Summary
Denne protokol beskriver frembringelsen af murine ortotopisk blæretumorer i C57BL / 6J-mus og overvågning af tumorvækst.
Abstract
Denne protokol beskriver genereringen af blæretumorer i C57BL / 6J mus under anvendelse af murine blærekræft cellelinje MB49, der er blevet modificeret til at udskille human prostataspecifikt antigen (PSA), og proceduren til bekræftelse af tumorimplantation. Kort fortalt er musene bedøvet ved anvendelse injicerbare lægemidler og er lavet til at lægge i rygleje. Urin er forladt fra blæren og 50 pi af poly-L-lysin (PLL) langsomt indpodet med en hastighed på 10 gl / 20 s under anvendelse af en 24 G IV-kateter. Det overlades i blæren i 20 minutter ved tilstoppet kateteret. Kateteret fjernes, og PLL er forladt af let tryk på blæren. Dette efterfølges af inddrypning af den murine blærecancer-cellelinje (1 x 10 5 celler / 50 pi) med en hastighed på 10 pi / 20 s. Kateteret tilproppet at forhindre for tidlig evakuering. Efter 1 time musene genoplivet med en vending lægemiddel, og blæren er forladt. Den langsomme instillation sats er vigtig,da det reducerer vesico-ureteral reflux, hvilket kan forårsage tumorer at forekomme i de øvre urinveje og i nyrerne. Cellelinien skal være godt resuspenderes at reducere sammenklumpning af celler, da dette kan føre til ujævn tumorstørrelser efter implantation.
Denne teknik inducerer tumorer med høj effektivitet. Tumorvækst monitoreres ved urin PSA sekretion. PSA markør overvågning er mere pålidelig end ultralyd eller fluorescens billeddannelse til påvisning af tilstedeværelsen af tumorer i blæren. Tumorer i mus generelt nå en maksimal størrelse, der negativt påvirker sundhed af omkring 3 - 4 uger, hvis venstre ubehandlet. Ved at overvåge tumorvækst, er det muligt at differentiere mus, der blev hærdet fra dem, der blev ikke held implanteret tumorer. Med kun end-point analyse, kan sidstnævnte være fejlagtigt antages at være blevet helbredt ved terapi.
Introduction
Målet med denne fremgangsmåde er at generere murine ortotopisk blæretumorer og overvåge de implanterede tumorer så præcist som muligt, således at mus uden tumorimplantation ikke menes at være blevet hærdet ved slutpunktsanalyse. Samlet set viste metode vil reducere behovet for et stort antal mus til eksperimentel analyse og sikre større nøjagtighed ved bestemmelse terapeutiske resultater.
Udviklingen af et ortotopisk model for kræft er vigtig, da implanterer tumorceller subkutant ikke rekapitulere miljøet af den kliniske sygdom eller muliggøre udviklingen af terapeutiske strategier. Arkitekturen af blæren tillader inddrypning af blæren cancerterapier direkte ind i blæren med minimale systemiske virkninger. Således dyremodeller der rekapitule- dette miljø, såsom en orthotopisk model, er vigtigt at evaluere nye behandlingsformer. Konklusionerne fra enhver forsøgsopstilling er dependent ved begrænsningerne af modellen.
Adskillige teknikker er blevet udviklet til fremstilling af ortotopisk blæretumorer hos mus. Disse er afhængige af at beskadige glycosaminoglycan lag af blæren, så tumorceller, der skal implanteres. De anvendte teknikker omfatter elektrokirurgi, hvilket resulterer i et enkelt skader i blærevæggen, hvilket fører til tumorudvikling på samme sted i blæren 1,2. Men succesraten for tumorimplantation hjælp elektrokauterisation er operatørafhængigt mellem 10 - 90%, og det indeholder den fare, blærevæggen vil blive punkteret, hvilket fører til tumorer udvikler i bughulen. Kemisk cautery udføres ved hjælp af sølvnitrat, hvilke skader blærevæggen 3. Tilsvarende har syre blevet anvendt til at ødelægge blærevæggen 4. Trypsin er også blevet anvendt til at beskadige blæren samt 5. Disse fremgangsmåder kan resultere i udviklingen af mere end én tumor i blæren.Desuden er der fare for ødelæggelse blæren hvis kemikalierne efterlades i kontakt med blærevæggen for længe. Metoden er udviklet af Ninalga et al. anvender den positivt ladede poly-L-lysin (PLL) 6 molekyler til pels blærevæggen; dette muliggør de negativt ladede tumorceller til at klæbe til glycosaminoglycan lag af blæren. Denne metode resulterer generelt i mere end én tumor udvikler sig i blæren, men tumorimplantation er ved 80 - 100% 4,7. Teknisk set er det også den nemmeste procedure at udføre. For at sikre, at de tumorer, der udvikler er ret selv i størrelse, er det vigtigt, at tumorcellerne ikke er grupperet i store klumper før implantation.
