Abstract
نحن تصف منخفضة التكلفة، morbidostat شكلي لوصف المسار التطوري للمقاومة المضادات الحيوية. وmorbidostat هو جهاز ثقافة البكتيرية التي تراقب باستمرار نمو البكتيريا وضبط تركيز الدواء للطعن في البكتيريا باستمرار لأنها تتطور لاكتساب المقاومة للأدوية بشكل حيوي. ويتميز الجهاز بحجم العمل ~ 10 مل ومؤتمتة بالكامل ومجهزة قياس الكثافة الضوئية والمضخات الصغيرة المتوسطة وتسليم المخدرات. للتحقق من صحة منصة، قمنا بقياس الاستحواذ التدريجي من المقاومة ميثوبريم في القولونية MG 1655، ودمج الجهاز مع منصة ميكروفلويديك المضاعفة للتحقيق في مورفولوجيا الخلايا والتعرض للمضادات الحيوية. النهج يمكن أن تصل إلى تحجيم الدراسات المختبرية من مقاومة الجراثيم للأدوية المضادات الحيوية، وهو للتمديد لالتكييفية تطور لتحسين السلالة في الهندسة الأيضية وغيرها من تجارب زراعة البكتيرية.
Introduction
منذ إدخال أول البنسلين المخدرات المضادات الحيوية، وقد وضعت المقاومة للمضادات الحيوية الميكروبية إلى مشكلة صحية عالمية 1. على الرغم من أن اكتساب مقاومة للمضادات الحيوية يمكن دراستها بأثر رجعي في الجسم الحي، وغالبا ما لا تسيطر على ظروف هذه التجارب في جميع أنحاء تطور كامل 2. بدلا من ذلك، يمكن أن تطور مختبر التكيف تكشف عن التطور الجزيئي من الأنواع الميكروبية في ظل الضغوط البيئية أو ضغط اختيار من الدواء المضاد 3. في الآونة الأخيرة، وإجمال العديد من التجارب التطورية تسيطر عليها بشكل جيد لمقاومة المضادات الحيوية في ظهور مقاومة الجراثيم للأدوية المضادات الحيوية. على سبيل المثال، أظهرت مجموعة أوستن الظهور السريع في ميكروفلويديك هندسيا بشكل صحيح بيئة compartmented 4. وmorbidostat وضعت مؤخرا يدفع الطفرات منتظمة تحت المخدرات اختيار ضغط 5،6. وmorbidostat، وSELEC الميكروبيجهاز نشوئها باستمرار على تعديل نسبة تركيز المضادات الحيوية للحفاظ على عدد السكان ثابتا تقريبا، يمثل تقدما كبيرا من الاختبار تذبذب المستخدمة في علم الأحياء المجهرية 7،8. في اختبار التذبذب، يتم حقن الدواء المضاد في تركيز عال، ويتم فحص المسوخ على قيد الحياة وفرزها. بدلا من ذلك، الميكروبات في morbidostat وتحدى باستمرار، والحصول على طفرات متعددة.
وmorbidostat تعمل على غرار ناظم كيميائي، جهاز الثقافة التي اخترعها نوفيك وSzliard في عام 1950 التي تحافظ على السكان المستمر من خلال توفير المواد الغذائية بشكل مستمر في حين تمييع الميكروبي السكان 9. منذ بدء العمل به، وقد تقدمت وناظم كيميائي وتحسينها. وقد وصلت chemostats ميكروفلويديك الحالية نانولتر وحيدة الخلية القدرات. ومع ذلك، وهذه الأجهزة هي غير صالحة للتجارب التطور على التكيف، والتي تتطلب السكان خلية كبيرة مع العديد من الأحداث طفرة 10،11. في الآونة الأخيرة، مصغرةكما تم تطوير chemostats مع وحدات التخزين عمل ~ 10 مل لملء الفجوة بين المفاعلات الحيوية على نطاق ولتر وميكروفلويديك ناظم كيميائي 12،13.
