Abstract
Nous décrivons un faible coût, morbidostat configurable pour caractériser la voie de l'évolution de la résistance aux antibiotiques. Le morbidostat est un dispositif de culture bactérienne qui surveille en permanence la croissance bactérienne et ajuste la concentration du médicament à récuser en permanence les bactéries à mesure qu'ils évoluent pour acquérir une résistance aux médicaments de façon dynamique. L'appareil dispose d'un volume de travail de ~ 10 ml et est entièrement automatisé et équipé de la mesure de la densité optique et micro-pompes à moyen et à la délivrance de médicaments. Pour valider la plate - forme, nous avons mesuré l'acquisition progressive de la résistance triméthoprime dans Escherichia coli MG 1655 et intégré de l'appareil avec une plate - forme microfluidique multiplexé pour étudier la morphologie des cellules et la sensibilité aux antibiotiques. L'approche peut être mise à échelle des études de laboratoire de la résistance aux antibiotiques, et est prorogeable adaptatifs évolution des améliorations de contrainte dans l'ingénierie métabolique et d'autres expériences de culture bactérienne.
Introduction
Depuis l'introduction de la première pénicilline médicament antibiotique, la résistance aux antibiotiques microbienne est devenue un problème de santé mondial 1. Bien que l'acquisition d' une résistance aux antibiotiques peut être étudié rétrospectivement in vivo, les conditions de ces expériences sont souvent pas contrôlés tout au long de l' évolution 2. En variante, l' évolution de laboratoire adaptatif peut révéler l'évolution moléculaire d'une espèce microbienne sous contraintes de l' environnement ou de la pression de sélection d'un médicament antibiotique 3. Récemment, de nombreuses expériences d'évolution bien contrôlée de la résistance aux antibiotiques ont élucidé l'émergence de la résistance aux antibiotiques. Par exemple, le groupe d'Austin a démontré l' émergence rapide dans un environnement compartimenté de microfluidique correctement conçu 4. Le morbidostat développé récemment induit des mutations systématiques sous la pression de la sélection des médicaments 5,6. Le morbidostat, une sélec microbiennedispositif de tion qui ajuste en continu la concentration en antibiotique pour maintenir une population à peu près constante, constitue une avancée majeure dans le test de fluctuation utilisée en microbiologie 7,8. Dans le test de fluctuation, un médicament antibiotique est injecté à une concentration élevée, et les mutants survivants sont criblés et comptés. Au lieu de cela, les microbes dans un morbidostat sont constamment remises en question et d'acquérir de multiples mutations.
Le morbidostat fonctionne de façon similaire à la chémostat, un dispositif de culture inventé par Novick et Szliard en 1950 qui maintient une population constante par apport continu de nutriments alors que la dilution de la population microbienne 9. Depuis son introduction, le chemostat a été avancée et améliorée. chémostats microfluidiques actuelles ont atteint des capacités de nanolitre et une seule cellule. Cependant, ces dispositifs ne sont pas appropriés pour des expériences d'évolution adaptative, qui nécessitent une grande population de cellules avec de nombreux événements de mutation 10,11. Récemment, mini-chémostats avec des volumes de travail de ~ 10 ml ont également été développés pour combler l'écart entre le litre bioréacteurs à l'échelle et la microfluidique chemostat 12,13.
Ici, nous présentons la conception et l'utilisation d'un faible coût, morbidostat automatisé pour une étude de résistance aux antibiotiques de la drogue. Le module proposé peut être utilisé dans un incubateur à agitateur dans un laboratoire de microbiologie à l'exigence d'un minimum de matériel. Le firmware open-source est également facilement adapté à des applications spécifiques de l' évolution adaptative, tels que l' ingénierie métabolique 3. Enfin, le morbidostat est intégré dans une plate - forme microfluidique multiplexé pour les tests de sensibilité aux antibiotiques 14.
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Protocol
Assemblée 1. et prétest de l'appareil Morbidostat
- Assemblée de la Morbidostat
- Poinçonner des trous 3 sur le bouchon du flacon de culture avec une aiguille de seringue 18 G. Couper trois morceaux de tube en polyéthylène ~ 7 cm de longueur. Insérez ces trois morceaux de tuyaux en polyéthylène sur le bouchon.
- Utilisez du ruban adhésif pour envelopper le bord de la capsule pour servir le casting pour le mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS). Mélanger 5 g de composant A et 0,5 g de composant B du PDMS dans un récipient en plastique de 150 ml en agitant manuellement à l'aide d'un cure-dent. Charger le mélange dans une seringue de 10 ml.
