骨髓增殖性肿瘤的转导-移植小鼠模型

摘要

本文描述了建立转导-移植小鼠模型所使用的方法学。详细阐述了进行骨髓移植时应避免的技术性错误。读者应清楚理解高病毒滴度、转染/转导以及照射的重要性。

摘要

转导-移植是一种在小鼠中快速高效地建立人类血液系统恶性肿瘤模型的方法。该技术可实现目的基因在造血细胞中的表达，可用于研究该基因在正常和/或恶性造血过程中的作用。本方案以骨髓增殖性肿瘤（MPN）中 recently 发现的钙网蛋白（CALR）突变为示例，详细描述了如何进行转导-移植实验。在本方案中，从经5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的供体小鼠中获取全骨髓细胞，用编码突变型CALR的逆转录病毒进行转导，然后移植到经致死剂量照射的同系受体小鼠体内。表达突变型CALR的供体细胞通过绿色荧光蛋白（GFP）进行标记。移植后的小鼠表现出MPN表型，包括外周血血小板升高、骨髓中巨核细胞增多以及骨髓纤维化。我们逐步介绍了如何制备逆转录病毒、测定病毒滴度、转导全骨髓细胞以及将细胞移植至经照射的受体小鼠。

引言

转导-移植是用于在小鼠中建立血液系统恶性肿瘤模型的一种有效方法。该技术在髓系恶性肿瘤研究中尤为有价值，最早可追溯到首次证明异位表达BCR-ABL1可在小鼠中真实再现慢性粒细胞白血病的研究¹。此后，该技术进一步推动了对携带JAK2^V617F和MPL^W515K/L突变的骨髓增殖性肿瘤（MPN）的广泛研究。

骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一组以成熟髓系细胞过度生成和骨髓纤维化为特征的血液系统恶性肿瘤。这类疾病通常起源于获得体细胞突变的造血干细胞的克隆性扩增，其突变基因包括 Jak2、MPL 或 CALR。通过转导-移植方法建立的 JAK2^V617F 和 MPL^W515K/L 小鼠模型可表现出真性红细胞增多症和骨髓纤维症的临床特征^2-5。最近，也已利用转导-移植方法成功构建了携带钙网蛋白突变的 MPN 小鼠模型⁶。这些小鼠表现出类似原发性血小板增多症的疾病表型，包括血小板增多、巨核细胞数量增加以及骨髓纤维化。总体而言，这些模型不仅为深入理解 MPN 的分子发病机制提供了重要工具，也为在临床前条件下开发和研究治疗策略提供了有力平台。

本论文详细描述了以 CALRdel52 突变为重点的转导-移植技术。该技术涉及将经逆转录病毒转导并表达突变构....

方案

本研究经加州大学欧文分校机构动物照护与使用委员会批准，并遵循其建议进行。所有操作均在异氟烷麻醉下实施，并尽一切努力减少动物痛苦。

1. 生态型逆转录病毒的产生

1. 使用商业化的质粒大提试剂盒或氯化铯纯化方法制备高质量质粒，浓度至少达到 1 µg/µl。
   注意： 这些包括一个携带目的基因（此处为 CALR）的 MSCV 骨架载体^7,8）以及所选标记（GFP、Neo， 等等。以及一种编码gag-pol-env的嗜亲性包装质粒（下文简称质粒）。
2. 解冻并扩增低代次293T细胞，使用添加10% FBS、L-谷氨酰胺及青霉素/链霉素的DMEM培养基（D10）。接种5 × 10⁶个细胞⁶ 37 °C、5% CO₂的湿润化组织培养孵育箱中，置于10 cm组织培养处理皿内的细胞₂.
3. 在培养基中扩增293T细胞。转染前一天，加入1 ml PBS洗涤细胞，并用真空泵抽吸去除上清液。
4. 用胰蛋白酶消化细胞时，加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶，于 37 °C、5% CO₂ 的湿润化组织培养孵箱中孵育培养皿 2–3 分钟。₂.
5. 为终止胰蛋白酶消化，向培养皿中加入 3 ml D10 培养基，将细胞转移至 15 ml 圆锥形离心管中。在 400 x g 条件下离心 10 分钟。