هنا نقدم تصميم واستخدام منخفضة التكلفة، morbidostat الآلي لدراسة مقاومة المضادات الحيوية. وحدة المقترحة يمكن استخدامها في حاضنة شاكر في مختبر علم الأحياء المجهرية مع متطلبات الأجهزة الحد الأدنى. وأيضا مصممة الثابتة المصدر المفتوح بسهولة إلى تطبيقات محددة من تطور على التكيف، مثل الهندسة الأيضية 3. وأخيرا، تم دمج morbidostat إلى منصة ميكروفلويديك المضاعفة لاختبار الحساسية للمضادات الحيوية 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الجمعية 1. والاختبار التمهيدي للجهاز Morbidostat
- جمعية Morbidostat
- لكمة 3 ثقوب على الغطاء من القارورة الثقافة مع حقنة إبرة 18 G. قطع ثلاث قطع من أنابيب البولي ايثيلين ~ 7 سم في الطول. إدراج هذه القطع الثلاث من أنابيب البولي ايثيلين على الغطاء.
- استخدام الشريط للالتفاف على حافة الغطاء لتكون بمثابة المدلى بها ل(PDMS) خليط ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان. مزيج 5 غرام من عنصر و 0.5 غرام من عنصر باء من PDMS في وعاء من البلاستيك 150 مل عن طريق اثارة يدويا مع المسواك. تحميل الخليط في حقنة 10 مل.
- يصب الخليط PDMS على الغطاء مع حقنة. خبز غطاء كامل لعلاج PDMS لمدة 8 ساعة في الفرن عند 70 درجة مئوية.
- لحام الأنود LED مع سلك قياس 24 و LED الكاثود مع المقاوم الكربون مع حام الحديد. جندى المقاوم 680 Ω الكربون مع G سلك 24. عزل اتصال سلكية باستخدام شريط كهربائي.
- وبالتاليlder جامع للمكشاف ضوئي مع مجموعة الأسلاك (24) وباعث للمكشاف ضوئي مع أوم المقاوم الكربون 100. عزل اتصال سلكية باستخدام شريط كهربائي.
- وضع الصمام الثنائي الباعث للضوء في حامل الثقافة قارورة. باتباع مخطط الرسم البياني في الشكل التكميلي 2، قم بتوصيل التي ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي وتزويدها بالطاقة من خلال امدادات الطاقة من 5 خامسا تأكد من أن الصمام يعمل عن طريق استخدام الكاميرا الرقمية التي يمكن الكشف عن الأشعة تحت الحمراء (على سبيل المثال، وكاميرا الهاتف المحمول).
- وضع مكشاف ضوئي في حامل الثقافة قارورة. باتباع مخطط الرسم البياني في الشكل التكميلي 2، ربط مكشاف ضوئي وتزويدها بالطاقة من خلال امدادات الطاقة من 5 خامسا بتوصيل سلك لكلا الجانبين من المقاومات مكشاف ضوئي لقياس الجهد عبر لوحة التحكم الإلكترونية.
- الغراء المغناطيس على رمح من مروحة التبريد، والتي هي بمثابة وحدة النمام المغناطيسي. لاحظ أن alignmوالأنف والحنجرة من رمح المروحة إلى القارورة الثقافة، والتباعد بين القارورة الثقافة والمغناطيس حرج للغاية لوظيفة المناسبة من وحدة التحريك المغناطيسي.
- ربط كل قطعة من أنابيب البولي ايثيلين من القارورة الثقافة في قطعة المماثل من أنابيب السيليكون لمضخات صغيرة، زجاجات المتوسطة، وزجاجة من النفايات. بدوره على مضخة لمدة 1 ساعة وقياس الحجم الكلي التي يجري ضخها من زجاجة متوسطة إلى القارورة الثقافة لتحديد سعر المضخة. لاحظ أن معدل ضخ نموذجي يجب أن يكون ~ 4 مل / ساعة، وهو ما يعادل نسبة التخفيف D = 0.33 ساعة -1 لمدة 12 مل حجم القارورة ثقافة العمل.
