלך הדגירה, חלבוני התא מארח לאגד את השרף. HP-NAP נוכח השבר המאוגד מתקבל על ידי אחד איסוף supernatant לאחר צנטריפוגה או שבר הזרימה דרך מעמודה מנוהלת על ידי זרימת כוח הכביד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. למופת תוצאה של טיהור של HP-NAP ידי כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עם שרפי DEAE יון-חליפי lysate התא כולו (W) שברי חלבון מסיס (S) של E. BL21 coli (DE3) להביע HP-NAP ואת חלק מאוגד (U) המכיל HP-NAP מ כרומטוגרפיה יון-חילופי DEAE נותחו על ידי SDS-PAGE (א),-עמוד הילידים (B), ומערב סופג (C). Frac המאוגדtion עם הכמות המצוינת של חלבונים הנעים בין 1 מיקרוגרם ל -10 מיקרוגרם נותח על ג'ל כסף מוכתם SDS-PAGE (D). המונים מולקולריים (M) ב kDa מסומנים בצד השמאל של ג'ל מוכתם ואת הכתם. (מעובד מתוך התייחסות 24) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: מבניים אפיון פונקציונלי של NAP HP רקומביננטי מטוהרים מן E. coli על ידי כרומטוגרפיה אצווה מצב שלילי. (א) פרופיל ספיגת UV נרשמה-NAP HP eluted מעמודה סינון ג'ל. ההמונים המולקולרי של סמנים חלבוניים צוינו על הכרומתוגרמה. (ב) spect dichroism המעגלית הרחוק UVרום של NAP HP נרשם בטווח אורכי הגל של 195 כדי 260 ננומטר. (C) נויטרופילים אנוש (1 x 10 5 תאים) טופלו 0.5 מיקרומטר HP-NAP ו- D-PBS, pH 7.2, כביקורת שלילית על 37 מעלות צלזיוס. התוכן של ROS המופק נויטרופילים נמדד באופן רציף באמצעות assay chemiluminescence התלוי לומינול. נתונים היו מיוצגים כממוצע ± סטיית תקן של ניסוי בשלושה עותקים. (מעובד מתוך התייחסות 24) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: טיהור של מוטאנטים רקומביננטי HP-NAP מתבטא E. coli על ידי כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי. שברי החלבון המסיסים של E. BL21 coli (DE3) המבטאים שני רקומביננטי HP-NAP Y101H ו- HP-NAP מוטציות E97GY101H ו wild-type HP-NAP היו מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה במצב שלילי עם שרפים DEAE. שהברים המאוגדים נותחו על ידי SDS-PAGE. המונים מולקולריים (M) ב kDa מסומנים בצד השמאל של ג'ל מוכתם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: שפעת ה- pH הציף על טיהור של רקומביננטי HP-NAP מתבטאת E. coli על ידי כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי. השבר המסיס של E. BL21 coli (DE3) להביע HP-NAP lysed ב 9.0 pH הותאמו pH המצוין החל 7.0 ל 9.0 וכן ריכוז החלבון של 0.3 מ"ג / מ"ל. אלה מותאמיםשברים, הצביעו כפי עומס, הועמסו אז על שרפי DEAE לטהר HP-NAP רקומביננטי ידי כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי ב 4 ° C.. המאוגד, לשטוף, ושברי elution נותחו על ידי SDS-PAGE. המונים מולקולריים (M) ב kDa מסומנים בצד השמאל של ג'ל המוכתם. (מעובד מתוך התייחסות 24) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: השפעת כמות חלבוני זוגות הועלתה על DEAE שרפה עבור הטיהור רקומביננטי HP-NAP מתבטא E. coli. שברי החלבון המסיסים של E. BL21 coli (DE3) HP-NAP להביע הועמסו שרפים DEAE פי היחס המצוין של חלבונים מ"ג למיליליטר של שרפים לטהר recombinant HP-NAP ידי כרומטוגרפיה אצווה מצב שלילי ב- pH 8.0. החלבונים המסיסים, הצביעו כפי עומס (L), את החלק יחסי המאוגד (א), לשטוף חלק (ב), שברי elution (C) נותחו על ידי SDS-PAGE. המונים מולקולריים (M) ב kDa מסומנים בצד השמאל של ג'ל המוכתם. (מתוך התייחסות 24) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7: השפעת pH על המסיסות של HP-NAP ב E. coli Lysates. (א) א BL21 coli (DE3) הושעה HP-NAP להביע במאגר קר כקרח Tris-HCl על pH המצוין החל 7.0 ל -9.5. התאים היו lysed ואז כל lysates תא (W) היו centrifuged to להפריד שברים מסיסים (S) וכדוריות מסיסות (I). החלבונים נותחו על ידי SDS-PAGE. המונים מולקולריים (M) ב kDa מסומנים בצד השמאל של ג'ל המוכתם. (B) אחוז המסיסות של רקומביננטי HP-NAP של lysate התא כולו בכל pH חושב מעוצמת להקת HP-NAP על ג'לים SDS לשבריר המסיס (S) מחולק שעבור lysate התא כולו (W ). נתונים היו מיוצגים כממוצע ± סטיית תקן של שני ניסויים לפחות. (מתוך התייחסות 24) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שולחן 1
טבלה 1: Primers משמש mutagenesis. אנא CLאיכס כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כרומטוגרפיה תצווה המצב השלילית עם שרפים-אניוני DEAE המוצגת כאן היא מתאימה טיהור רקומביננטי HP-NAP ביתר coli E. ערכי ה- pH של המאגרים המשמשים מדרגות תמוגה תא וטיהור מאוד קריטיים כדי להבטיח את המסיסות של HP-NAP ב E. lysates coli ו הפרדה יעילה של-NAP HP רקומביננטי מן הטומאות התא המארח, בהתאמה. יש lysed תאי חיידקיים ב- pH 9.0, והטיהור השלילית צריכה להתבצע ב- pH 8.0 כדי להשיג-NAP HP בתשואה גבוהה וטוהר גבוה. התאוששות אופיינית של HP-NAP היא 90%, וטוהר טיפוסי הוא 95% 24. מאז HP-NAP שוהה חלק מאוגד, כמות מינימלית אך מספקת של שרף צריך לשמש כדי להשיג קיבולת מקסימלית שלה לספוג את הזיהומים. במקרה שלנו, את יכולת הטעינה המרבית היא 1.5 מ"ג של חלבונים המסיסים מ E. lysates coli לכל שרף למיליליטר.