For at evaluere terapeutisk effektivitet, er det bedst at udføre denne undersøgelse på mus med nogenlunde samme størrelse tumorer. Således er en god detektering system, der kan kvantificere tumorstørrelse hurtigt efter implantation er vigtig. Adskillige strategier har bin anvendes til at evaluere tumorer. Disse omfatter magnetisk resonans (MRI) 8-10, fluorescens 11, bioluminescens 12,13, ultralyd 14, og enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) 15,16. Mens MRI og ultralyd ikke kræver modifikationer af tumorcellerne, er der behov for følsomt udstyr og kontrastmidler til MRI. De fluorescence-, luminescence-, og ELISA-assays kræver ændring af tumorcellerne til at udtrykke markørproteiner, der kan opdages af disse metoder. For luminescens, er et substrat kræves til påvisning af luciferaseaktiviteten; der er således en ekstra skridt og øgede omkostninger. Både luminescens og fluorescens kræver specialiseret udstyr. At producere fluorescens, grønt fluorescerende protein (GFP) ringslutning, som katalyseres af molekylært oxygen, er påkrævet. Således kan GFP udtryk være variabel inden for en tumor masse afhængigt af adgang til ilt, hvilket gør dette en temmelig upålidelig markør
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt dyr arbejde levet op til de institutionelle Animal Care og brug Udvalg (IACUC) retningslinjer for brug af dyr og håndtering (Protokol nummer 084/12) på National University of Singapore.
1. Voksende MB49-PSA celler in vitro og Måling PSA Sekretion
- Oprethold murine blære cancerceller MB49-PSA 15 i fuldstændig Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mmol / l L-glutamin og 0,05 mg / mL penicillin-streptomycin i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Tilsæt 200 pg / ml hygromycin B til at opretholde selektionstryk af PSA-secernerende celler.
- For at bestemme PSA sekretion, plade 1 x 10 6 celler i en 6-brønds dyrkningsplade og inkuberes det ved 37 ° C i nærvær af 5% CO2 i 48 timer.
- To dage senere, indsamle supernatanten for PSA måling.
- Ved hjælp af en Pasteur-pipette, overføre supernatant til et 15 ml centrifugerør.
- Centrifuger i 5 minutter ved 250 xg for at fjerne flydende celler og debris. Hvis PSA testen udføres på en anden dag, Supernatanten opbevares ved - 30 ° C i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Hvis ikke, skal du fortsætte til næste trin med det samme.
- Bestem PSA koncentration på en menneske-frit PSA ELISA-kit 7.
- Opregne de udpladede celler.
- Ved hjælp af en Pasteur-pipette, vaske cellerne forsigtigt med 1 ml DMEM. Aspirer og helt fjerne medierne.
- Tilsæt 1 ml frisk medium og skrab forsigtigt med en celle skraber til at fjerne cellerne fra brønden.
- Overfør cellerne til et mikrocentrifugerør og re-suspendere dem grundigt for at sikre en enkelt-cellesuspension.
- Bland lige volumener af cellesuspension og en 0,4% trypan blå opløsning. Tæl de levende celler (som ikke tager op farvestoffet) ved hjælp af et hæmocytometer.
- Beregn PSA ekspression som ngPSA / ml medium / 10 6 celler. PSA ekspression af MB49-PSA-celler til implantation i mus er 80 - 120 ng / mL / 10 6 celler.
2. Bestemmelse af følsomhed PSA Målinger ved ELISA og Real-time PCR-analyse
- Plate MB49-PSA-celler i komplet DMEM medier i en 6-brønds kultur plade med forskellige mængder af forældrenes MB49 celler, således at der er et maksimum på 1 x 10 6 celler pr (dvs. 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, eller 10 6 MB49-PSA celler dyrkes med 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, eller 10 0 MB49 celler, henholdsvis).
- En dag senere, indsamle supernatanten for PSA måling, som beskrevet i trin 1.3. Bestem PSA koncentration på en menneske-frit PSA ELISA-kit 7.
- Ekstrahere RNA fra cellerne.
- lysereceller direkte i pladen ved at tilsætte 1 ml RNA ekstraktion reagens.
- Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur og overføre cellelysatet til et mikrocentrifugerør. Tilsæt 0,2 ml chloroform og vortex prøverne kraftigt i 15 s. Inkubere dem i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Centrifugeres prøverne ved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. overføre omhyggeligt den øvre vandige fase (0,5 ml) til et frisk rør uden at forstyrre interfasen.
- Tilsæt 0,5 ml isopropylalkohol. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Centrifugeres prøverne ved 12.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten fuldstændigt, uden at forstyrre RNA bundfald i bunden af røret.
- Vask pelleten gang med 1 ml 75% ethanol. Centrifuger ved 7.500 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern alle ethanol og Pellet lufttørre i 10 min.
- Opløs RNA i 30 pi af nuklease-frit vand. Der inkuberes i 5 minutter ved 60 ° C for at øge sålubility.
- Kvantificere RNA ved måling af absorbansen ved hjælp af ultraviolet (UV) spektroskopi ved 260 nm (A260). For at vurdere RNA renhed, måle absorbansen ved 280 nm (A280) og beregne A260 / A280-forholdet, som skal være over 1,6.
- Revers-transskribere cDNA fra 2 ug RNA.
- Forbered reaktionsblandingen på is og overføre den til 0,2 ml rør.
- Kort fortalt centrifugeres rørene at spinde ned indholdet og fjerne luftbobler.
- Indlæse rør i termiske cykler og udføre revers transkription under følgende betingelser: 60 minutter ved 37 ° C efterfulgt af 5 minutter ved 95 ° C. Når kørslen er færdig, holde cDNA prøverne ved 4 ° C.
- Opbevare prøverne ved - 30 ° C til langsigtet opbevaring.