- Verser le mélange PDMS sur le bouchon avec la seringue. Cuire l'ensemble de bouchon pour guérir les PDMS pendant 8 heures dans le four à 70 ° C.
- Soudez l'anode LED avec le fil de calibre 24 et la cathode LED avec la résistance de carbone avec un fer à souder. Soudez une résistance de 680 Ω de carbone avec un G fil 24. Isolez la connexion de fil à l'aide du ruban électrique.
- Alorslder le collecteur du photo-détecteur avec le G fil 24 et l'émetteur du photodétecteur avec une résistance de 100 kQ de carbone. Isolez la connexion de fil à l'aide du ruban électrique.
- Placez la diode émettant de la lumière dans le support de la culture de flacon. En suivant le schéma de la figure complémentaire 2, connectez la diode électroluminescente et la puissance avec une alimentation de 5 V. Assurez -vous que la LED fonctionne en utilisant un appareil photo numérique qui permet de détecter IR (par exemple, une caméra de téléphone mobile).
- Placer le photodétecteur dans le support de flacon de culture. En suivant le schéma de la figure complémentaire 2, connectez le photodétecteur et la puissance avec une alimentation de 5 V. Branchez le fil sur les deux côtés des résistances photodétecteurs pour mesurer la tension aux bornes de la carte de commande électronique.
- Coller un aimant sur l'arbre du ventilateur de refroidissement, qui sert d'unité d'agitation magnétique. A noter que le alignement de l'arbre du ventilateur dans le flacon de culture, et l'espacement entre la fiole de culture et l'aimant est très critique pour le bon fonctionnement de l'unité d'agitation magnétique.
- Connectez chaque morceau de tube en polyéthylène du flacon de culture dans le morceau de tube en silicone correspondant pour les micro-pompes, bouteilles moyennes, et une bouteille de déchets. Tournez sur la pompe pendant 1 heure et mesurer le volume total pompé de la bouteille moyenne dans le flacon de culture pour déterminer le débit de la pompe. Notez que le taux de pompage typique devrait être ~ 4 ml / h, ce qui correspond au taux de dilution D = 0,33 h -1 pour un 12 ml de volume de la fiole de culture de travail.
- Placez tout l'ensemble sur une taille moyenne (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) Agitateur incubateur.
- Prétest l'Morbidostat
- Set tension d'alimentation du ventilateur cool de 5 V pour démarrer son moteur à tester la barre d'agitation magnétique. Notez que l'action d'agitation peut être inspecté visuellement. La tension qui conduisents le moteur du ventilateur de refroidissement est contrôlée avec précision par la largeur d'impulsion (PWM).
- Préparer une série de type sauvage E. coli échantillons ayant une densité optique à 600 nm allant généralement de 0,07 à 0,3 pour l' étalonnage. Placez un test E. échantillon coli dans le flacon de culture et d' enregistrer la tension de photodétecteurs.
- Placer ~ 100 ul du même échantillon dans le lecteur de plaque et enregistrer la densité optique. Utiliser la tension du photodétecteur en fonction des données de densité optique pour tracer la courbe d'étalonnage. Notez que généralement, un changement d'unité de densité optique correspond à ~ 7,6 V changement dans le photodétecteur avec le schéma de polarisation utilisé ici.
2. Exécution de l'Morbidostat
- Préparation Avant de commencer l'expérience quotidienne
- Préparer le flacon de culture avec trois ultra-résistants aux produits chimiques tubings Tygon avec diamètre intérieur 1/32 pouce et le diamètre extérieur de 3/32 pouce pour les entrées pour former le dispositif de l'article1.1 et à la figure 1 supplémentaire.
- Préparer le milieu minimum M9 (0,2% de glucose) et le triméthoprime (TMP) médicaments contenant du milieu. Stériliser le milieu, la bouteille moyenne, le milieu bouteille de médicament, le flacon de récupération, et le flacon de culture dans un autoclave à 121 ° C.
NOTE: Le TMP est une solution de réserve qui est utilisée pour obtenir plus tard , les concentrations dans le tableau 1 et le médicament TMP contenant du milieu ne sont pas autoclavé.