- وضع التجمع كله على متوسطة الحجم (34 سم × 34 سم × 43.5 سم) حاضنة شاكر.
- الاختبار التمهيدي للMorbidostat
- مجموعة الجهد امدادات الطاقة من مروحة تبريد إلى 5 فولت لبدء المحرك لاختبار شريط التحريك المغناطيسي. لاحظ أن عمل مع التحريك يمكن أن يتم فحص البصر. الجهد التي تدفعق يتم التحكم في التبريد مروحة المحرك بدقة قبل تعديل عرض النبضة (PWM).
- إعداد سلسلة من النوع البري E. عينات القولونية ذات الكثافة البصرية في 600 نانومتر عادة ما تتراوح ،07-،3 للمعايرة. وضع اختبار E. عينة القولونية في قارورة الثقافة وسجل الجهد مكشاف ضوئي.
- مكان ~ 100 ميكرولتر من نفس العينة في قارئ لوحة وتسجيل الكثافة الضوئية. استخدام الجهد مكشاف ضوئي مقابل البيانات الكثافة الضوئية لرسم منحنى المعايرة. لاحظ أن عادة، واحد تغيير وحدة في الكثافة البصرية يناظر ~ 7.6 V تغيير في مكشاف ضوئي مع نظام الانحياز المستخدمة هنا.
2. تشغيل Morbidostat
- إعداد قبل بدء التجربة اليومية
- إعداد قارورة الثقافة مع ثلاثة فائقة الكيميائية الأنابيب Tygon المقاومة مع القطر الداخلي 1/32 بوصة وقطرها الخارجي 3/32 بوصة لمداخل لتشكيل الجهاز كما في القسم1.1 وفي الشكل التكميلي 1.
- إعداد المتوسطة M9 الحد الأدنى (0.2٪ الجلوكوز) وميثوبريم (TMP) المخدرات تحتوي على المتوسط. تعقيم المتوسطة، وزجاجة المتوسطة، والمخدرات زجاجة المتوسطة، وزجاجة من النفايات، وقارورة الثقافة في الأوتوكلاف في درجة حرارة 121 مئوية.
ملاحظة: TMP هو الحل الأوراق المالية التي يتم استخدامها لتحقيق في وقت لاحق التركيزات في الجدول رقم 1 وليس تعقيمها المخدرات TMP تحتوي على المتوسط.
- تشغيل Morbidostat
- في اليوم الأول من التجربة، وذوبان الجليد 1 مل من النوع البري المجمدة E. خلايا القولونية MG1655 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ونقل 120 ميكرولتر من الخلايا إلى قارورة الثقافة التي تحتوي على ~ 12 مل من متوسط النمو M9. بعد اليوم الأول، ذوبان الجليد 1 مل من المجمدة E. القولونية الخلايا من اليوم السابق لمدة 5 دقائق ونقل 120 ميكرولتر من الخلايا إلى قارورة ثقافة جديدة تحتوي على ~ 12 مل من متوسط النمو M9.
- تشغيل حاضنة شاكر وتعيين تمب rature إلى 30 درجة مئوية مع عدم وجود اهتزاز.
- بدء عملية morbidostat عن طريق تشغيل مضخة صغيرة، وحدة التحريك المغناطيسي، وقياس كثافة الضوئية.
ملاحظة: أثناء العملية، ويستخدم خوارزمية عتبة ردود الفعل للسيطرة على المخدرات عن طريق الحقن. عندما تتجاوز الكثافة الضوئية قياس عتبة محددة مسبقا، سيتحول مضخة حقن المخدرات على، وسوف يتم تشغيل المضخة المتوسطة خارج. خلاف ذلك، لا تزال مضخة حقن المخدرات وإيقاف المضخة المتوسطة على. - مراقبة الجهد من وقت لآخر لضمان عدم وجود نمو الجراثيم.
