Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

מודל גידול Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן סרטן מערכת איתור

Published: January 12, 2017 doi: 10.3791/55078
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, National University Health System, 2Department of Urology, National University Hospital

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הדור של גידולים בשלפוחית ​​השתן בעכברים orthotopic אצל נקבות עכברים C57BL / 6J ועל ניטור של הגידול.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את הדור של גידולים בשלפוחית ​​השתן אצל נקבות עכברים C57BL / 6J באמצעות שורת תאים סרטניים בשלפוחית ​​השתן בעכברים MB49, אשר שונתה כדי להפריש אנטיגן ספציפי לערמונית האדם (PSA), ואת ההליך לאישור של ההשתלה הגידול. בקיצור, עכברים מורדמים באמצעות תרופות להזרקה והם עשויים להניח במצב הגבה. שתן מתפנה מן השלפוחית ​​50 μL של פולי- L- ליזין (PLL) הוא החדיר לאט בקצב של 10 μL / 20 שניות באמצעות קטטר 24 G IV. הוא עזב בשלפוחית ​​במשך 20 דקות על ידי וסותם את הקטטר. צנתר מוסר PLL הוא שפונה על ידי לחץ עדין על שלפוחית ​​השתן. זה ואחריו החדרה של הקו הסלולרי בעכברים שלפוחית השתן סרטן (1 x 10 5 תאים / 50 μL) בשיעור של 10 μL / 20 שניות. קטטר פקוק למנוע פינוי מוקדם. לאחר h 1, העכברים הם החיו עם תרופת היפוך, ואת שלפוחית ​​השתן שהתפנה. שיעור ההחדרה האיטי חשוב,כפי שהיא מקטינה ריפלוקס vesico-השופכן, אשר יכול לגרום לגידולים להתרחש בדרכי השתן העליונות בכליות. שורת התא צריך להיות גם מחדש תלוי להפחית clumping של תאים, כמו זה יכול להוביל בגדלי גידול אחידים לאחר השתלה.

טכניקה זו גורמת גידולים עם יעילות גבוהה. צמיחת גידול מנוטרת על ידי הפרשת PSA שתן. ניטור סמן PSA הוא יותר אמין יותר מאשר אולטרסאונד או דימות פלואורסצנטי לאיתור נוכחות של גידולים בשלפוחית. גידולים בעכברים בדרך כלל להגיע לגודל מקסימאלי משפיע לרעה בריאות בכ 3 - 4 שבועות אם אינו מטופל. באמצעות מעקב אחר צמיחת הגידול, אפשר להבחין עכברים נרפאו מאלו שלא הושתלו בהצלחה עם גידולים. עם ניתוח נקודת סיום רק, זה האחרון עשוי להניח בטעות נרפא על ידי טיפול.

Introduction

המטרה של שיטה זו היא ליצור גידולים בשלפוחית ​​שתן orthotopic murine וכן לפקח על הגידולים המושתלים באופן מדויק ככל האפשר, כך שהעכברים ללא השתלת גידול לא מיוחסים נרפאו ב ניתוח נקודת סיום. בסך הכל, השיטה לראות תפחית את צורך כמויות גדולות של עכברים לניתוח הניסיון ולהבטיח דיוק רב יותר בקביעת תוצאות טיפוליות.

פיתוח מודל orthotopic לסרטן חשוב, כמו תאים סרטניים להשתיל מתחת לעור לא לשחזר את הסביבה של מחלה קלינית או לאפשר פיתוח של אסטרטגיות טיפוליות. הארכיטקטורה של שלפוחית ​​השתן מאפשרת ההחדרה של טיפולים בסרטן שלפוחית ​​השתן ישירות לתוך שלפוחית ​​השתן עם תופעות מערכתיות מינימאליות. לכן, במודלים של בעלי חיים כי לשחזר בסביבה זו, כגון מודל orthotopic, שחשובים להעריך טיפולים חדשים. מסקנות מכל ניסוי הגדרה הם dependent על מגבלות המודל.