- Exécution de l'Morbidostat
- Le premier jour de l'expérience, dégeler 1 ml de type sauvage congelé E. coli MG1655 cellules pendant 5 min à température ambiante , et le transfert de 120 ul de cellules dans le flacon de culture contenant ~ 12 ml de milieu de culture M9. Après le premier jour, décongeler 1 ml de E. congelées coli , des cellules de la veille pendant 5 min et le transfert de 120 ul des cellules à un nouveau flacon de culture contenant environ 12 ml de milieu de culture M9.
- Allumez l'incubateur shaker et régler le tempeh rature à 30 ° C sans agitation.
- Démarrer l'opération de morbidostat en activant la micro-pompe, l'unité d'agitation magnétique et la mesure de la densité optique.
Remarque: Au cours de l'opération, un algorithme de seuil de contre-réaction est utilisé pour commander l'injection du médicament. Lorsque la densité optique mesurée dépasse un seuil prédéterminé, la pompe d'injection de médicament serait activé et la pompe à fluide soit mis hors tension. Dans le cas contraire, la pompe d'injection de médicament reste éteint et la pompe à fluide est activée. - Surveiller la tension de temps à autre pour qu'il y ait une croissance microbienne.
Remarque: En raison du gel et du dégel du cycle, E. coli cellules présentent un retard de ~ 4 h au cours de la croissance de chaque jour. - Après ~ 23 h, arrêter le micro-pompe en éteignant sa tension d'alimentation et retirez le flacon de culture. Ajouter 15% de glycérol dans le flacon de culture et congeler l'échantillon à -80 ° C pour le stockage.
- Répétez les étapes 2.2.1 à 2.2.5.
REMARQUE: Effectuez la mesure du taux de croissance dans un lecteur de plaque avec un format de 96 puits pour déterminer le niveau de résistance aux antibiotiques.
- Décongeler l'échantillon congelé par jour à la température ambiante pendant 5 minutes et transférer 15 pl de la cellule dans le flacon de culture contenant environ 15 ml de milieu M9. Leur permettre de se développer jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm atteint ~ 0,1. Diviser les 15 ml dans des flacons de 1 ml et ajouter le médicament TMP à cette étape pour obtenir les concentrations désirées de médicament comme indiqué dans le tableau 1.
- Prendre 200 pi de l'échantillon de l' étape 3.1 et la place dans chaque puits dans le lecteur de plaque et leur permettre de se développer pendant 12 h 5. La densité optique à une longueur d'onde de 600 nm est automatiquement enregistrée pendant la mesure.
NOTE: Pour chaque point de données, les mesures sont enregistrées en triple et en moyenne pour assurer la cohérence des données. Les données sur la densité optique en fonction du temps peut be utilisée pour obtenir le taux de croissance. - Tracer les données de taux de croissance par rapport à la concentration du médicament pour obtenir IC50. A noter que la CI50 est définie comme la concentration de médicament à laquelle le taux de croissance est de cinquante pour cent du taux de croissance maximal 5.
4. Single Cell Morphologie et sensibilité aux antibiotiques dans la mesure dispositifs microfluidiques
- Effectuer la fabrication des dispositifs microfluidiques par lithographie douce multicouche de PDMS comme décrit ailleurs 15.
- Utilisez photolithographie pour faire le moule de résine photosensible pour les couches de contrôle et de débit. Notez que pour la couche de contrôle, utilisez photorésist négatif (~ 15 um de hauteur) et résine photosensible positive (~ 8 pm hauteur) pour produire un moule sur une plaquette de silicium nue.
- Préparer des mélanges de PDMS avec des rapports de reticulation de 5: 1 et 20: 1 pour la couche de contrôle et la couche d'écoulement, respectivement. Mettez les mélanges dans un dessiccateur sous vide pour éliminer les bullesPendant 1 h.
- Exposer les moules couche de résine photosensible de contrôle sur la plaquette de silicium à triméthylchlorosilane (TMCS) vapeur. Rendre la couche de contrôle de l'épaisseur ~ 6 mm par coulée du mélange PDMS (avec un rapport de réticulation 5: 1) sur la plaquette de silicium sur la couche surmoulée contrôle de résine photosensible. Cuire la couche de commande pendant 40 min à 80 ° C pendant 1 h dans le four.
- Rendre la couche d'écoulement par revêtement par centrifugation d'un mélange de PDMS (avec un rapport reticulation 20: 1, la vitesse de rotation de 3000 rpm pendant 60 secondes) sur un moule de résine photosensible couche d'écoulement. Cuire la couche d'écoulement pendant 30 min à 80 ° C pendant 1 h dans le four.