- Udfør en real-time PCR-analyse for PSA og cytoplasmatisk beta actin. Beta actin anvendes til at normalisere prøverne. Udføre analysen på 100 ng revers transkriberet RNA i en 96-brønds plate. Analyserer alle prøver i tre eksemplarer. Udfør 40 cykler med følgende parametre: 2 minutter ved 50 ° C, 10 min ved 95 ° C, 15 s ved 95 ° C til denaturering, og 1 min ved 60 ° C. Indstil den laveste detektionsgrænse på en cyklus tærskel (CT) på 35; dermed er enhver prøve med en CT-værdi over 35 anses ikke påvises.
3. Opretholdelse tumorigeniciteten af MB49-PSA cellelinje
BEMÆRK: Langvarig vækst in vitro fører til et tab af tumorgenicitet. For at opretholde tumorgenicitet er MB49-PSA-cellelinje passeret gennem musen mindst en gang hvert 2. år.
- Celler.
- Harvest eksponentielt voksende celler ved at skrabe dem forsigtigt med en steril celle skraber. Bland lige volumener af cellesuspension og en 0,4% trypan blå opløsning. Tæl de levende celler ved hjælp af et hæmocytometer. Må ikke implanteres, hvis mere end 20% af cellerne er døde.
- Beregne mængden af levende celler kræves (1 x 107 celler / ml) og overføre dem til et 15 ml centrifugerør. Centrifuger ved 250 xg i 5 min ved 4 ° C og supernatanten. Re-suspendere cellepelleten i DMEM blank medier. Gentag vask tre gange for at fjerne alle spor af FBS før implantation.
- Hold cellesuspensionen på is indtil musene er klar til implantation.
- Implantere tumorcellerne subkutant i mus på den dorsale flanke.
- Bedøver en 4- til 6 uger gamle C57BL6 / J mus under anvendelse af en blanding af bedøvelsesmidler ketamin og medetomidin (75 mg / kg og 1 mg / kg), injiceret intraperitonealt ved 0,1 ml pr 10 g legemsvægt.
- Barbere den højre flanke ved at udsætte huden.
- Anvendelse af et par pincet, løft huden for at adskille den fra den underliggende muskel og injicere 0,1 ml af cellesuspensionen (1 x 10 6 celler) subkutant med en 24 G nål. Mens nålen fjernes, klemmes injektionsstedet i 5 til 10 s, således at tumorcellerne gøreikke sive ud af injektionsstedet.
- Genoplive musen med en subkutan injektion af atipamezol (1 mg / kg) ved 0,1 ml pr 10 g legemsvægt.
- Overvåg tumorvækst hver to dage ved måling tumordiameter hjælp skydelære. Tumorvolumen beregnes ved hjælp af formlen V = (ab 2) / 2, hvor "a" er den længste dimension og "b" er den vinkelrette bredde, både i mm.
- Når tumoren rumfang er mindst 50 mm 3 (ca. 7 dage), aflive musen med CO2. Udskære tumormassen med et par steril pincet og sakse under aseptiske betingelser og anbringes i DMEM.
- I en 6-brønds dyrkningsplade, hakke tumoren i små stykker under anvendelse af sterile skalpeller. Brug en 1 ml sprøjte stemplet som en "støder" yderligere at opsplitte tumoren.
- Tilsæt 3 ml komplet DMEM og opretholde cellerne i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Når cellerne holde sig til plate (mellem en og to dage), fjern medier, snavs og ikke-vedhæftende celler ved sugning forsigtigt med en steril Pasteur-pipette. Vask to gange med DMEM. Pas på ikke at forstyrre cellerne.
- Tilsæt 1 ml DMEM og høste cellerne ved skrabning dem med en celleskraber. At vælge og udvide enkeltkolonier, tælle cellerne under anvendelse af et hæmocytometer og plade 1 celle per brønd i en 96-brønds dyrkningsplade. Dyrke celler i DMEM med 200 ug / ml hygromycin B ved 37 ° C og 5% CO2.
- Skift medierne og antibiotikum hver 4 - 5 dage. Overvåg cellerne, indtil de er på omkring 80-90% sammenflydende. Re-plade cellerne på en 24-brønds kulturplade ved pipettering at fjerne celler fra brønden.
- Når cellerne i 24-brønds kulturplade er sammenflydende, fjerne dem ved at skrabe med en celleskraber og plade dem i en 6-brønds dyrkningsplade.
- Screen de forskellige kloner for PSA sekretion, som beskrevet i trin 1. Cryo-bevare klon med den hemmelige højeste PSAion og bruge det til fremtidige mus eksperimenter.
4. Implantation af Tumor
BEMÆRK: Hver mus implanteret med 1 x 10 5 MB49-PSA-celler i 50 pi DMEM tomme medier i blæren. På grund af det døde rum i kateteret, altid forberede ekstra volumen (mindst 100 pi ekstra per mus). En alternativ fremgangsmåde ville være at anvende en luft fyldt injektionssprøjte, som beskrevet af Kasman et al. 5 snarere end en fyldt sprøjte.
- Celler.
- En dag før implantation, når cellerne er omtrent 80% sammenflydende, passage de MB49-PSA tumorceller i komplet DMEM-medium (suppleret med 10% FBS, 2 mmol / l L-glutamin, 0,05 mg / ml penicillin-streptomycin og 200 ug / ml hygromycin B) ved 37 ° C og 5% CO2 ved et split ratio på 1: 2.