ملاحظة: نظرا للتجميد والذوبان دورة، E. القولونية خلايا يحمل تأخير ل~ 4 ساعات خلال النمو كل يوم. - بعد ~ 23 ساعة، ووقف ضخ الصغيرة عن طريق إيقاف امدادات التيار الكهربائي واخراج قارورة الثقافة. إضافة 15٪ الجلسرين في قارورة الثقافة وتجميد العينة في -80 درجة مئوية لمدة التخزين.
- كرر الخطوات من 2.2.1 إلى 2.2.5.
ملاحظة: إجراء قياس معدل النمو في قارئ لوحة مع شكل جيد 96 لتحديد مستوى مقاومة المضادات الحيوية.
- ذوبان الجليد العينة المجمدة اليومية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ونقل 15 ميكرولتر من الخلية إلى القارورة التي تحتوي على ثقافة ~ 15 مل M9 المتوسطة. السماح لها أن تنمو حتى الكثافة البصرية في 600 نانومتر تصل إلى ~ 0.1. تقسيم 15 مل في 1 مل الزجاجات وإضافة المخدرات TMP في هذه الخطوة للحصول على تركيز الدواء المطلوب كما هو مبين في الجدول رقم 1.
- أخذ 200 ميكرولتر من عينة من الخطوة 3.1 ومكان في كل بئر في قارئ لوحة والسماح لها أن تنمو لمدة 12 ساعة 5. وتسجل الكثافة البصرية في الطول الموجي 600 نانومتر تلقائيا أثناء القياس.
ملاحظة: للحصول على كل نقطة بيانات، يتم تسجيل القياسات ثلاث نسخ وبلغ متوسط لضمان اتساق البيانات. البيانات على الكثافة الضوئية مقابل الوقت يمكن به استخدامها للحصول على معدل النمو. - رسم البيانات معدل النمو مقابل تركيز الدواء للحصول على IC 50. لاحظ أن IC 50 هو الذي يعرف بأنه تركيز الدواء في فيه معدل النمو خمسين في المئة من معدل النمو القصوى 5.
4. وحيد الخلية الصرف والمضادات الحيوية قابلية القياس في أجهزة ميكروفلويديك
- أداء تصنيع الأجهزة ميكروفلويديك عبر الطباعة الحجرية الناعمة متعدد الطبقات من PDMS كما هو موضح في مكان آخر (15).
- استخدام ضوئيه لجعل القالب مقاومة للضوء للتحكم وتدفق الطبقات. لاحظ أن للطبقة التحكم، استخدم مقاومة للضوء سلبي (~ 15 ميكرون الارتفاع) ومقاومة للضوء إيجابي (~ 8 ميكرون الارتفاع) لإنتاج العفن على رقاقة السيليكون العارية.
- تحضير خليط PDMS مع نسب الربط عبر من 5: 1 و 20: 1 لسيطرة طبقة وطبقة تدفق على التوالي. وضع خليط إلى مجفف تحت فراغ لإزالة أي فقاعات، لمدة 1 ساعة.
- فضح قوالب طبقة مقاومة للضوء سيطرة على رقاقة السيليكون لtrimethylchlorosilane (TMCS) بخار. جعل طبقة التحكم من ~ سماكة 6 ملم من صب خليط PDMS (مع نسبة الربط عبر 5: 1) على رقاقة السيليكون على العفن تحكم طبقة مقاومة للضوء. خبز طبقة التحكم لمدة 40 دقيقة في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الفرن.
- جعل طبقة تدفق التي تدور طلاء خليط PDMS (مع الصليب ربط نسبة 20: 1، وتدور بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية) على مقاومة للضوء العفن طبقة التدفق. خبز طبقة تدفق لمدة 30 دقيقة في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الفرن.