- Utilisez une lame de rasoir pour couper la couche de contrôle dans la taille de la puce souhaitée (typiquement 3 cm x 2 cm) et manuellement décoller la couche de contrôle. Placez la couche de contrôle sur le dessus de la couche d'écoulement et les aligner sous un stéréomicroscope. Durcir l'ensemble aligné à 80 ° C pendant une nuit dans le four. Ensuite, faire tremper l'ensemble dans 250 ml d'eau déminéralisée dans un récipient en plastique pendant 5 heures pour dissoudre le TMCS résiduel.
- Par la suite, poinçonner les trous d'entrée avec 20 g d'aiguilles et de lier l'ensemble élastomère sur une lame de verre recouverte d'une couche de PDMS ébauche (PDMS réticulation rapport 5: 1, vitesse de rotation 2000 tours par minute pendant 30 secondes), par traitement par plasma d'air pendant 40 secondes à 1.2 pression d'air Torr.
- Effectuer une vaste cuisson pendant 36 heures à 80 ° C pour réduire les effets cytotoxiques de PDMS. A noter que cette étape de cuisson est crucial pour minimiser la toxicité pour les cellules bactériennes.
- On Chip Growth Experiment
- Avant de charger dans le dispositif microfluidique, rincer avec de l'eau déminéralisée pendant 1 heure et moyenne M9 pendant 1 h.
- Décongeler l'échantillon congelé tous les jours à la température ambiante pendant 5 min et inoculer un nouveau tube à essai avec un milieu M9 frais. Placer l'échantillon dans un incubateur agitateur à 37 ° C pendant une nuit.
- Diluer l'échantillon 10 fois microbienne avec un milieu M9 et le charger dans le dispositif microfluidique en faisant pression sur le récipient d'échantillon microbienne à 5 psi. Chargez ensuite le médicament TMPmoyen dans la puce en faisant pression sur le récipient milieu de médicament à 5 psi. Exécuter le mélange entre le microbe et de médicament par actionnement de la valve micromécanique entre les deux chambres de la puce microfluidique pendant 15 min.
- Placez la puce microfluidique dans l'incubateur de microscope monté sur le microscope inversé. Acquérir l'image de cellules dans la chambre de croissance à chaque heure pendant 8 heures avec la caméra CCD montée sur le microscope inversé.
- Utiliser le script de programme personnalisé pour calculer le nombre de cellules par l' intermédiaire d' un algorithme de seuil sur les données d'image de la cellule 18. A noter que les données de numéros de cellule sont typiquement en moyenne plus de trois chambres microfluidiques.
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Representative Results
Le morbidostat décrit ci-dessus est schématisé sur la figure 1. Les opérations de morbidostat communes, y compris l' évolution expérimentale, test de sensibilité aux antibiotiques et la morphologie des cellules de vérification, ont été validées dans un E. culture coli MG1655 exposée au triméthoprime (TMP), un médicament antibiotique couramment utilisé 5,6. TMP induit par étapes augmente très distinctives dans la résistance aux médicaments, et les mutations sont regroupées autour du gène de la dihydrofolate réductase (DHFR). Par conséquent, TMP est un médicament standard très efficace pour valider l'opération de morbidostat. Chaque jour, le microbe devrait croître au- dessus du seuil de densité optique prédéterminée et déclencher l'injection de drogues comme représenté sur la figure 2a. L'injection de médicament est prévu pour inhiber la croissance et, par conséquent, une diminution de la densité optique. Plusieurs pistes d'essais peuvent être nécessaires pour déterminer la concentration optimale des médicaments. En règle générale, nous avons de plus ene la concentration du milieu de la drogue par 5 fois après avoir constaté que le milieu de la drogue ne parvient pas à supprimer la croissance. Après que tout le cours de l'expérience, les échantillons congelés sont décongelés par jour et utilisées pour déterminer la CI50, une mesure quantitative du taux de résistance aux médicaments. Le tracé de la figure 2b montre l'augmentation temporelle de la résistance aux antibiotiques. La résistance aux médicaments a augmenté d' environ 1 500 fois à ~ 1000 pg / ml sur ~ 12 jours, conformément aux conclusions antérieures de l'évolution de laboratoire 5 et 19 isolats cliniques. Les mutations ponctuelles de la DHFR dans le mutant dernier jour ont été mesurés par séquençage de Sanger et sont listés dans le tableau 2. Une mutation est trouvée situé dans la région du promoteur et indique que la seule mutation ponctuelle dans la région du promoteur peut varier de manière significative le niveau de la DHFR d'expression 20 enzyme. Une autre mutation à l'emplacement 49910 est situé dans la région du gène de DHFR et est proche de l'acteive site de la DHFR enzyme 21. L'acquisition de la résistance aux médicaments avec de multiples mutations prouve l'utilité du morbidostat, que la sélection sur la drogue contenant une plaque de gélose tend à conférer seule la seule mutation.