טכניקות פותחו מספר לייצור גידולים בשלפוחית ​​השתן orthotopic בעכברים. אלה מסתמכים על הפגיעה בשכבת glycosaminoglycan של שלפוחית ​​השתן, מה שמאפשר לתאים נגועים להיות מושתלים. הטכניקות בשימוש כוללות electrocautery, שתוצאתה נקודה אחת של נזק לדופן השלפוחית, מה שמוביל להתפתחות גידולים באתר אחד בשלפוחית 1,2. עם זאת, שיעור ההצלחה של השתלת גידול באמצעות electrocautery הוא מפעיל תלוי הנע בין 10 - 90%, והיא כוללת את הסכנה כי לדופן השלפוחית ​​יהיה נקב, שמובילה גידולים המתפתחים חלל הצפק. כווייה כימית מתבצעת באמצעות כסף חנק, אשר פוגע בקיר השלפוחית 3. באופן דומה, חומצה נעשה שימוש כדי לפגוע בקיר השלפוחית 4. טריפסין גם נעשה שימוש כדי לפגוע השלפוחית כמו גם 5. שיטות אלה עלולות לגרום להתפתחות של יותר מ גידול אחד בשלפוחית.יתר על כן, קיימת סכנה של נזק חמור השלפוחית ​​אם הכימיקלים נשארים במגע עם דופן השלפוחית ​​במשך זמן רב מדי. השיטה שפותחה על ידי Ninalga et al. משתמש פולי- L- ליזין בעלי המטען החשמלי החיובי (PLL) 6 מולקולות כדי לצפות את קיר שלפוחית השתן; זה מאפשר לתאי הגידול טעונים שלילית להיצמד שכבת glycosaminoglycan של שלפוחית ​​השתן. שיטה זו בדרך כלל תוצאות יותר גידול אחד לפתח בשלפוחית, אך השתלת גידול היא 80 - 100% 4,7. מבחינה טכנית, זה גם ההליך הקל ביותר לבצע. כדי להבטיח כי הגידולים המתפתחים הם די אפילו בגודל, חשוב כי התאים הסרטניים אינם מקובצי גושים גדולים לפני ההשתלה.

על מנת להעריך יעילות טיפולית, עדיף לבצע מחקר זה על עכברים עם גידולים בגודל דומים למדי. לפיכך, מערכת זיהוי טובה שיכול לכמת גודל גידול קצר לאחר ההשתלה היא חשובה. יש מספר אסטרטגיות דבורהn המשמש להערכת גידולים. אלה כוללים הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) 8-10, קרינת 11, פליטת אור 12,13, אולטרסאונד 14, ו assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) 15,16. בעוד MRI ואולטרסאונד אינו דורשים שינויים של התאים הסרטניים, יש צורך סוכני ציוד והניגודיות רגישים עבור MRI. Fluorescence-, luminescence-, המבחנים המבוססים ELISA דורשים שינוי של התאים הסרטניים לבטא חלבוני סמן שיכול להיות מזוהה על ידי שיטות אלה. לקבלת הארה, מצע נדרש לצורך זיהוי של פעילות בלוציפראז; ובכך, יש שלב מוסף התייקרות. שניהם הארת הקרינה דורשות ציוד מיוחד. כדי לייצר קרינה, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) cyclization, אשר מזורז על ידי חמצן מולקולרי, נדרש. לפיכך, ביטוי של GFP עשוי להיות משתנה בתוך מסת גידול תלוי גישת החמצן, מה שהופך את סמן למדי אמין 15,16 כסמן פונדקאי הוא אסטרטגיה אחרת. סמנים אלה גם לספק אמצעים חלופיים המאשר נוכחות גידול על סיום הניסוי, מה שהופך אותם כחלופה אימונוהיסטוכימיה. מחקר זה מדווח על שיטת PLL של השתלת גידול orthotopic ומציג השוואה של מערכות גילוי גידול, כלומר ELISA, קרינה, והדמית אולטרסאונד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל עבודה החיה דבק ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) הנחיות לגבי שימוש בבעלי חיים וטיפול (מספר פרוטוקול 084/12) באוניברסיטה הלאומית של סינגפור.