- På dagen for proceduren, høste cellerne ved skrabning dem forsigtigt med en steril celleskraber. Bland lige volumener af cellesuspension ogen 0,4% trypan blå opløsning. Tæl de levende celler ved hjælp af et hæmocytometer. Må ikke implanteres, hvis mere end 20% af cellerne er døde.
- Beregne mængden af levende celler kræves (2 x 10 6 celler / ml) og overføre dem til et 15 ml centrifugerør. Centrifuger ved 250 xg i 5 min ved 4 ° C og supernatanten. Re-suspendere cellepelleten i DMEM blank medier. Gentag vask tre gange for at fjerne alle spor af FBS før implantation.
- Hold cellesuspensionen på is indtil musene er klar til implantation.
- Tillad 4- til 6 uger gamle C57BL / 6J-mus for at akklimatisere sig i en uge før proceduren. Alt animalsk arbejde skal udføres i et biologisk sikkerhedsskab at opretholde sterile betingelser.
- Afvej hver mus og injicere anæstesi (75 mg / kg ketamin og 1 mg / kg medetomidin) intraperitonealt ved 0,1 ml pr 10 g legemsvægt. Kropsvægt skal være mellem 17 og 22 g. Bekræft bedøvelse ved at observere nogen RespoNSE efter en tå knivspids.
- Til identifikation, markerer øret ved hjælp af en øre punch.
- Injicer Hartmanns opløsning eller sammensatte natriumlactat intraperitonealt 0.1 ml pr 10 g kropsvægt hver 1 - 2 ud h for hydrering.
- Påfør steril ophthalmisk salve til begge øjne under anvendelse af en steril bomuld pære, eftersom den blinkende refleks er tabt under anæstesi og øjnene tørre ud. Genanvende når det er nødvendigt.
- Lå musene i rygleje på papirservietter oven på en varmepude (aktiveres ved kontakt med luft) for at opretholde legemstemperatur og tape bagbenene ned.
- Med en finger, tryk forsigtigt til den nedre abdominale område og indsamle urin fra blæren i et 1,5-ml mikrocentrifugerør. Denne prøve tjener som den basale værdi af urin PSA.
- Trække steril poly-L-lysin (PLL) i en 1 ml sprøjte og vedlægge en 24-gauge IV-kateter, med nålen stiletten fjernet. Påfør smøremiddel til spidsen af kateteret og insERT gennem urinrøret kateteret i blæren med pincet til at lede kateterisation. Stop når der mærkes modstand. BEMÆRK: Forskere bør drøfte med deres veterinære personale om behovet for anvendelse af en smørende gel med bedøvelsesmiddel for intravesikale instillationer og brug af post-procedure analgetika.
- Indgyde 50 pi PLL langsomt, med en hastighed på 10 pi hver 20 s, for at undgå vesico-ureteral reflux 18. Efterlad i blæren kateteret i 20 minutter med en prop for at forhindre udstrømning.
- Efter 20 min fjernes katetret og forlade blære noget indhold ved forsigtigt at trykke på den nedre del af bughulen. Brug af en tom 1 ml sprøjte, skylle resterende indhold ud af kateteret.
- Bland MB49-PSA celler grundigt ved pipettering og trække dem ind i en 1 ml sprøjte. Fastgør kateteret og smøres. Instill 50 pi 1 x 10 5 celler ved en langsom hastighed på 10 pi hver 20 s. Sæt proppen påkateteret. Giv kontrolmus 50 pi saltvand.
- Efter 1 time fjernes katetrene og forlade blære noget indhold. Fjern tapen på bagbenene og placer mus på deres ventrale sider. Genoplive mus ved subkutan injektion af tilbageførsel lægemiddel (1 mg / kg atipamezol) ved 0,1 ml pr 10 g legemsvægt.
- Overvåg musene indtil der observeres motilitet. Retur musene til deres bure.
- Ved afslutningen af en tumor påvisning protokol (afsnit 5, 7 eller 8), aflive musene ved hjælp af CO 2. Post-mortem tumor afsløring er beskrevet i afsnit 6.
5. Overvågning Tumor Vækst med ELISA
BEMÆRK: Tumor tilstedeværelse og vækst overvåges i mus ved at måle PSA sekretion i urinen. Forskere bør rådføre sig med deres veterinære personale om overvågning dyrs sundhed og velvære post-tumor implantation og humane endepunkter.
- Der er to metoder til at indsamle urin fra mus.
- Indsamle urin natten over ved at placere en enkelt mus i et individ metabolisk bur udformet til at adskille urin fra fækalt materiale. Hvis opsætningen ikke har køle-, tilføje en proteasehæmmer (100 pi) i urinen opsamlingsrøret for at forhindre nedbrydning af PSA natten over. Imidlertid er antallet af tilgængelige metaboliske bure begrænser anvendeligheden af denne fremgangsmåde til urinopsamling.
- Hvor det er logistisk umuligt at anvende metaboliske bure (såsom i ABSL2 værelser), indsamle spot urin ved hjælp af en finger at udøve et let tryk på den nedre del af bughulen, mens musene bedøves som beskrevet i trin 4.2.1. Dette sker normalt, før behandlingen indpodet. Fra vores erfaring, kan mindst 150 uL af urin blive samlet 1 timer efter anæstesi.
- Umiddelbart placere de indsamlede urin på is. Hæmaturi kan være synlige fra den anden uge efter tumorimplantation. Meget hæmolyserede prøver kan påvirke ELISA-analyse. Derfor urinskal placeres på is og behandles hurtigt efter indsamlingen.