En tant que lecture plus sensible de la morphologie des cellules, le contrôle de la morphologie cellulaire avec une seule sensibilité aux antibiotiques est effectuée en parallèle, la plate - forme microfluidique multiplexe 14. La figure 3 montre la conception de la puce microfluidique multiplexe. Micrographies des cellules bactériennes (Figure 5) révèlent des changements morphologiques dans les deux de type sauvage et des souches mutantes sous des concentrations sub-inhibitrices de TMP. souches de type sauvage montrent filamentation significative tandis que la souche mutante ne montre aucun filamentation significative. Ce changement de morphologie au niveau d'une seule cellule peut être utilisée dans le diagnostic rapide de la résistance aux antibiotiques. La figure 4 montre l'on chiLes courbes de croissance p à diverses concentrations de TMP. L'échantillon mutant présente une augmentation significative de la résistance aux antibiotiques. Les données sur la puce de croissance dans la figure 4 est également compatible avec la valeur IC 50 du lecteur de plaque affichée dans la figure 2b.
Figure 1:. Schématique du morbidostat Le morbidostat est un dispositif de culture continue qui mesure la densité optique de la population microbienne et, en conséquence ajuste la concentration du médicament. L'appareil fonctionne en mode de mode de drogue par injection et drogue dilution. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Courbe de croissance et l' augmentation du niveau de résistance aux antibiotiques (a) la courbe de croissance représentant sous la rétroaction.. La croissance microbienne est inhibée par le médicament antibiotique, dont l'injection est déclenchée par un algorithme de seuil. Lorsque le taux de croissance positif augmente la densité optique au- dessus du seuil préréglé (OD TH = 0,086), l'appareil passe en mode injection de drogues. Sinon, l'appareil fonctionne en mode drogue dilution. Les flèches rouges et pourpres indiquent la commutation en modes d'injection de drogue et de dilution, respectivement. (B) du niveau de résistance des cellules pendant 12 jours d'exposition au triméthoprime. L'IC 50 montre une augmentation progressive distincte de la résistance aux antibiotiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3: Les dispositifs microfluidiques pour enquêter sur la morphologie des cellules et sur puce sensibilité aux antibiotiques (a) Microscopie de l'agencement de puce.. compartiments verts et bleus sont les chambres de croissance et moyennes de la drogue, respectivement, et la mise en page rouge désigne la couche de contrôle. Les dimensions de la chambre de croissance sont de 450 pm (l) x 400 um (w) x 8 um (h). La chambre de croissance est chargée avec les bactéries, et la chambre de médicament est chargée avec le TMP. La barre d'échelle est de 1 cm. (B) Magnifié vue sur la même puce. Barre d'échelle = 500 um. (C) Magnifié vue des deux chambres avant et après le mélange. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Courbes de E. On-chip croissance: Figure 4 coli exposée à diverses concentrations de TMP: (a) de type sauvage souche ancestrale et (b) la souche mutante (au jour 12). L'échantillon mutant montre une augmentation significative de la résistance aux antibiotiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: unicellulaires morphologies (a - d) images de champ lumineux de la cellule après le traitement avec des niveaux de TMP sub-inhibitrices. Notez la filamentation significative des cellules de type sauvage dans (b), qui est absente chez les mutants (d (e - h) sont des images numérisées (a - d). Toutes les images bactériennes ont été prises par une caméra CCD avec un objectif de grossissement 40X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure supplémentaire 1:. Les dimensions et le montage du support de culture flacon S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure complémentaire 2:. Le schéma de circuit pour la LED et le photodétecteur S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
code supplémentaire. script personnalisé pour compter le nombre de cellules à partir des images de cellules obtenues à partir des puces microfluidiques S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
| Échantillon | TMP Drug (pg / ml) | |||||||||||
| jour 1-3 | 0 | 0,06 | 0,12 | 0,25 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | |
| jour 4 | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | dix | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| jour 5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <td> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| jour 8-12 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 1000 | 2000 | |
. Tableau 1: concentration de médicament utilisée pour déterminer la CI50 dans les concentrations de médicament plaque lecteur mesure en unités de ng / ml sont affichés pour l'échantillon congelé par jour. Comme les cellules développent une résistance aux médicaments plus élevée, les concentrations de médicament utilisées sont augmentées en conséquence.