结果

转导-移植技术可使表达目的基因的细胞在受体小鼠中实现造血重建。图1展示了携带钙网蛋白突变的骨髓增殖性肿瘤（MPN）小鼠模型的转导-移植流程概览。简言之，使用表达CALRwt或CALRdel52的逆转录病毒去感染来自C57B/6供体小鼠的骨髓（BM）细胞。将转导后的细胞移植至经照射处理的C57B/6受体小鼠体内，供体细胞的植入通常在移植后第一个月内完成。疾病表型的迹象在移植后3个月开始显现，表现为小鼠血小板和巨核细胞数量增加，随后在移植后6至10个月出现骨髓纤维化。若供体细胞未能成功植入，小鼠可能在移植后前两周内死亡。除注射操作不当或注射过程中造成创伤外，其他技术性错误也可能导致转导细胞植入不良或小鼠死亡。例如，受体小鼠接受的照射剂量不足时，大多数造血细胞将来源于受体自身而非供体。相反，若照射剂量过高，则可能导致小鼠出现辐射诱导的疾病甚至死亡。病毒滴度过低将导致供体细胞感染效率下降，结果仅有少量供体细胞表达目的基因，从而可能导致小鼠无法表现出预期的表型。因此，使用高滴度病毒对供体细胞进行转导至关重要。图2展.......

讨论

本方案详细描述了如何在小鼠中进行骨髓移植，以重现一种由CALRdel52突变驱动的、类似于原发性血小板增多症并进展为骨髓纤维化的疾病。成功移植表达CALRdel52的细胞后，可导致血小板升高、巨核细胞扩增以及骨髓纤维化。由于骨髓移植是一个多步骤的过程，必须注意识别可能产生技术误差的环节，以避免表达目标基因的细胞植入不良，甚至导致小鼠死亡。

在转导-移植模型中，一个常被忽视的关键因素是病毒的质量。高滴度的病毒有助于实现良好的转导效率，从而为疾病建模提供坚实的基础；而使用低滴度病毒则会导致较少细胞表达目的基因。通过使用能够增加病毒与细胞接触的试剂（如聚凝胺和逆转录病毒结合蛋白）可提高转导效率。即使使用高浓度病毒，造血干细胞（HSCs）的转导仍较为困难，因为嗜鼠类逆转录病毒仅感染分裂中的细胞。"预刺激"培养基（含有SCF、IL-3和IL-6）的作用是诱导静息状态的HSC进入细胞周期。如果需要感染非分裂细胞，可以采用慢病毒系统作为替代方法。

另一个可能影响病毒产生的因素是所使用的转染试剂类型。最佳转染试剂应通过实验经验.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞系
DMEM	Corning	MT-10-013-CV
293T 细胞	ATCC	CRL-11268
3T3 细胞	ATCC	CRL-1658
质粒
EcoPak，也称为 pCL-Eco	Addgene	12371	可使用如 EcoPack 2-293 等逆转录病毒包装细胞系替代 EcoPak 质粒与标准 293T 细胞。其他 γ-逆转录病毒包膜和包装质粒可从 Addgene 等供应商获得。
MSCV-IRES-GFP (MIG)	Addgene	20672	其他 γ-逆转录病毒转移质粒可从 Addgene 等供应商获得。
耗材
27 G x 1/2" 针头	BD	305620
胎牛血清	Corning	MT-35-010-CV
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺	Corning	MT-30-009-CI
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)	Corning	MT-25-052-CI	可自行配制
PBS	Corning	MT-21-031-CV
10 cm 培养皿	Fisher	172931
15 ml 锥形管	Fisher	12565268
60 mm 培养皿	Fisher	150288
Polybrene	Fisher	NC9840454
5-FU	Fisher	A13456-06
100 µm 细胞筛	Fisher	22363549
50 ml 锥形管	Fisher	12565270
6 孔板	Fisher	130184
FACS 管	Fisher	14-959-5
0.45 μm 注射器滤器	Fisher	0974061B
Opti-MEM	Gibco	31985-070
ACK 缓冲液	Lonza	10-548E	可自行配制
重组小鼠 IL-3	Peprotech	213-13
重组小鼠 IL-6	Peprotech	216-16
重组小鼠 SCF	Peprotech	250-03
X-tremeGENE 9	Roche	6365809001	转染试剂
1.5 ml 离心管	USA Scientific	1615-5500
设备
BD Accuri C6
X 射线照射仪