proviפרוטוקול ded מיועד טיהור רקומביננטי HP-NAP מתוך 50 מ"ל E. תרבות coli. התשואה של HP-NAP היא סביב 15 מ"ג. תהליך הטיהור או ניתן מוקטן או לשנותם למעלה בהתאם. לדוגמה, מוטציות שני E97GY101H רקומביננטי HP-NAP Y101H ו- HP-NAP היו מטוהרים מתוך 1 מ"ל E. תרבות coli באמצעות כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי זה. שניהם מוטציות HP-NAP עם טוהר גבוה מ -95% התקבלו על ידי איסוף השבר המאוגד (איור 4). כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי זה הוחלה גם לטהר HP-NAP רקומביננטי מתוך 860 מיליליטר E. תרבות coli. ההתאוששות של הצעד באמצעות כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי DEAE הגיעה 97% עם טוהר גבוה מ -90%.

HP-NAP לידי ביטוי subtilis בצילוס (ב subtilis) גם טוהר בהצלחה על ידי כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי DEAE זהבאחד צעד 26. ב B. שלנו מערכת ביטוי subtilis, את רמת הביטוי של HP-NAP היא נמוכה. HP-NAP מהווה רק כ -5% של חלבונים מסיסים הכוללים מן lysates החיידקים. למרות HP-NAP ממוקד עבור טיהור שוהה כמות קטנה, HP-NAP עם טוהר גבוה מ -90% ניתן להשיג על ידי צמצום היחס בין כמות חלבונים מן lysates תא הועמסו על שרף להסיר ביעילות כמעט כל אנדוגני חלבונים מן B. subtilis 26. לכן, שיטה זו עשויה לחול גם על לטהר HP-NAP רקומביננטי לידי ביטוי מארח חיידקים אחרים.