1. גידול תאי MB49-PSA במבחנת מדידת הפרשת PSA

  1. לשמור murine תאי סרטן שלפוחית השתן MB49-PSA 15 בינוני הנשר שונה של שלמה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עוברי בסרום שור (FBS), 2 mmol / L L- גלוטמין, ו 0.05 מ"ג / מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הוספת 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin B כדי לשמור על לחץ מבחר תאים מפרישי PSA.
  2. כדי לקבוע הפרשת PSA, צלחת 1 x 10 6 תאים בצלחת תרבות 6 היטב דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO 2 למשך 48 שעות.
  3. יומיים לאחר מכן, לאסוף את supernatant לשקילת PSA.
    1. בעזרת פיפטה פסטר, להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 250 XG כדי להסיר תאים ופסולת צף. אם assay PSA מתבצעת ביום אחר, לאחסן את supernatant ב - 30 מעלות צלזיוס צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. אם לא, המשך לשלב הבא באופן מיידי.
    3. קבע את ריכוז PSA באמצעות ערכת ELISA PSA אדם נטול 7.
  4. ספירת התאים המצופים.
    1. בעזרת פיפטה פסטר, לשטוף את התאים בעדינות עם 1 מ"ל של DMEM. לשאוב להסיר לחלוטין את התקשורת.
    2. הוסף 1 מיליליטר של תקשורת הטריה לגרד בעדינות עם מגרד תא כדי לסלק את התאים מן הבאר.
    3. מעביר את התאים לצינור microcentrifuge מחדש להשעות אותם ביסודיות כדי להבטיח השעית תא בודד.
    4. מערבבים כמויות שוות של ההשעיה תא ופתרון כחול 0.4% trypan. ספירת תאים חיים (אשר אינם תופסים צבע) באמצעות hemocytometer.
  5. חשב את הביטוי PSA כמו ngשל PSA / מ"ל של התקשורת / 10 6 תאים. ביטוי PSA של תאי MB49-PSA להשתלה בעכברים הוא 80 - 120 ng / mL / 10 6 תאים.

2. קביעת הרגישות של מדידות PSA ידי ELISA ו- בזמן אמת ניתוח PCR

  1. פלייט תאי MB49-PSA ב מדיה מלאה DMEM בצלחת תרבות 6 היטב עם כמויות שונות של תאי הורית MB49 כך יש מקסימום של 1 x 10 6 תאים לכל טוב (כלומר, 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, או 10 6 תאים MB49-PSA הם מתורבתים עם 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, או 10 0 MB49 תאים, בהתאמה).
  2. יום אחד מאוחר יותר, לאסוף את supernatant למדידת PSA, כמתואר בשלב 1.3. קבע את ריכוז PSA באמצעות ערכת ELISA PSA אדם נטול 7.
  3. חלץ את RNA מן התאים.
    1. Lyseתאים ישירות את הצלחת על ידי הוספת 1 מ"ל של ריאגנט מיצוי RNA.
    2. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהעביר את lysate לתא צינור microcentrifuge. להוסיף 0.2 מ"ל של כלורופורם המערבולת דגימות במרץ למשך 15 שניות. דגירה אותם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. צנטריפוגה דגימות XG ב 12,000 במשך 15 דקות ב 4 °. להעביר בזהירות את השלב מהימי העליון (0.5 מיליליטר) לצינור טרי מבלי להפריע את שלבי ביניים.
    4. הוסף 0.5 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה דגימות XG ב 12,000 במשך 10 דקות ב 4 °. הסר את supernatant לחלוטין, מבלי להפריע את המשקע RNA בתחתית של התחתית.
    5. שטפו את הכדור פעם אחת עם 1 מ"ל של אתנול 75%. צנטריפוגה ב 7500 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר את כל אתנול ולאפשר גלולה לייבוש באוויר במשך 10 דקות.
    6. ממיסים את רנ"א 30 μL מים nuclease חינם. דגירה במשך 5 דקות ב 60 ° C כדי להגדיל את כל כךlubility.
    7. לכמת את הרנ"א על ​​ידי מדידת ספיגת באמצעות אולטרה סגול ספקטרוסקופיה (UV) ב 260 ננומטר (A260). כדי להעריך טוהר RNA, למדוד את הספיגה ב 280 ננומטר (A280) ולחשב את יחס A260 / A280 אשר צריך להיות מעל 1.6.
  4. Reverse-לתמלל cDNA מ 2 מיקרוגרם של רנ"א.
    1. מכינים את תערובת התגובה על הקרח ולהעבירו 0.2 צינורות מ"ל.
    2. צנטריפוגות בקצרה את הצינורות כדי לסובב את התוכן ואת לחסל בועות אוויר.
    3. טען את צינורות לתוך Cycler התרמית ולבצע שעתוק לאחור על התנאים הבאים: 60 דקות ב 37 ° C ואחריו 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. לאחר הריצה תושלם, לשמור על דגימות cDNA על 4 מעלות צלזיוס.
    4. אחסן את הדגימות ב - 30 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
  5. ביצוע ניתוח PCR בזמן אמת עבור PSA יקטין בטא cytoplasmic. תקטין Beta משמש לנרמל את הדגימות. בצע את assay על 100 ננוגרם של רנ"א-עבד הפוך בתוך PLA 96-היטבטה. Assay כל הדגימות בשלושה עותקים. בצע 40 מחזורים עם הפרמטרים הבאים: 2 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, 15 שניות ב 95 מעלות צלזיוס במשך denaturation, ו 1 דקות ב 60 מעלות צלזיוס. הגדר לגבול של זיהוי הנמוך ביותר ב סף מחזור (CT) של 35; וכך, כל המדגם עם ערך CT מעבר 35 נחשב לא ניתן לגילוי.