| Non | Emplacement | SNP | Remarque |
| 1 | 49894 | C-> T | |
| 2 | 49910 | T-> A | gène DHFR |
| 3 | 49795 | C-> T | promoteur DHFR |
. Tableau 2: Mutation DHFR identifiés par séquençage de Sanger Les données de séquences représentatives montrent les trois mutations ponctuelles dans la DHFR mutant dernier jour (jour 12). Les régions de promoteur et de gènes contiennent un SNP et 2, respectivement. Les amorces directes et inverses utilisées dans la PCR étaient 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 'et 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5.
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Discussion
Un dispositif de morbidostat faible encombrement à partir de composants à faible coût est démontrée. Les augmentations du niveau de résistance aux médicaments enregistrés par l'appareil sont identiques à ceux des rapports précédents 5. Conçu pour les études évolutives de la résistance aux médicaments, le dispositif est potentiellement applicable à beaucoup d'autres expériences. Tout d'abord, une base de données complète des mutations induites par les médicaments peut être établie pour un grand nombre d'antibiotiques cliniquement pertinents. Par exemple, la voie de l'évolution de la résistance aux médicaments multiples peut être étudiée en augmentant simplement le nombre de médicaments utilisés dans l'expérience. Le principal avantage du module rapporté ici est sa configurabilité flexible, permettant à grande échelle, des expériences parallèles dans différentes conditions expérimentales.
Bien que le concept a été démontré dans les mesures microfluidiques, la puissance d' investigation peut être améliorée en combinant la technologie microfluidique avec fluidiques 23. Le coût parmesure (économie d'échelle) est considérablement réduite par la consommation de réactif réduit et le travail réduit. Ici, les données morphologiques de cellules isolées peuvent être extraits de la plate-forme microfluidique. Récemment, des tests de morphologie microfluidique de cellules individuelles a été mis en œuvre avec succès dans les laboratoires de microbiologie clinique et effectue comparable à bouillon norme des tests de dilution en série 24. Avec la disponibilité croissante de dispositifs microfluidiques, les technologies combinées permettront à grande échelle, à haut débit des expériences d'évolution en laboratoire.
Plusieurs étapes sont essentielles pour exécuter le morbidostat. Tout d'abord, parce que l'unité agitation magnétique est formé d'aimants et d'un ventilateur de refroidissement, il est crucial d'aligner l'arbre du ventilateur dans le flacon de culture. En outre, la distance entre la fiole de culture et l'aimant est très important d'assurer un fonctionnement stable. En second lieu, le passage à un nouveau flacon de culture au début de l'expérience de chaque jour est aussi important deéviter la formation de biofilm. Dans le cas contraire, la formation d'un biofilm peut se produire en 2 à 3 jours. Troisièmement, parce que E. échantillons coli sont décongelés par jour à partir d' un échantillon congelé lors de l'expérience de chaque jour pour assurer la cohérence, il est important de définir une période de retard d'au moins 4 heures pour éviter un lavage totale sur les microbes. Alternativement, on peut choisir de ne pas geler E. échantillons coli et directement utiliser l'échantillon pour inoculer un nouveau flacon de culture pour commencer une nouvelle culture.
Dans un cadre pratique, la conception du système actuel doit surmonter plusieurs limites pour étendre ses usages potentiels. Le volume de l'ensemble du système est actuellement limité par le moyen consommé par jour ( au cours du fonctionnement en chemostat, un flacon de culture consomme environ 0,5 litre de milieu par jour au taux de dilution typique de 0,33 h -1). Pour réduire le volume de travail, optimisation supplémentaire peut être obtenue par simulation prudent sur la dynamique des populations drogue inhibée avec Plumbing paramètres 25.
Enfin, le morbidostat est facilement adaptable à un large éventail d'expériences de culture bactérienne. Par exemple, en attachant une diode émettant de la lumière, le système pourrait être reconfiguré en tant que photobioréacteur, ce qui permet le suivi de l' évolution des cyanobactéries ou microalgues 26. Le module peut être étendu à anaérobie et la culture microaérobique dans un récipient étanche aux gaz avec des adsorbants en opérant sans fil l'appareil dans une batterie. A titre d' autre exemple, la concentration d'une toxine peut être augmentée progressivement pour concevoir des souches qui sont résistantes au produit chimique cible 27.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
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