- استخدام شفرة حلاقة لقطع طبقة التحكم في حجم رقاقة المطلوب (عادة 3 سم × 2 سم) ويدويا تقشر طبقة التحكم. وضع طبقة السيطرة على الجزء العلوي من طبقة تدفق ومواءمتها تحت مجهر تشريحي. علاج التجمع الانحياز في 80 درجة مئوية في ليلة وضحاها الفرن. بعد ذلك، نقع التجميع في 250 مل من الماء منزوع الأيونات في وعاء من البلاستيك لمدة 5 ساعة بحل TMCS المتبقية.
- وفي وقت لاحق، لكمة ثقوب مدخل مع 20 الإبر G والسندات والمطاط الصناعي بأكمله إلى شريحة زجاجية مغلفة بطبقة PDMS فارغة (PDMS عبر ربط نسبة 5: 1، سرعة الدوران 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية) عن طريق العلاج البلازما الجوية لمدة 40 ثانية في 1.2 عربة ضغط الهواء.
- تنفيذ الخبز واسعة النطاق لمدة 36 ساعة على 80 درجة مئوية للحد من الآثار السامة للخلايا من PDMS. لاحظ أن هذه الخطوة الخبز أمر بالغ الأهمية لتقليل سمية للخلايا البكتيرية.
- في تجربة رقاقة النمو
- قبل تحميل في الجهاز ميكروفلويديك، مسح هذا مع الماء منزوع الأيونات لمدة 1 ساعة وM9 متوسطة لمدة 1 ساعة.
- ذوبان الجليد العينة المجمدة اليومية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتطعيم أنبوب اختبار جديد مع متوسط M9 جديدة. وضع العينة في حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- تمييع الميكروبي عينة 10 أضعاف مع M9 المتوسطة وتحميله في الجهاز ميكروفلويديك من خلال الضغط على الحاوية عينة الميكروبية في 5 رطل. ثم تحميل المخدرات TMPالمتوسطة في رقاقة عن طريق الضغط على المخدرات الحاويات المتوسطة في 5 رطل. تنفيذ خلط بين الميكروب والمخدرات عن طريق المشغلات صمام الميكرو ميكانيكية بين الغرفتين على رقاقة ميكروفلويديك لمدة 15 دقيقة.
- وضع رقاقة ميكروفلويديك في الحاضنة المجهر شنت على مجهر مقلوب. الحصول على صورة خلية في غرفة نمو كل ساعة لمدة 8 ساعة مع كاميرا CCD التي شنت على مجهر مقلوب.
- استخدام البرنامج النصي برنامج مخصص لحساب أعداد الخلايا من خلال خوارزمية عتبة على بيانات الصورة خلية 18. لاحظ أن وبلغ متوسط البيانات عدد الخلايا عادة على مدى ثلاث غرف ميكروفلويديك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وschematized وmorbidostat أعلاه هو موضح في الشكل 1. لعمليات morbidostat المشتركة، بما في ذلك التطور التجريبي، اختبار الحساسية للمضادات الحيوية وفحص الخلايا التشكل، والتحقق من صحتها في E. ثقافة القولونية MG1655 تتعرض لميثوبريم (TMP)، وهي تستخدم عادة المضادات الحيوية 5،6. TMP يدفع الزيادة التدريجية مميزة جدا في مقاومة المخدرات، وتتجمع الطفرات حول الجينات اختزال ثنائي هيدروالفولات (DHFR). لذلك، TMP هو دواء القياسية فعالة للغاية لإضفاء الشرعية على عملية morbidostat. ، من المتوقع أن ميكروب كل يوم لتنمو فوق عتبة الكثافة البصرية مسبقا وتحريك حقن المخدرات كما هو مبين في الشكل 2A. ومن المتوقع أن تمنع نمو حقن المخدرات، ونتيجة لذلك، خفض الكثافة الضوئية. قد تكون هناك حاجة إلى عدة أشواط المحاكمة لتحديد تركيز الدواء الأمثل. وكقاعدة عامة من الإبهام، ونحن الزيادهالبريد تركيز المتوسطة المخدرات بنسبة 5 أضعاف بعد أن تبين له أن متوسط المخدرات يفشل في وقف نمو. بعد كامل من التجربة، وإذابة العينات المجمدة اليومية واستخدامها لتحديد IC 50، وهو مقياس كمي لمستوى المقاومة للأدوية. المؤامرة في الشكل 2B يبين الزيادة