3. שמירה על tumorigenicity של הקו הסלולרי MB49-PSA

הערה: ממושכת צמיחה במבחנה מובילה לאובדן של tumorigenicity. כדי לשמור tumorigenicity, שורת תאי MB49-PSA היא passaged באמצעות העכבר לפחות אחת 2 שנים.

  1. תאים.
    1. קציר אקספוננציאלית גידול תאים על ידי גירוד אותם בעדינות עם מגרד תא סטרילי. מערבבים כמויות שוות של ההשעיה תא ופתרון כחול 0.4% trypan. ספירת תאים חיים באמצעות hemocytometer. אין להשתיל אם יותר מ -20% מכלל התאים מתים.
    2. לחשב את הסכום של תאים חיים נדרש (1 x 107 תאים / מ"ל) ולהעבירם צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. Re- להשעות את התא גלולה ב מדיה ריקה DMEM. חזור על לשטוף שלוש פעמים כדי להסיר את כל העקבות של FBS לפני ההשתלה.
    3. שמור על השעיית התא על קרח עד העכברים מוכנים להשתלה.
  2. שתל תאי הגידול תת עורית בעכברים בכנף הגבי.
    1. להרדים עכבר 4 עד 6 שבועות בן C57BL6 / J באמצעות תערובת של קטמין הרדמה medetomidine (75 מ"ג / ק"ג ו 1 מ"ג / ק"ג, בהתאמה), מוזרק intraperitoneally ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.
    2. לגלח את האגף הימני כדי לחשוף את העור.
    3. בעזרת זוג מלקחיים, להרים את העור להפרידו לשריר הבסיסי ולהזריק 0.1 מיליליטר של השעית התא (1 x 10 6 תאים) תת עורי עם מחט 24 G. תוך הסרת המחט, לצבוט את הזריקה במשך 5 עד 10 שניות, כך התאים הסרטניים לעשותלא לדלוף של הזריקה.
    4. להחיות את העכבר עם זריקה תת עורית של atipamezole (1 מ"ג / ק"ג) 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.
  3. צג צמיחת הגידול כל יומיים על ידי מדידת קוטר הגידול באמצעות מחוגה. היקף הגידול מחושב לפי הנוסחה = V (ab 2) / 2, כאשר "a" הוא הממד הארוך "ב" הוא רוחב בניצב, הן מ"מ.
  4. כאשר נפח הגידול הוא לפחות 50 מ"מ 3 (כ 7 ימים), להרדים את העכבר עם CO 2. ובלו מסת הגידול עם זוג מלקחיים ומספריים סטרילית בתנאי aseptic ומניח DMEM.
  5. בצלחת תרבות 6 היטב, לרכך את הגידול לחתיכות קטנות באמצעות אזמלים סטרילית. השתמש בוכנת מזרק 1 מיליליטר כמו "עלי" כדי disaggregate הגידול נוסף.
  6. הוסף 3 מ"ל של שלמה DMEM ולתחזק את התאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  7. ברגע שהתאים לדבוק platדואר (בין אחד ויומיים), להסיר את המדיה, פסולת, שאינם חסיד תאים על ידי aspirating בעדינות עם פיפטה פסטר סטרילית. שטפו פעמיים עם DMEM. תשמור על עצמך כדי לא להפריע את התאים.
  8. הוסף 1 מ"ל של DMEM ו לקצור את התאים על ידי גירוד אותם עם מגרד תא. כדי לבחור ולהרחיב מושבות אחת, לספור את התאים באמצעות hemocytometer צלחת 1 תא לכל היטב צלחת תרבות 96-היטב. התרבות תאים DMEM עם 200 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin B ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  9. שנה את התקשורת ואת אנטיביוטיקה כל 4 - 5 ימים. צג התאים עד שהם בסביבות 80-90% ומחוברות. Re-צלחת התאים על צלחת תרבות 24 גם על ידי pipetting כדי לסלק תאים מן הבאר.
  10. לאחר תאי צלחת התרבות 24 גם הוא ומחוברים, לסלק אותם על ידי גירוד עם מגרד תא צלחת אותם בצלחת תרבות 6 היטב.
  11. מסך השיבוטים השונים עבור הפרשת PSA, כמתואר בשלב 1. קריו לשמר את השיבוט עם סוד PSA הגבוה ביותריון ולהשתמש בו עבור ניסויי עכבר בעתיד.

4. השתלת הגידול

הערה: כל עכבר הוא מושתל עם 1 x 10 5 תאים MB49-PSA ב 50 μL של DMEM מדיה ריקה בשלפוחית. בשל השטח המת הקטטר, תמיד להכין נפח נוסף (לפחות 100 μL נוסף לכל עכבר). גישה חלופית תהיה להשתמש במזרק מלא באוויר כפי שתואר על ידי Kasman et al. 5 ולא מזרק מלא.

  1. תאים.
    1. יום אחד לפני ההשתלה, כאשר התאים הם כ 80% ומחוברות, מעבר תאים סרטניים MB49-PSA בתקשורת DMEM מלאה (בתוספת 10% FBS, 2 mmol / L L- גלוטמין, 0.05 מ"ג / מ"ל ​​פניצילין, סטרפטומיצין, ו -200 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin B) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ב ביחס פיצול של 1: 2.
    2. ביום של ההליך, לקצור את התאים על ידי גירוד אותם בעדינות עם מגרד תא סטרילי. מערבב כמויות שווות של השעית התאפתרון כחול 0.4% trypan. ספירת תאים חיים באמצעות hemocytometer. אין להשתיל אם יותר מ -20% מכלל התאים מתים.
    3. לחשב את הסכום של תאים חיים נדרש (2 x 10 6 תאים / מ"ל) ולהעבירם צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. Re- להשעות את התא גלולה ב מדיה ריקה DMEM. חזור על לשטוף שלוש פעמים כדי להסיר את כל העקבות של FBS לפני ההשתלה.
    4. שמור על השעיית התא על קרח עד העכברים מוכנים להשתלה.
  2. אפשר העכברים C57BL נקבה 4 עד 6 שבועות בן / 6J להתאקלם במשך שבוע אחד לפני ההליך. כל עבודת החיה חייבת להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגי כדי לשמור על תנאים סטריליים.
    1. לשקול כל עכבר ולהזריק הרדמה (75 מ"ג / ק"ג קטמין medetomidine 1 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף. Bodyweights צריך להיות בין 17 ו -22 גרם. אשר הרדמה על ידי התבוננות לא respoNSE לאחר קמצוץ הבוהן.
    2. לצורך זיהוי, סמן את האוזן באמצעות אגרוף באוזן.
    3. להזריק לקטט נתרן פתרון או תרכובת של הרטמן intraperitoneally ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף כל 1 - H 2 עבור הידרציה.
    4. החל משחת עיניים סטריליות לשתי העיניים באמצעות נורת גפן סטרילי, מאז רפלקס המצמוץ אבד בהרדמה והעיניים להתייבש. מרחו את הקרם בעת הצורך.
    5. הנח את העכברים במצב שכיבה על מגבות נייר על גבי חפיסת חום (מופעלת על ידי מגע עם אוויר) כדי לשמור על טמפרטורת גוף ואת קלטת הרגליים האחוריות למטה.
  3. עם אצבע, להפעיל לחץ עדין באזור הבטן התחתונה ולאסוף שתן משלפוחית ​​השתן לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. מדגם זה משמש כערך הבסיסי של PSA השתן.
  4. משיכה פולי- L- ליזין סטרילי (PLL) לתוך מזרק 1 מ"ל ולצרף קטטר IV 24-מד, עם stylet מחט הוסר. החל חומר סיכה על קצה הקטטר insERT קטטר דרך השופכה לשלפוחית ​​השתן באמצעות מלקחיים כדי להנחות את הצנתור. עצור כאשר ההתנגדות מורגשת. הערה: חוקרים צריכים לדון עם צוות הווטרינרים שלהם על הצורך בשימוש של ג'ל סיכה עם הרדמה עבור instillations שלפוחית ​​ושימוש משככי כאבים שלאחר ניתוח.
  5. להנחיל 50 μL של PLL לאט, בקצב של 10 μL כל 20 שניות, כדי למנוע ריפלוקס vesico-השופכן 18. השאר את הקטטר בשלפוחית ​​במשך 20 דקות עם פקק כדי למנוע זרימה החוצה.
  6. לאחר 20 דקות, להסיר את הקטטר ואת לפנות את השלפוחית ​​של כל התוכן על ידי לחיצה בעדינות על אזור הבטן התחתונה. באמצעות מזרק ריק 1 מ"ל, לשטוף כל תוכן הנותרים מתוך הקטטר.
  7. מערבבים תאים MB49-PSA ביסודיות על ידי pipetting למשוך אותם לתוך מזרק 1 מ"ל. צרף את הקטטר ולהחיל סיכה. להנחיל 50 μL של 1 x 10 5 תאים בקצב איטי של 10 μL כל 20 שניות. החלף את הפקק עלהקטטר. תן עכברים שליטים 50 μL של תמיסת מלח.
  8. לאחר h 1, להסיר את הצנתרים לפנות את השלפוחית ​​של כל תוכן. הסר את הסרט על הרגליים האחוריות ומניח עכברים על צדדי הגחון שלהם. להחיות את העכברים על ידי תת עורית הזרקת התרופה היפוך (1 מ"ג / ק"ג atipamezole) ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.
  9. צג העכברים עד תנועתיות הוא ציין. החזר את העכברים בכלובים שלהם.
  10. עם השלמת פרוטוקול זיהוי הגידול (סעיפים 5, 7, או 8), להרדים את העכברים באמצעות ה- CO 2. זיהוי פוסט מורטם גידול מתואר בסעיף 6.

צמיחת גידול ניטור 5. עם ELISA

הערה: גידול נוכחות וצמיחה מנוטרת בעכברים על ידי מדידת הפרשת PSA בשתן. חוקרים צריכים להתייעץ עם צוות הווטרינרים שלהם על ניטור בריאות בעלי חיים ורווחת השתלה שלאחר גידול ונקודות קצה אנושי.

  1. ישנן שתי שיטות לאיסוף שתן מעכברים.
    1. אסוף שתן במשך הלילה על ידי הצבת עכבר אחת בכלוב מטבולי הפרט שנועד להפריד שתן מחומר צואתי. אם ההגדרה אין קירור, להוסיף מעכב פרוטאז (100 μL) לתוך צינור איסוף שתן כדי למנוע של PSA השפלה לילה. עם זאת, מספר כלובי מטבוליים זמינים מגביל את השירות של שיטה זו של איסוף שתן.
    2. איפה זה מבחינה לוגיסטית אי אפשר להשתמש בכלובים מטבוליות (כגון בחדרי ABSL2), לאסוף שתן במקום באמצעות אצבע כדי להפעיל לחץ עדין על אזור הבטן התחתונה ואילו בעכברים מורדמים כמתואר בשלב 4.2.1. זה נעשה בדרך כלל לפני הטיפול הוא חדיר. מניסיוננו, לפחות 150 μL של שתן ניתן לאסוף 1 שעות לאחר הרדמה.
  2. מיד למקום בשתן שנאסף על הקרח. המטוריה תיתכן ראייה בין השבוע השני לאחר השתלת גידול. מאוד דגימות hemolyzed עשויות להשפיע ניתוח ELISA. לכן, שתןיש להציב על קרח לעבד במהירות לאחר איסוף.
  3. בצנטריפוגה צינורות השתן 6,700 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר תאים או פסולת.
  4. כדי לנרמל את ההבדל בתפוקת השתן בין עכברים, aliquot בשתן לתוך צינורות חדשים ולאחסן אותם ב -30 ° C עד ביצוע ניתוחים עבור PSA באמצעות ערכת ELISA 7 ו קריאטינין באמצעות ערכת assay 7. למרות עכברים אינם מייצרים PSA, יש רמות נמוכות של ספציפי ולא מחייב מזוהה באמצעות ELISA. לקבלת דוגמיות להיחשב חיובית, יש להגדיר את הסף ערכים יותר מאשר עכברים רגילים + 3 סטיות תקן (SD) 15.