- Centrifuger urin rør ved 6700 xg i 5 min ved 4 ° C til fjernelse af celler eller debris.
- At normalisere forskellen i urinproduktion mellem musene, aliquot urinen i nye rør og opbevares ved -30 ° C indtil der udfører analyserne for PSA anvendelse af et ELISA-kit 7 og kreatinin under anvendelse af et assaykit 7. Selvom mus ikke producerer PSA, der er lave niveauer af ikke-specifik binding påvises under anvendelse af ELISA. For prøver, der skal betragtes som positiv, skal tærsklen fastsættes på værdier større end i normale mus + 3 standardafvigelser (SD) 15.
6. Afsløring Tumor Tilstedeværelse med Real-time PCR
- Ved afslutning, dissekere bughulen af musen, og find blæren. Forbrugsafgifter blæren og læg det i en kryohætteglas. Frys straks i flydende nitrogen.
- Ekstrahere RNA ved at homogenisere væv i en RNA Udvindinghandling reagens.
- Udfør revers transkription og real-time PCR-analyse for PSA, som beskrevet ovenfor i afsnit 2.
7. Overvågning Tumor Vækst med Fluorescence Imaging
- Label 1 x 10 7 MB49-PSA celler med en nær-infrarødt fluorescerende farvestof 19.
- Re-plade og høste de mærkede celler på dag 4, 7, 11, 14, 18, og 21 at kontrollere, om celler bevarer levedygtighed og fluorescens ved flowcytometri 20.
- Implantere de mærkede MB49-PSA celler i mus blærer, som beskrevet ovenfor i afsnit 4.
- Overvåg tumorvækst ved anvendelse af et fluorescens imaging system hver to dage.
- På dagen for billeddannelse, vejes og bedøver musene under anvendelse af en blanding af bedøvelsesmidler ketamin og medetomidin (75 mg / kg og 1 mg / kg), injiceret intraperitonealt ved 0,1 ml pr 10 g legemsvægt.
- Barbere maveregionen ved at udsætte huden.
- Placer mus i afbildningskammeret og erhvervebilleder af blærer ved hjælp af softwaren, der følger med billeddannende system.
- Genoplive mus ved subkutan injektion af en vending lægemiddel (1 mg / kg atipamezol) ved 0,1 ml pr 10 g legemsvægt.
8. Overvågning Tumor Vækst med højfrekvent ultralyd Imaging
- Implant tumorer i mus, som beskrevet ovenfor i afsnit 4.
- Hver anden dag, overvåge tumorvækst ved hjælp af ultralyd-billeddannelse.
- På dagen for billeddannelse, vejes og bedøver musene under anvendelse af en blanding af bedøvelsesmidler ketamin og medetomidin (75 mg / kg og 1 mg / kg), injiceret intraperitonealt ved 0,1 ml pr 10 g legemsvægt.
- Barbere maveregionen ved at udsætte huden.
- Indgyde 100 pi sterilt 0,9% saltvand ind i blæren ved anvendelse af en 24-gauge IV-kateter. Den saltvand vil udspile blæren og forbedre synligheden under ultralydsscanning.
- Placer musen på ultralyd platformen og anvende ledende gel til Lower maven.
- Sænk håndholdte probe til huden og erhverve B-mode billeder af blæren på den billeddannende platformen 21.
- Genoplive musene ved subkutan intravenøse vending lægemiddel (1 mg / kg atipamezol) ved 0,1 ml pr 10 g legemsvægt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PSA-sekretion fra MB49-celler viste sig at variere med vækstmediet. MB49-PSA dyrkes i DMEM-medium, fordi dette resulterer i øget PSA sekretion (figur 1A). For at bestemme følsomheden af PSA ELISA og real-time PCR, blev forskellige antal MB49-PSA-secernerende celler blandet med MB49 parentale celler. PSA ELISA registrerer et minimum på 1 x 10 5 PSA-secernerende celler / 1 x 10 6 celler (figur 1b), mens realtids-PCR analyse viser 100 PSA-secernerende celler / 1 x 10 6 celler (figur 1C). Således realtids-PCR er mere følsom end ELISA, men det kan kun udføres på hele blæren. Dette begrænser dens anvendelighed til slutpunkt analyse. PLL Fremgangsmåde ifølge tumorimplantation resulterer i multiple tumorer (Figur 2A) udvikler sig i blæren. Begge overnight opsamling af urin under anvendelse af metaboliske bure (figur 2B (figur 2B, nedre panel) anvendes til at måle PSA ved ELISA. For alle dyreforsøg, er musevægt noteret som et mål for sundhed (figur 2C, øvre panel), og urin PSA overvåges ugentligt (figur 2C, nedre panel) som et mål for tumorvækst. Der er generelt en god korrelation mellem muse vægt og tumorstørrelse som målt ved PSA. Mus med store tumorer begynder at tabe (figur 2C, mus 3 og 5). Nogle mus observeret i figur 2C, kan have en stor tumor, men stadig vise en normal kropsvægt. Således kropsvægt alene er ikke en tilstrækkelig grad af tumorvækst. PSA er et godt surrogatmarkør af tumorvækst (figur 3A-D). Mus blev aflivet omkring 3 - 5 dage efter urinanalyse for PSA på dag 14. Billederne af blæren tværsnit viser tumorstørrelse og den tilsvarende dag 14 PSA / kreatinin x 10 6 reading. Variationen i tumorstørrelse er relateret til behandlingen modtog musene. Figur 3, paneler AD repræsenterer mus fra 3 forskellige behandlingsarme. En alternativ strategi til PSA modifikation af celler er mærkning af celler med et farvestof. Denne strategi eliminerer behovet for celletransformation og udvælgelse. Mærkning af MB49-PSA-celler med et fluorescerende farvestof er let at udføre (figur 4A), og in vitro overvågning viste lovende med hensyn til overlevelse af signalet, trods cellereplikation (figur 4B og C). Men in vivo-billeddannelse lykkedes ikke, fordi muse foder også havde naturlig rød fluorescens (figur 4D), hvilket resulterede i ikke-specifik fluorescens i maveregionen. En sammenligning blev udført mellem ultralydsscanning, PSA urin sekretion, og PSA endepunkt analyse. Ultralydsbilleddannelse af blæren (figur 5A-H) var god til identifikationstore tumorer, men det var ikke så vellykket med små tumorer.
Figur 1. PSA Sekretion fra MB49-PSA Cells og Bestemmelse af Limits påvisning ved ELISA og Real-time PCR-analyse. (A) 1 x 10 6 MB49-PSA-celler blev dyrket i forskellige vækstmedier, og PSA sekretion i supernatanten blev detekteret 2 dage senere ved ELISA. Vækstmediet var: RPMI med FBS- (RPMI), RPMI med Premium FBS (RPMI (P)), RPMI med en alternativ FBS (RPMI (H)), og DMEM med FBS (DMEM). MB49-PSA celler dyrket i DMEM medier havde højere PSA sekretion. (B) MB49-PSA-celler (10 6 celler til 1 celle) blev blandet med parentale MB49 celler (1 celle til 10 6 celler) og udpladet i 24 timer. PSA ELISA blev udført på supernatanten, og RNA blev ekstraheret fra cellerne. Mindst 1 x 10 5 6 celler kunne detekteres ved ELISA. (C) 100 PSA-secernerende celler / 1 x 10 6 celler kunne påvises ved real-time PCR-analyse. Y-aksen værdier repræsenterer middelværdien RQ (relativ kvantificering) ± standardafvigelse. RK-værdier er relative fold ændringer, opnået ved at normalisere C T værdier af PSA til beta actin gen og sammenlignet med en kontrolgruppe blære, der er fastsat til 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Blære tumorvækst og Detection. (A) Histologisk undersøgelse af en blære 13 dage efter tumorimplantation. Den paraffinindlejret blære blev sektioneret og farvet med hematoxylin (mørkeblå), som stains kernerne, og eosin (lyserød), som farver de resterende cellulære komponenter. PSA / kreatinin x 10 6 værdi for denne blære på dag 5 og 13 er vist som 7/2688. Forstørrelsen er på 44.8X. Skalaen søjle repræsenterer 1 mm. (B) Urin blev opsamlet ved enten at placere mus i metaboliske bure natten over og overføre urinen fra opsamlingsrøret i 2 ml rør (øvre panel) eller ved på stedet urinopsamling fra bedøvede mus (nederste panel) i 1,5 ml rør , som derefter blev overført til 0,6 ml rør. (C) Efter tumorimplantation blev musene vægt overvåget to gange om ugen (øvre panel). Urinary PSA blev målt til at overvåge tumorimplantation og vækst hos mus (nederste panel). Y-aksen PSA / krea repræsenterer urin PSA normaliseret til creatinin x 10 6. Mus blev afsluttet en gang var der et tab på mere end 20% af kropsvægt. Bemærk: PSA genekspression påvistes i blæren af muse 2 på dag 40, når det var termi dineret, selv om den havde lav urin PSA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. PSA og blære tumorvækst. (AD) Histologiske snit af mus blærer høstet på dag 19 (A og B), 17 dage (C) og dag 13 (D) efter tumorimplantation. Dagen 4 og dag 13 eller dag 14 urin PSA / creatinin x 10 6 værdier for hver blære vises i højre side af hvert billede i dag formatet 4 / dag 13 eller 14. Den urin PSA / kreatinin stiger med tumorstørrelse . Musene i billeder AD fik forskellige behandlinger tegner sig for de tumor størrelse forskelle. Forstørrelsen er på 41.4X. Skalaen søjle repræsenterer 1 mm."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55078/55078fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Profil af MB49-PSA celler mærket med et fluorescerende farvestof. (A) farvede celler blev analyseret ved flowcytometri før udpladning. Mærkede celler blev høstet hver par dage til at analysere intensiteten af det fluorescerende farvestof. (B) Procent af mærkede MB49-PSA celler i P2 port fra (A) på bestemte dage post mærkning. (C) Intensitet af det fluorescerende farvestof målt ved gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af signalet. (D) Billeder af mus 10 dage efter implantation med mærkede MB49-PSA-celler under anvendelse af en in vivo imaging system viste ikke-specifik fluorescens i maveregionen.Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. ultralydsbilleder af murine Blærer. Mus blærer (A) før tumorimplantation og (B) 8 dage efter tumorimplantation. (C) til (H) er ultralydsbilleder af mus blærer to uger efter implantation. PSA / crea: urin PSA normaliseret til creatinin (10 6). PSA-genet: genekspression af PSA i blærerne (log RQ) er vist for hver blære. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Urinary PSA | fluorescens Imaging | Ultralyd Imaging | |
| Trin (tid, der kræves) | Bedøver mus. Indsamle 110 pi urin. (~ 1 time) Udfør PSA ELISA (total inkubationstid: 2 t 30 min) Creatinin-assay (inkubationstid: 5 min) | Bedøver mus. Shave pels på maveregionen. Udføre billeddannelse. | Bedøver mus. Shave pels på maveregionen. Selvkaterisation og indgyde 100 pi saltvand ind i blæren. Påfør ledende gel til at sænke maven og opnå ultralydsbilleder. |
| specialudstyr | ELISA-pladelæser (ved en bølgelængde på 450 nm og 510 nm) | Imaging System | Ultralyd Imaging System |
| Modifikation af tumorceller | required (udtrykkende PSA) | Påkrævet (fluorescens) | Ikke påkrævet |
| Fordele | Pålidelig | Enkel og hurtig | Kan afsløre store tumorer |