מספר שיטות דווחו לטיהור-NAP HP רקומביננטי בצורתו המקורית 14-16. עם זאת, צעד chromatographic סינון ג'ל נוסף נדרש כדי להשיג HP-NAP בטהרה גבוהה. טיהור chromatographic שלילית זה יכול להניב ביעילות-NAP HP הפונקציונלי רקומביננטי עם טוהר גבוה בצעד אחד. בשנת additiעל, הצעד התפל אינו נחוץ בשל ריכוז המלח הנמוך בשבריר המאוגד. טיהור במצב אצווה יכול גם לייתר את הצורך טור. לפיכך, כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי זה באמצעות שרף DEAE מציעה שיטה פשוטה ויעילה לטהר HP-HAP בצורתו המקורית עם תשואה וטוהרת גבוהים. HP-NAP מטוהרים על ידי שיטה זו יכולה להיות מנוצל נוסף לפיתוח של חיסונים, תרופות חדשות, ואבחון עבור H. פילורי -related מחלות או טיפולי יישומים חדשים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
pET42a-NAP  N/A N/A prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3) Thermo Fisher Scientific Inc C6000-03 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
Kanamycin Amresco 25389-94-0 http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) MD Biomedical Inc 101-367-93-1 http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name
=IPTG%20
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich 10837091001 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) Sigma-Aldrich T7254 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) Sigma-Aldrich T4376 protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW
Protein standard (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich P5619  a standard protein for Bio-Rad Protein Assay
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW
DEAE–Sephadex  A-25 chloride form Sigma-Aldrich A25120 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW
Spectrum/Por dialysis tubing Spectrum Laboratories 132720 with molecular weight cutoff of 14 kDa
http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Acrodisc® units with Mustang® E membrane Pall MSTG25E3 for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min
http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
mouse monoclonal antibody MAb 16F4 N/A N/A raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;  A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare Life Sciences 28989335 for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
PlusOne silver staining kit, protein GE Healthcare Life Sciences 17-1150-01 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17-1440-02 for density gradient centrifugation to purify human neutrophils
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963/17144002
Flat bottom 96-well white plate Thermo Fisher Scientific Inc 236108 http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
Luminol Sigma-Aldrich A8511 protected from light
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW
Expand  long template PCR system Sigma-Aldrich 11681834001 source of High Fidelity PCR enzyme mix
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW
Dpn I New England Biolabs R0176S https://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I New England Biolabs R0146S https://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5α Thermo Fisher Scientific Inc 18265-017 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
Name Company Product Number Comments
Equipment
 
U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer Hitachi  N/A out of market and upgraded to a new model
http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer Avestin Inc C315320 http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge Hitachi Koki Co 90106401 for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates
http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
ÄKTA FPLC GE Healthcare Life Sciences 18-1900-26 for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv model 62ADS CD spectrophotometer Aviv Biomedical N/A out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php
LAS-3000 imaging system Fujifilm N/A discontinued and replaced
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter Perkin-Elmer 1420-018 for chemiluminescence detection
http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
  2. Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
  3. Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
  4. Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
  5. Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
  6. de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
  7. Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
  8. Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
  9. Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
  10. Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
  11. Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
  12. Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
  13. Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
  14. Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
  15. Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
  16. Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
  17. Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
  18. Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
  19. Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
  20. Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
  21. Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
  22. Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
  23. Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
  24. Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
  25. Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
  26. Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
  27. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
  28. Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).

Tags

אימונולוגיה גיליון 112 HP-NAP, DEAE כרומטוגרפיה שלילית חלק מאוגד כרומטוגרפיה יצווה,
צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; חלבון נויטרופילים-הפעלת ביתר<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; במצב אצווה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuo, T. Y., Hong, Z. W., Tsai, C.… More

Kuo, T. Y., Hong, Z. W., Tsai, C. C., Yang, Y. C., Fu, H. W. One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode. J. Vis. Exp. (112), e54043, doi:10.3791/54043 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter