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方法文章

骨髓增殖性肿瘤的转导-移植小鼠模型

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DOI：

10.3791/54624

⸱

2016年12月22日

 ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, University of California, Irvine

本文内容

摘要

本文描述了建立转导-移植小鼠模型所使用的方法学。详细阐述了进行骨髓移植时应避免的技术性错误。读者应清楚理解高病毒滴度、转染/转导以及照射的重要性。

摘要

转导-移植是一种在小鼠中快速高效地建立人类血液系统恶性肿瘤模型的方法。该技术可实现目的基因在造血细胞中的表达，可用于研究该基因在正常和/或恶性造血过程中的作用。本方案以骨髓增殖性肿瘤（MPN）中 recently 发现的钙网蛋白（CALR）突变为示例，详细描述了如何进行转导-移植实验。在本方案中，从经5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的供体小鼠中获取全骨髓细胞，用编码突变型CALR的逆转录病毒进行转导，然后移植到经致死剂量照射的同系受体小鼠体内。表达突变型CALR的供体细胞通过绿色荧光蛋白（GFP）进行标记。移植后的小鼠表现出MPN表型，包括外周血血小板升高、骨髓中巨核细胞增多以及骨髓纤维化。我们逐步介绍了如何制备逆转录病毒、测定病毒滴度、转导全骨髓细胞以及将细胞移植至经照射的受体小鼠。

引言

转导-移植是用于在小鼠中建立血液系统恶性肿瘤模型的一种有效方法。该技术在髓系恶性肿瘤研究中尤为有价值，最早可追溯到首次证明异位表达BCR-ABL1可在小鼠中真实再现慢性粒细胞白血病的研究1。此后，该技术进一步推动了对携带JAK2V617F和MPLW515K/L突变的骨髓增殖性肿瘤（MPN）的广泛研究。

骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一组以成熟髓系细胞过度生成和骨髓纤维化为特征的血液系统恶性肿瘤。这类疾病通常起源于获得体细胞突变的造血干细胞的克隆性扩增，其突变基因包括 Jak2、MPL 或 CALR。通过转导-移植方法建立的 JAK2V617F 和 MPLW515K/L 小鼠模型可表现出真性红细胞增多症和骨髓纤维症的临床特征2-5。最近，也已利用转导-移植方法成功构建了携带钙网蛋白突变的 MPN 小鼠模型6。这些小鼠表现出类似原发性血小板增多症的疾病表型，包括血小板增多、巨核细胞数量增加以及骨髓纤维化。总体而言，这些模型不仅为深入理解 MPN 的分子发病机制提供了重要工具，也为在临床前条件下开发和研究治疗策略提供了有力平台。

本论文详细描述了以 CALRdel52 突变为重点的转导-移植技术。该技术涉及将经逆转录病毒转导并表达突变构建体的骨髓细胞移植到经照射的同系受体小鼠体内。

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方案

本研究经加州大学欧文分校机构动物照护与使用委员会批准，并遵循其建议进行。所有操作均在异氟烷麻醉下实施，并尽一切努力减少动物痛苦。

1. 生态型逆转录病毒的产生

  1. 使用商业化的质粒大提试剂盒或氯化铯纯化方法制备高质量质粒，浓度至少达到 1 µg/µl。
    注意： 这些包括一个携带目的基因（此处为 CALR）的 MSCV 骨架载体7,8）以及所选标记（GFP、Neo， 等等。以及一种编码gag-pol-env的嗜亲性包装质粒（下文简称质粒）。
  2. 解冻并扩增低代次293T细胞，使用添加10% FBS、L-谷氨酰胺及青霉素/链霉素的DMEM培养基（D10）。接种5 × 10⁶个细胞6 37 °C、5% CO₂的湿润化组织培养孵育箱中，置于10 cm组织培养处理皿内的细胞2.
  3. 在培养基中扩增293T细胞。转染前一天，加入1 ml PBS洗涤细胞，并用真空泵抽吸去除上清液。
  4. 用胰蛋白酶消化细胞时，加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶，于 37 °C、5% CO₂ 的湿润化组织培养孵箱中孵育培养皿 2–3 分钟。2.
  5. 为终止胰蛋白酶消化，向培养皿中加入 3 ml D10 培养基，将细胞转移至 15 ml 圆锥形离心管中。在 400 x g 条件下离心 10 分钟。
  6. 吸弃上清液至真空瓶中，将细胞沉淀重悬于 2 ml D10 培养基中。
  7. 使用血细胞计数板，通过台盼蓝排斥法对细胞进行计数。
  8. 接种 2 × 106 每种病毒接种至三个10 cm经组织培养处理的培养皿中，每皿细胞数相同。
    注意为获得最佳结果，转染时细胞汇合度不应超过30–50%，否则可能导致病毒产量低下。
  9. 转染前立即用真空泵吸除培养基，并更换为5 ml新鲜D10培养基。
  10. 为每个需转染的10 cm培养皿准备一支单独的无菌1.5 ml微量离心管。
  11. 将760 µl低血清培养基移入每个微量离心管中，然后小心地将40 µl转染试剂直接加入培养基中。室温下在组织培养超净台中孵育5分钟。
  12. 向每根试管中加入30 µg含目的基因的MSCV载体（若使用空载体则为15 µg）以及5 µg质粒，用移液器轻轻吹打混匀。在组织培养罩内室温孵育额外15分钟。
    注意： 较小的载体往往具有较高的病毒产量。
  13. 将每个反应的总体积（约 800 µl）小心地逐滴加入相应的 10 cm 培养皿中，轻轻左右倾斜培养皿以混匀。将细胞放回加湿的组织培养孵箱中。
  14. 在组织培养箱中孵育8小时或过夜后，用真空吸液瓶吸除培养基，并轻轻加入10 ml新鲜D10培养基。
  15. 转染后48小时，将上清液收集至35 ml注射器中，经0.45 µm滤膜过滤以去除细胞碎片。
  16. 可选：向293T细胞中重新加入10 ml新鲜D10培养基，可在转染后72小时再次收集病毒。
  17. 当不再收集病毒时，将293T细胞弃置于生物危害废物中。
  18. 将病毒上清液分装至单次使用体积（例如，1 ml用于病毒滴度测定，6.5 ml用于骨髓感染）。用液氮速冻病毒，并于-80 °C保存。
    注意： 避免反复冻融，因为这会显著降低病毒滴度。

2. 通过流式细胞术测定相对病毒滴度

  1. 解冻3T3细胞，并在D10培养基中维持培养。将细胞接种于10 cm组织培养处理皿中，在37 °C、5% CO2的加湿组织培养孵箱中培养。
  2. 以三复孔进行病毒滴度测定。细胞准备步骤：加入1 ml PBS洗涤细胞，用真空瓶吸除上清液。
  3. 消化细胞时，加入2 ml 0.05%胰蛋白酶，将培养皿置于37 °C、5% CO2的加湿组织培养孵箱中孵育。
  4. 为终止胰酶消化，向培养皿中加入3 ml D10，将细胞转移至15 ml锥形管中，以400 × g离心10分钟。
  5. 用真空瓶吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2 ml D10中。
  6. 使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法计数细胞。
  7. 以每皿1 × 105个细胞的密度将3T3细胞接种至十五个60 mm组织培养处理皿中，过夜培养。
  8. 使用D10将解冻后的病毒上清液分别稀释为1:3、1:10、1:30和1:100，总体积为1 ml。同时设置无病毒对照组。
  9. 用真空瓶吸除3T3细胞的培养基，更换为4 ml D10。
  10. 将不同稀释度的病毒上清液覆盖至3T3细胞上，并向每皿中加入聚凝胺（polybrene），使其终浓度为8 µg/ml。在37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中孵育48小时。
  11. 通过流式细胞术测定相对病毒滴度：
    1. 洗涤细胞：用真空瓶吸除培养基，加入5 ml PBS。
    2. 用真空瓶吸除PBS，加入1 ml 0.05%胰蛋白酶，在37 °C孵育2–5分钟，使细胞从培养皿上脱落。
    3. 加入3 ml D10，反复吹打以使残留细胞完全脱落，将细胞转移至FACS管中，以400 × g离心10分钟。
    4. 倾去上清液，用3 ml PBS洗涤细胞，以400 × g离心10分钟，弃上清液，将细胞重悬于200 µl PBS中。
    5. 将细胞上流式细胞仪9检测。在活细胞门控（由FSC vs. SSC确定）内采集20,000–30,000个事件，计算GFP+和GFP-细胞的百分比。
      注意：当病毒上清液1:30稀释时，若GFP+ 3T3细胞比例达到至少50%，则认为病毒滴度合格。若该稀释度下GFP+细胞比例低于50%，可能导致转导效率不理想。病毒滴度计算方法参考Limon et al., Blood (1997)9。
    6. 计算相对病毒滴度的公式为：病毒滴度 = 形成单位（PFU）/ml = [（3T3细胞数量 × GFP+细胞频率）/ 上清液体积（ml）] × 稀释倍数。

3. 转导供体骨髓细胞

  1. 为准备用于骨髓（BM）采集的供体小鼠，首先使用异氟烷挥发器以5%浓度的异氟烷和1 L/min流速的补充氧气进行麻醉。通过夹捏足部评估小鼠反应性。
    注意： 供体小鼠（8周龄以下）应在骨髓采集前5天（移植前8天）进行准备。一只供体小鼠提供的细胞足以用于至少2只受体小鼠。
  2. 使用27 G × ½"针头，通过眶后静脉注射方式，向麻醉小鼠注射150 mg/kg的5-氟尿嘧啶（5-FU）。
    警告！ 5-FU 是一种抗癌化疗药物。操作 5-FU 时务必在经认证的化学通风橱或管道式生物安全柜内进行。请咨询所在机构的实验室与动物安全委员会，以确定经 5-FU 处理小鼠的适当标识方式。
    1. 将麻醉后的小鼠侧置，用拇指和食指固定，使眼睛略微突出于头部。
    2. 从针头位于内眦外侧、针尖斜面朝上开始，以45°角向内侧方向进针，插入至针头一半深度时停止。缓慢注射细胞，然后小心拔出针头。
      注意： 如果该技术操作正确，眼球应轻微回缩，且针头插入时不应感到阻力。
    3. 检查小鼠是否有任何损伤迹象，例如肿胀或出血。
  3. 在5-FU处理后第5天获取骨髓（移植前3天）。
    1. 使用异氟烷蒸气发生器（5% 异氟烷，1 L/min 氧气作为补充）对小鼠进行麻醉。通过夹捏足部评估其反应性。
    2. 通过颈椎脱位处死小鼠。用70%乙醇充分喷洒小鼠体表至毛发湿润，进行消毒。
    3. 使用解剖剪在皮肤上做切口，并将筋膜从腿部肌肉上分离。接着，通过在髋部切断股骨、在踝部切断胫骨，将腿部从小鼠身上分离。
    4. 弯曲腿部呈 "L" 用解剖剪在膝关节处切割，将每根腿骨按形状分离。
    5. 使用解剖剪轻轻刮除每根腿骨远端的肌肉，使肌肉向腿骨一端聚集，直至软骨脱离。
    6. 使用带有27 G × ½英寸针头的注射器，将每根腿骨中的液体经100 µM尼龙膜冲洗至50 ml锥形管中，冲洗液为含2% FBS的PBS。持续冲洗至骨组织变白，以最大限度获取细胞。
    7. 使用注射器的推杆将细胞通过尼龙膜压入50 ml离心管中，以获得单细胞悬液。对另一只小鼠后肢重复上述操作。
  4. 在 4 °C 条件下以 400 × g 离心细胞 10 分钟，弃上清液。用 5 ml 氯化铵钾（ACK）缓冲液重悬骨髓细胞，以裂解红细胞。将细胞置于冰上孵育 10 分钟。
  5. 用 PBS 填充管子以终止细胞裂解。在 4 °C 下以 400 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。如果骨髓沉淀呈红色，则重复裂解步骤。
  6. 用5 ml PBS重悬细胞，使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法计数细胞。
  7. 将细胞重悬于 2 x 106 每毫升加入2×预刺激混合液，该混合液含有添加了20%胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、IL-3（14 ng/ml）、IL-6（24 ng/ml）和SCF（112 ng/ml）的DMEM培养基。在6孔板中每孔接种2 ml。
  8. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下将细胞孵育过夜2.
  9. 向每孔含有骨髓细胞的培养孔中加入 2 ml 病毒上清液，并加入 polybrene（8 µg/ml）。在 30 °C、1,500 × g 条件下离心 90 分钟，然后将培养板放回组织培养孵箱中过夜。
  10. 将细胞悬液用移液器转移至锥形管中，在 4 °C、400 x g 条件下离心 10 分钟，不要丢弃培养板。每孔用 2 ml 新鲜的 2x 预刺激混合液重悬细胞，并将细胞返回至原来的孔中。
  11. 进行2nd 通过重复步骤 3.7–3.9 进行离心接种。