6. נוכחות גידול זיהוי עם בזמן אמת PCR

  1. בסיום הטיפול, לנתח את חלל הבטן של העכבר ולאתר את שלפוחית ​​השתן. ובלו השלפוחית ​​ולמקם אותו לתוך cryovial. להקפיא מיד חנקן נוזלי.
  2. חלץ את הרנ"א על ​​ידי שמאחד את הרקמות בתוך extr RNAמגיב פעולה.
  3. בצע שעתוק לאחור בזמן אמת ניתוח PCR עבור PSA, כמתואר לעיל בסעיף 2.

צמיחת גידול ניטור 7. עם דימות פלואורסצנטי

  1. לייבל 1 x 10 7 תאים MB49-PSA עם פלורסנט לצבוע האינפרה-אדום הקרוב 19.
  2. Re-צלחת ו לקצור את התאים שכותרתו על 4 ימים, 7, 11, 14, 18, ו -21 כדי לבדוק אם התאים לשמור על כדאיות הקרינה על ידי cytometry הזרימה 20.
  3. שותל את תאי MB49-PSA שכותרתו שלפוחיות עכברים, כפי שתואר לעיל בסעיף 4.
  4. צג את צמיחת הגידול באמצעות מערכת דימות פלואורסצנטי כל יומיים.
  5. ביום הדמיה, לשקול להרדים את העכברים באמצעות תערובת של קטמין הרדמה medetomidine (75 מ"ג / ק"ג ו 1 מ"ג / ק"ג, בהתאמה), מוזרק intraperitoneally ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.
  6. לגלח את אזור הבטן כדי לחשוף את העור.
  7. מניחים עכברים בחדר הדמיה ולרכושתמונות של השלפוחיות באמצעות התוכנה המסופקת עם מערכת ההדמיה.
  8. להחיות את העכברים על ידי תת עורית הזרקת תרופה היפוך (1 מ"ג / ק"ג atipamezole) ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.