الزمنية في مقاومة المضادات الحيوية. زادت المقاومة للأدوية حوالي 1500 أضعاف إلى ~ 1000 ميكروغرام / مل على ~ 12 يوما، بما يتفق مع النتائج السابقة في تطور مختبر 5 و السريرية يعزل 19. تم قياس الطفرات نقطة DHFR في متحولة-اليوم الأخير من سانجر تسلسل ومدرجة في الجدول 2. وجدت تقع إحدى الطفرات في منطقة المروج ويشير إلى أن طفرة نقطة واحدة في منطقة المروج يمكن أن تتغير بشكل ملحوظ في مستوى التعبير عن DHFR الانزيم 20. يقع طفرة أخرى في مكان 49910 في منطقة الجين من DHFR ويقع بالقرب من الفعلموقع إيف لDHFR انزيم 21. الحصول على مقاومة العقاقير مع طفرات متعددة يثبت فائدة morbidostat، والاختيار على المخدرات التي تحتوي على لوحة آغار يميل إلى منح فقط طفرة واحدة.
ونتيجة لقراءات أكثر حساسية للشكل الخلية، ويتم الاختيار التشكل وحيدة الخلية مع القابلية للمضادات الحيوية في موازاة ذلك، منصة ميكروفلويديك المضاعفة (14). ويبين الشكل 3 تصميم رقاقة ميكروفلويديك المضاعفة. الميكروسكوب من الخلايا البكتيرية (الشكل 5) تكشف التغييرات التشكل في كل نوع البرية وسلالات متحولة تحت تركيزات دون كابح من TMP. تظهر سلالات نوع البرية filamentation كبير في حين يظهر سلالة متحولة لا filamentation كبير. هذا التغيير التشكل على مستوى خلية واحدة يمكن استخدامها في التشخيص السريع المقاومة للمضادات الحيوية. الشكل 4 يعرض على تشيمنحنيات النمو ع بتركيزات مختلفة من TMP. يبين نموذج متحولة زيادة كبيرة في مقاومة المضادات الحيوية. بيانات النمو على الرقاقة في الشكل 4 يتسق أيضا مع قيمة IC 50 من قارئ لوحة عرض في الشكل 2B.
الشكل 1: رسم تخطيطي للmorbidostat وmorbidostat هو جهاز ثقافة المستمر الذي يقيس كثافة ضوئية من الميكروبات، وبالتالي يعدل تركيز الدواء. يعمل الجهاز في وضع حقن المخدرات وتخفيف المخدرات واسطة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: منحنى النمو والزيادة من المضادات الحيوية مستوى المقاومة للأدوية (أ) منحنى النمو الممثل في ظل ردود الفعل. ويمنع نمو الجراثيم من قبل المضادات الحيوية، التي يتم تشغيلها بواسطة خوارزمية عتبة الحقن. عندما يرفع معدل نمو إيجابي في الكثافة الضوئية فوق عتبة محددة مسبقا (OD TH = 0.086)، سيشغل الجهاز إلى وضع المخدرات عن طريق الحقن. خلاف ذلك، يعمل الجهاز في وضع تخفيف المخدرات. الأحمر والأرجواني السهام تشير إلى التحول إلى وسائل حقن المخدرات، والتخفيف المخدرات، على التوالي. (ب) مستوى مقاومة الخلايا خلال 12 يوما من التعرض للميثوبريم. وIC 50 يدل على زيادة تدريجية متميزة من مقاومة الجراثيم للأدوية المضادات الحيوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ر = "الشكل 3" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 54426 / 54426fig3.jpg" />
الشكل (3): ميكروفلويديك الأجهزة للتحقيق في مورفولوجيا الخلايا والتعرض للمضادات الحيوية على رقاقة (أ) صورة مجهرية للتخطيط الشريحة. المقصورات الخضراء والزرقاء هي غرف النمو والمتوسطة المخدرات، على التوالي، وتخطيط الأحمر يدل على سيطرة طبقة. أبعاد غرفة النمو هي 450 ميكرون (ل) × 400 ميكرون (ث) × 8 ميكرون (ح). يتم تحميل غرفة النمو مع البكتيريا، ويتم تحميل غرفة المخدرات مع TMP. شريط المقياس هو 1 سم. (ب) مكبر رأي الشريحة نفسها. شريط مقياس = 500 ميكرون. (ج) مكبر نظرا لكلا المجلسين قبل وبعد الخلط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
"SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54426 / 54426fig4.jpg "/>
منحنيات النمو على رقاقة من هاء: الرقم 4 يتعرض القولونية لتركيزات مختلفة من TMP: (أ) من نوع البرية سلالة الأجداد و (ب) سلالة متحولة (في يوم 12). يبين نموذج متحولة زيادة كبيرة في مقاومة المضادات الحيوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (5): وحيدة الخلية الأشكال التضاريسية (أ - د) وصور مشرق الميدان من الخلية بعد العلاج مع المستويات دون كابح من TMP. لاحظ filamentation كبير من خلايا النوع البري في (ب)، الذي هو غائب في المسوخ (د ترونج>). لوحات (ه - ح) عبارة عن صور رقمية من (أ - د). وقد تم نقل كل الصور البكتيرية بواسطة كاميرا CCD مع هدف التكبير 40X. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: الأبعاد وتجميع صاحب ثقافة قارورة الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: مخطط الرسم البياني لLED و photodetector الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
رقيقة الصفحات = "1"> كود التكميلي: السيناريو مخصص لحساب عدد الخلايا من الصور خلية تم الحصول عليها من رقائق ميكروفلويديك الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
| عينة | TMP المخدرات (ميكروغرام / مل) | |||||||||||
| يوم 1-3 | 0 | 0.06 | 0.12 | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | |
| اليوم 4 | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| يوم 5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <td> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| يوم 12/8 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 1000 | 2000 | |
يتم عرض تركيز الدواء يستخدم لتحديد IC 50 في تركيزات الدواء لوحة القارئ قياس في وحدة من ميكروغرام / مل لعينة المجمدة اليومية: الجدول 1. كما تتطور الخلايا أعلى مقاومة للأدوية، وزيادة تركيزات دواء يستخدم وفقا لذلك.
| لا | موقع | SNP | ملاحظة |
| 1 | 49894 | ج> T | |
| 2 | 49910 | تي> و | الجينات DHFR |
| 3 | 49795 | ج> T | DHFR المروج |
الجدول 2: الطفرة في DHFR التي حددها سانجر تسلسل وتشير البيانات إلى تسلسل التمثيلية الثلاث طفرات نقطة DHFR في متحولة-اليوم الأخير (يوم 12). مناطق المروج والجينات تحتوي على واحد و 2 تعدد الأشكال، على التوالي. كانت الاشعال إلى الأمام وعكس المستخدمة في PCR 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 "و3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وأظهر الجهاز morbidostat البصمة المنخفضة من مكونات منخفضة التكلفة. الزيادات في مستوى مقاومة الجراثيم للأدوية المسجلة من قبل الجهاز متوافقة مع تلك التقارير السابقة 5. مصممة للدراسات التطورية للمقاومة المخدرات، والجهاز هو الواجب التطبيق المحتمل لكثير من التجارب الأخرى. أولا، قاعدة بيانات شاملة للطفرات المخدرات التي يسببها يمكن أن تنشأ عن مجموعة كبيرة من المضادات الحيوية ذات الصلة سريريا. على سبيل المثال، المسار التطوري للمقاومة الجراثيم للأدوية المتعددة يمكن دراستها ببساطة عن طريق زيادة عدد الأدوية المستخدمة في التجربة. والميزة الرئيسية لوحدة ذكرت هنا هي كونفيغورابيليتي لها مرونة، مما يتيح على نطاق واسع، والتجارب موازية تحت ظروف تجريبية مختلفة.
وعلى الرغم من تظاهر المفهوم في القياسات على microfluidics، وبصلاحية التحقيق يمكن تحسينها من خلال الجمع بين التكنولوجيا على microfluidics مع الموائعية 23. التكلفة لكليتم تقليل القياس (وفورات الحجم) بشكل كبير من استهلاك كاشف خفض وتقليص العمالة. هنا، البيانات خلية واحدة التشكل يمكن استخراجها من منصة ميكروفلويديك. في الآونة الأخيرة، وقد تم تنفيذ الاختبار التشكل ميكروفلويديك من الخلايا وحيدة بنجاح في مختبرات الأحياء الدقيقة السريرية، ويؤدي نسبيا إلى مرق القياسية الاختبارات التخفيف المتسلسل (24). مع تزايد توافر أجهزة ميكروفلويديك، والتقنيات مجتمعة تمكين نطاق واسع، والإنتاجية العالية التجارب تطور المختبر.
عدة خطوات حاسمة لتشغيل morbidostat. أولا، لأن تشكيل وحدة التحريك المغناطيسية من المغناطيس ومروحة التبريد، من الأهمية بمكان لتحقيق المواءمة بين رمح المروحة إلى القارورة الثقافة. أيضا، والمسافة بين القارورة الثقافة والمغناطيس حرجة للغاية لضمان تشغيل مستقر. ثانيا، والتحول إلى قارورة ثقافة جديدة في بداية التجربة كل يوم والمهم أيضاتجنب تشكيل بيوفيلم. خلاف ذلك، يمكن أن تحدث تشكيل بيوفيلم في غضون 2 أو 3 أيام. ثالثا، لE. وإذابة العينات القولونية يوميا من عينة المجمدة خلال تجربة كل يوم لضمان الاتساق، من المهم أن تحدد فترة تأخير لا يقل عن 4 ساعة لتجنب غسل الكلي من الميكروبات. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن يختار عدم تجميد E. عينات القولونية واستخدام مباشرة العينة لتطعيم قارورة ثقافة جديدة لبدء ثقافة جديدة.
في مكان عملي، يجب تصميم النظام الحالي التغلب على العديد من القيود على تمديد استخداماتها المحتملة. حجم النظام برمته يقتصر حاليا على المديين المتوسط المستهلكة يوميا (خلال عملية chemostatic، واحدة قارورة الثقافة تستهلك حوالي 0.5 لتر من المتوسط يوميا بمعدل تخفيف نموذجية من 0.33 ساعة -1). للحد من حجم العمل، ومزيد من التحسين يمكن تحقيق ذلك عن طريق محاكاة دقيقة على الديناميات السكانية المأهولة المخدرات مع plumbiنانوغرام المعلمات 25.
وأخيرا، فإن morbidostat غير قابلة للتكيف بسهولة إلى مجموعة واسعة من التجارب ثقافة البكتيرية. على سبيل المثال، عن طريق ربط الصمام الثنائي الباعث للضوء، يمكن إعادة تكوين النظام باعتباره الصور مفاعل حيوي، مما يتيح رصد التطور من البكتيريا الزرقاء أو الجزئي الطحالب 26. ويمكن تمديد وحدة لاهوائية وزراعة microaerobic في وعاء محكم الغاز مع الماصة التي كتبها لاسلكيا تشغيل الجهاز في البطارية. وكمثال آخر، وتركيز مادة سامة يمكن أن تزداد تدريجيا إلى هندسة سلالات مقاومة لهذه المادة الكيميائية الهدف 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