| Begrænsninger | Kan ikke få nok urin En negativ værdi betyder ikke fravær af tumor (PSA genekspression analyse øger følsomheden, men er begrænset til ende-point analyse) | Omhyggelig udvælgelse af fluorescens farvestof er nødvendig for at forhindre høj baggrund. | Kan ikke registrere små tumorer. En mus ad gangen. |
Tabel 1. Sammenligning af metoder til overvågning tumorvækst i Mouse Blærer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trin i protokollen er 1) med held opretholde tumorigeniciteten af cellelinien; 2) at sikre målelig PSA sekretion før tumorcelleimplantation i mus; 3) generering af et enkelt-cellesuspension til implantation for at reducere variationen i tumorstørrelse; og 4) bibringe celler ved en langsom hastighed for at forhindre vesico-ureteral reflux, hvilket resulterer i tumorcelleimplantation i nyren.
Efter forlænget passage in vitro, kan MB49 / MB49-PSA celler mister deres tumorigenicitet, som vist ved deres manglende evne til at producere tumorer hos mus. Dette kunne være et forstyrrende element, hvorvidt eller ej mus helbredt efter terapi. I fravær af tumorer, er det ikke muligt at differentiere mus helbredt ved terapi fra mus helbredt spontant på grund af immunogene tumorer eller fra mus uden tumorer overhovedet fordi cellelinjen er i stand til at danne tumorer. En måde at imødegå dette er at genskabe passage cellerne i mus ved at producere sub-kutant tumorer. Hvis dette re-passage udføres for ofte er alt for aggressive tumorer genereret. En fin balance er nødvendig for at afgøre, når cellerne har brug for at re-passage. Almindeligvis før en større række forsøg, er cellelinien genoplivet og derefter implanteret i mus subkutant at bekræfte deres evne til at danne tumorer. Tumorerne overvåges i flere uger for at sikre, at der ikke er spontane helbredelser. Men hvis der observeres spontane helbredelser, bør udføres så protokollen i trin 3. Tilsvarende bør evne MB49-PSA celler til at producere PSA altid bekræftes før cellerne anvendes til tumorimplantation.
Urinary PSA kan anvendes til at overvåge udviklingen af blæretumorer etableret under anvendelse MB49-PSA-celler. Men en negativ eller "normal" urin PSA værdi ikke nødvendigvis, et fravær af tumorceller, men kun, at mindre end 1 x 10 5 celler er til stede. Som urin PSA bestemmes omkring dag 4til dag 7, mus, der synes at have nogen tumor, baseret på værdien af normale mus + 3 SD, kan fjernes fra eksperimentet. Nogle af disse mus kan udvikle en tumor på et senere tidspunkt. Fjernelse mus uden tumorer sikrer, at tumorer er meget ens i størrelse, før de påbegynder nogen behandling. Dette reducerer variation som følge af tumorstørrelse som reaktion på terapi. En væsentlig årsag til tumorstørrelse variation er sammenklumpning af celler før implantation, så bør der gøres en indsats for at re-suspendere celler før implantation.
Men når der anvendes et lille antal mus, kan det være nødvendigt at holde alle mus i undersøgelsen, selvom tumorerne ikke kan måles ved dag 4 - 7. Ved at overvåge PSA på dag 11, kan det stadig være muligt at kategorisere disse mus som havende haft små tumorer, og endepunkt analyse kan udføres med hensyn til den oprindelige tumorstørrelse (baseret på tilstedeværelsen af målelige urin PSA på dag 4 - 7 versus dag 11). Fordelen ved at være i stand til at kvantificere tumorermed forskellige PSA værdier er, at alle mus kan indgå i undersøgelsen, og kan bestemmes reaktionen på behandling, baseret på deres PSA / kreatinin i forhold til den oprindelige tumorstørrelse. Et andet problem er vesico-ureter reflux. Dette kan resultere i tumorudvikling i nyrerne. Reduktion af volumen, der skal indpodet fra 100 pi til 50 pi og udføre instillation reducerer langsomt sandsynligheden for at dette sker.
Et problem i forbindelse med urin-assays er den reducerede urinopsamling observeret som ortotopisk tumorer vokser i blæren. Mens urin kan let opsamles fra mus i de første få uger efter implantation, med tiden, volumenet af urin opsamlet måske ikke tilstrækkelig til PSA og kreatinin målinger. Den mindste mængde af urin brug for, er 110 uL, men mere er bedre. Således kan PSA aflæsninger ikke tilgængelige for alle mus på senere tidspunkter. Også lyse af røde blodlegemer i urinen giver falskhøje måling på PSA ELISA. En ikke-urin-baseret assay kunne overvinde dette problem. Men desværre fluorescensafbildning er enkel at anvende, fandt vi, at muse foder havde rød fluorescens samt. Dette gav en høj baggrund, som blæren ikke kunne let ses. Det er muligt, at bruge et grønt fluorescerende farvestof eller protein kan løse dette problem, som beskrevet af Sweeney et al. 10 For både fluorescens og ultralyd, skal barberes på den ventrale overflade mus.