4. 将供体细胞移植到受体小鼠体内

  1. 准备同基因型受体小鼠，通过致死剂量全身照射进行移植前处理 < 注射骨髓细胞前24小时。
    注意BALB/c小鼠的致死剂量照射通常为800–900 cGy，C57B/6小鼠则为1,000–1,200 cGy10剂量通常分为两次照射，两次之间至少间隔3-4小时。
  2. 继步骤 3.11，轻柔吹打上清液，将转导后的供体细胞从 6 孔板中收集至锥形管中。用 1 ml PBS 清洗每孔，收集残留细胞并加入 50 ml 锥形管中。
  3. 向孔中加入0.5 ml 0.05%胰蛋白酶，于37 °C组织培养孵箱中孵育5 min。
  4. 向孔中加入 1 ml D10，通过轻柔吹打使残留细胞脱落。将细胞加入步骤 4.2 中对应的离心管中，在 4 °C、400 × g 条件下离心 10 分钟，收集细胞沉淀。
  5. 用 PBS 洗涤细胞，在 4 °C、400 x g 条件下离心 10 分钟。用 5 ml PBS 重悬细胞，通过台盼蓝排斥法使用血细胞计数板进行细胞计数。
    注意：如果载体带有GFP标签，则使用流式细胞仪定量GFP阳性细胞的百分比。
  6. 重悬 5 × 105 -  2 x 106 50 - 100 µl PBS 中的细胞，用于注射小鼠。
  7. 使用无菌的27 G × ½"针头，通过眶后注射将细胞注入麻醉小鼠体内。
    注意： 其他注射技术包括尾静脉、脾脏或股骨注射。
    1. 使用异氟烷麻醉小鼠，并通过捏足判断其反应性。
    2. 将小鼠侧卧放置，用拇指和食指固定，使眼睛略微突出于头部。
    3. 针尖斜面向上，以45°角将针头插入内眦外侧。
      注意： 如果该技术操作正确，眼球应轻微回缩，且针头插入时不应感到阻力。
    4. 检查小鼠是否有任何损伤迹象，例如肿胀或出血。
      注意： 移植后数周内，小鼠的血细胞计数会偏低，因此易受感染。可采用抗生素预防或使用酸化水。
  8. 移植后一个月，通过流式细胞术检测外周血中GFP阳性细胞百分比，作为供体细胞植入情况的指标。
    注意： 单独使用GFP无法确定细胞移植是否成功。病毒转导可能失败，但移植仍可能发生。在这种情况下，不会出现GFP+ 可检测到细胞，但移植细胞的植入是成功的。
    1. 用21 G × 1½英寸注射器穿刺隐静脉采集10 µl外周血，加入含100 mM EDTA的PBS中以防止凝血。
    2. 加入1 ml ACK裂解液至血液中，冰上裂解10分钟。以400 × g离心10分钟，收集细胞沉淀。
    3. 在真空抽滤瓶中吸去上清液，加入1 ml含2% FBS的PBS以终止裂解。在400 × g离心10 min，沉淀细胞。
    4. 用真空抽滤瓶吸除上清液，将沉淀重悬于100 µl含2% FBS的PBS中。
    5. 在流式细胞仪上运行样本，并在活细胞门控（由FSC确定）内收集300,000个事件 与 SSC）并计算GFP阳性细胞的百分比+ 和 GFP- 细胞9.
  9. 移植后1个月时，还需使用全自动兽用血液学分析仪进行全血细胞计数（CBC）18 以监测疾病进展。
    注意： 每月通过外周血中GFP百分比和全血细胞计数（CBC）监测疾病进展。
  10. 实验终止时，使用异氟烷麻醉小鼠，并通过捏足评估其反应性。采用颈椎脱位法处死小鼠，取脾脏和骨髓用于组织病理学检查。
    注意： 实验时长具有主观性，终止时间应根据预期的疾病表型进行评估。