Ultralydsbilleder synes at være så god som PSA genekspression i lokalisering tumorer. ulempen ved ultralydsbilleddannelse er imidlertid, at blæren skal være udspilet under billedbehandling at få god tumor visualisering. Mens billederne er klare, når blæren tumoren er stor, er det svært at skelne små tumorer i mus fra fravær af tumorer. Det er blevet rapporteret, at ultralyd kan detektere tumorer omkring 1,5 mm i diameter 22, men på dag 4efter implantering tumorer er meget mindre end dette. Således kan denne metode ikke være godt til påvisning af tumorer på dag 4. Tabel 1 sammenligner de 3 forskellige tumor overvågningssystemer; PSA ELISA er den enkleste at anvende og kræver ikke små-dyr billedsystemer, som måske ikke er tilgængelige på alle animalske faciliteter.
I betragtning af den større følsomhed af real-time PCR-analyse af PSA-genekspression, kan det anvendes i stedet for immunhistokemi at bekræfte, om mus blev helbredt, når eksperimentet blev afsluttet. Med immunhistokemi, en tumor på 0,2 - 0,3 mm kan påvises ved dag 4 efter implantation 15. Dette er imidlertid et slutpunkt analysemetode, der ikke kan anvendes til at overvåge tumorimplantation. I denne undersøgelse blev MRI ikke evalueret, men det er blevet rapporteret at være i stand til at identificere tilstedeværelsen af tumorer ved dag 10 efter implantation 8. Ved at modificere cellerne til at udtrykke grønt fluorescerende protein (GFP), det ier muligt at bekræfte tumorimplantation på dag 7. En blanding af tidlig urin PSA at detektere tumorimplantation og real-time PCR-analyse ved afslutning giver bekræftelse af tumorimplantation og terapeutisk effektivitet mellem forskellige behandlingsgrupper.
En ulempe ved vores protokol er hovedsagelig, at ELISA-assayet ikke kan bekræfte tilstedeværelsen af tumorer, når antallet af tilstedeværende celler er mindre end 10 5 celler. behøver således mere følsomme analyser, der skal udvikles, samt hurtigere analyser for at reducere den nødvendige tid til PSA detektion. ELISA tager flere timer at udføre. En hurtig fremgangsmåde, såsom creatinin assay, der er baseret på den Jaffe metode 23 og tager omkring 5 min at udføre ville i høj grad forenkle overvågning af tumorvækst. Til dette formål blev et enzym-baseret metode til at påvise PSA aktivitet evalueret, men det var ikke en succes. Brugen af kolloidt guld og nanopartikler baseret analysesystemer kan reducere den tid det tager at udføre analysen ennd øge følsomheden 24. I denne forbindelse har elektrode baserede sensorer og elektrokemiske baserede sensorer med nanopartikler blevet udviklet til at analysere menneskets PSA 25-27, og hvis omkostningerne er rimelig kan gælde for den dyremodel. Assaysystemet kunne også forbedres ved at anvende et andet protein sekretion, såsom GFP eller luciferase, hvor assayet udføres under optimale betingelser in vitro i stedet afhængig af in vivo-billeddannelse, som er afhængig af iltningen af vævet.
Mens kemisk carcinogenese i mus frembringer tumorer med lighed med humane cancere i form af mutationer 28, de tager længere tid at fremstille og er ikke så sammenlignelige i størrelse mellem dyr, der kræver større antal mus, som forøger omkostningerne ved eksperimentering. Når målrettede midler genkender humane proteiner er der skal evalueres, menneskelige xenografter implanteret subkutant i nøgen eller Svær kombineret immundefekt(SCID) mus er den eneste mulighed. Selv om disse modeller giver proof of concept af antistof anerkendelse, manglen på et intakt immunsystem hindrer vurdering af immun aktivering. Den nylige udvikling af et humaniseret musemodel for blærekræft anvendes humane xenotransplantater 29, giver nogle immune indsigt, men som celler implanteres subkutant det faktisk ikke rekapitulere den humane sygdom miljø. Det er teknisk vanskeligt at fremstille ortotopisk tumorer i immun mangelfuld mus. Således syngen ortotopisk model trods sine begrænsninger er stadig en god model til vurdering og udvikling af behandling for blærekræft, da det giver den korrekte væv placering muliggør kontrolleret eksponering terapi modellering den kliniske situation og evne til at evaluere virkningen af værtens immunceller under cancerterapi. Alt dette kombineret med hurtig tumorudvikling hos mus og evnen til at overvåge tumor vækst resulterer i en omkostningseffektiv model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4 - 6 wk old | |
| Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack - HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24 G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye - VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
- Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
- Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181 (2013).
- Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
- Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684 (2011).
- Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
- Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
- Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3 (2016).
- Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
- Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
- Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
- Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
- Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
- Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
- Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
- Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172 (2012).
- Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075 (2007).
- Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
- Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718 (2015).
- Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
- Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
- Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
- Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
- Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
- Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
- Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
- Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).