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结果

转导-移植技术可使表达目的基因的细胞在受体小鼠中实现造血重建。图1展示了携带钙网蛋白突变的骨髓增殖性肿瘤（MPN）小鼠模型的转导-移植流程概览。简言之，使用表达CALRwt或CALRdel52的逆转录病毒去感染来自C57B/6供体小鼠的骨髓（BM）细胞。将转导后的细胞移植至经照射处理的C57B/6受体小鼠体内，供体细胞的植入通常在移植后第一个月内完成。疾病表型的迹象在移植后3个月开始显现，表现为小鼠血小板和巨核细胞数量增加，随后在移植后6至10个月出现骨髓纤维化。若供体细胞未能成功植入，小鼠可能在移植后前两周内死亡。除注射操作不当或注射过程中造成创伤外，其他技术性错误也可能导致转导细胞植入不良或小鼠死亡。例如，受体小鼠接受的照射剂量不足时，大多数造血细胞将来源于受体自身而非供体。相反，若照射剂量过高，则可能导致小鼠出现辐射诱导的疾病甚至死亡。病毒滴度过低将导致供体细胞感染效率下降，结果仅有少量供体细胞表达目的基因，从而可能导致小鼠无法表现出预期的表型。因此，使用高滴度病毒对供体细胞进行转导至关重要。图2展...

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讨论

本方案详细描述了如何在小鼠中进行骨髓移植，以重现一种由CALRdel52突变驱动的、类似于原发性血小板增多症并进展为骨髓纤维化的疾病。成功移植表达CALRdel52的细胞后，可导致血小板升高、巨核细胞扩增以及骨髓纤维化。由于骨髓移植是一个多步骤的过程，必须注意识别可能产生技术误差的环节，以避免表达目标基因的细胞植入不良，甚至导致小鼠死亡。

在转导-移植模型中，一个常被忽视的关键因素是病毒的质量。高滴度的病毒有助于实现良好的转导效率，从而为疾病建模提供坚实的基础；而使用低滴度病毒则会导致较少细胞表达目的基因。通过使用能够增加病毒与细胞接触的试剂（如聚凝胺和逆转录病毒结合蛋白）可提高转导效率。即使使用高浓度病毒，造血干细胞（HSCs）的转导仍较为困难，因为嗜鼠类逆转录病毒仅感染分裂中的细胞。"预刺激"培养基（含有SCF、IL-3和IL-6）的作用是诱导静息状态的HSC进入细胞周期。如果需要感染非分裂细胞，可以采用慢病毒系统作为替代方法。

另一个可能影响病毒产生的因素是所使用的转染试剂类型。最佳转染试剂应通过实验经验...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 V 基金会学者奖（AGF）和 MPN 研究基金会（AGF）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞系
DMEMCorningMT-10-013-CV
293T 细胞ATCCCRL-11268
3T3 细胞ATCCCRL-1658
质粒
EcoPak，也称为 pCL-EcoAddgene12371可使用如 EcoPack 2-293 等逆转录病毒包装细胞系替代 EcoPak 质粒与标准 293T 细胞。其他 γ-逆转录病毒包膜和包装质粒可从 Addgene 等供应商获得。
MSCV-IRES-GFP (MIG)Addgene20672其他 γ-逆转录病毒转移质粒可从 Addgene 等供应商获得。
耗材
27 G x 1/2" 针头BD305620
胎牛血清CorningMT-35-010-CV
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺CorningMT-30-009-CI
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)CorningMT-25-052-CI可自行配制
PBSCorningMT-21-031-CV
10 cm 培养皿Fisher172931
15 ml 锥形管Fisher12565268
60 mm 培养皿Fisher150288
PolybreneFisherNC9840454
5-FUFisherA13456-06
100 µm 细胞筛Fisher22363549
50 ml 锥形管Fisher12565270
6 孔板Fisher130184
FACS 管Fisher14-959-5
0.45 μm 注射器滤器Fisher0974061B
Opti-MEMGibco31985-070
ACK 缓冲液Lonza10-548E可自行配制
重组小鼠 IL-3Peprotech213-13
重组小鼠 IL-6Peprotech216-16
重组小鼠 SCFPeprotech250-03
X-tremeGENE 9Roche6365809001转染试剂
1.5 ml 离心管USA Scientific1615-5500
设备
BD Accuri C6
X 射线照射仪

参考文献

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钙网蛋白突变骨髓移植逆转录病毒转导GFP表达造血细胞病毒滴度计算5-FU处理辐照受体小鼠
骨髓增殖性肿瘤的转导-移植小鼠模型
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