8. מעקב גדילה גידול עם הדמיה אולטרסאונד בתדירות גבוהה

  1. גידולים שתלו בעכברים, כמתואר לעיל בסעיף 4.
  2. כל יומיים, לפקח גדילת הגידול באמצעות הדמיה אולטרסאונד.
  3. ביום הדמיה, לשקול להרדים את העכברים באמצעות תערובת של קטמין הרדמה medetomidine (75 מ"ג / ק"ג ו 1 מ"ג / ק"ג, בהתאמה), מוזרק intraperitoneally ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.
  4. לגלח את אזור הבטן כדי לחשוף את העור.
  5. להנחיל 100 μL של תמיסת מלח 0.9% סטרילי לתוך שלפוחית ​​השתן באמצעות קטטר 24-מד IV. המלוח יהיה להתנפח השלפוחית ​​ולשפר את החשיפה במהלך הדמית אולטרסאונד.
  6. מניחים את העכבר על פלטפורמת אולטרסאונד ולהחיל ג'ל מוליך אל lבטן ower.
  7. מנמיך את חללית כף היד על העור ולרכוש תמונות-מצב B של שלפוחית השתן על פלטפורמת ההדמיה 21.
  8. להחיות את העכברים על ידי תרופת היפוך הזרקה תת עורי (1 מ"ג / קילו atipamezole) ברמה של 0.1 מיליליטר לכל 10 גרם של משקל גוף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרשת PSA מתאי MB49 נמצאה להשתנות עם תקשורת הצמיחה. MB49-PSA הוא גדל DMEM התקשורת כי זה תוצאות הפרשת PSA מוגבר (איור 1 א). כדי לקבוע את הרגישות של ELISA PSA בזמן אמת PCR, מספרים שונים של תאים מפרישי MB49-PSA היו מעורבים עם תאים הורית MB49. PSA ELISA מזהה מינימום של 1 x 10 5 מפריש PSA תאים / 1 x 10 6 תאים (איור 1B), תוך ניתוח PCR בזמן אמת מזהה 100 תאים PSA מפריש / 1 x 10 6 תאים (תרשים 1C). לכן, בזמן אמת PCR הוא רגיש יותר ELISA, אבל זה יכול להתבצע רק על השלפוחית ​​כולה. זה מגביל את התועלת שהוא ניתוח נקודת הסיום. שיטת PLL של תוצאות השתלת גידול גידולים מרובים (איור 2 א) לפתח בשלפוחית. שניהם אוספים הלילה של כלובים מטבוליים באמצעות שתן (תרשים 2B (תרשים 2B, הפאנל התחתון) ניתן להשתמש כדי למדוד PSA ידי ELISA. לכל במחקרים בבעלי חיים, משקל העכבר יצוין כמדד לבריאות (איור 2 ג, הפאנל העליון), ו- PSA השתן מנוטר על בסיס שבועי (איור 2 ג, הפאנל התחתון) כמדד צמיחת הגידול. יש בדרך כלל קורלציה טובה בין משקל העכבר וגודל הגידול, כפי שהיא נמדדת על ידי ה- PSA. עכברים עם גידולים גדולים להתחיל לרדת במשקל (איור 2 ג, עכברים 3 ו -5). העכברים חלקים שנצפו איור 2C עשויים להיות גידול גדול אבל עדיין להציג במשקל גוף נורמלי. לפיכך, משקל גוף בלבד אינו מידה מספקת של גידול. PSA משמש כסמן פונדקאי טוב של גידול (איור 3A-D). עכברים היו מורדמים על 3 - 5 ימים לאחר ניתוח שתן PSA ביום 14. תמונות של חתכים השלפוחית להראות גודל הגידול ואת rea PSA / קריאטינין המקביל יום 14 x 10 6דינג. וריאציה בגודל הגידולים קשורה לטיפול העכברים קיבלו. איור 3, לוחות לספירה מייצגת עכברים מן 3 קבוצות טיפול שונות. אסטרטגיה חלופית כדי שינוי PSA של תאים היא התיוג של תאים עם צבע. אסטרטגיה זו מבטלת את הצורך בשינוי ובחירת תא. תיוג של תאים MB49-PSA עם פלורסנט לצבוע קל לבצע (איור 4 א), וכן ניטור במבחנה הראו הבטחה במונחים של הישרדות של האות, למרות שכפול התא (איור 4 ב ו-ג). עם זאת, בתחום ההדמיה vivo היה לא מוצלח, משום שהעדכון העכבר גם הקרינה אדום טבעי (איור 4D), אשר הביא הקרינה הלא ספציפית באזור הבטן. השוואה בוצעה בין הדמית אולטרסאונד, הפרשת שתן PSA, וניתוח נקודת סיום PSA. ההדמיה אולטרסאונד של שלפוחית השתן (איור 5 א-ח) הייתה טובה לזיהויגידולים גדולים, אבל זה לא היה כל כך מוצלח עם גידולים קטנים.

איור 1
איור 1. הפרשת PSA מתאי MB49-PSA ואת קביעת גבולות איתור באמצעות ELISA ו- בזמן אמת ניתוח PCR. (א) 1 x 10 6 MB49-PSA תאים גדלו בתקשורת צמיחה שונה, ואת הפרשת PSA ב supernatant זוהה 2 ימים מאוחר יותר על ידי ELISA. התקשורת הצמיחה היו: RPMI עם FBS- (RPMI), RPMI עם FBS פרימיום (RPMI (P)), RPMI עם FBS חלופי (RPMI (H)), ו DMEM עם FBS (DMEM). תאי MB49-PSA גדלו DMEM תקשורת היו הפרשת PSA גבוהה. (ב) בתאי MB49-PSA (10 6 תאים ל -1 תא) היו מעורבים עם תאי הורית MB49 (1 תא עד 10 6 תאים) מצופה במשך 24 שעות. PSA ELISA בוצע על supernatant, ו- RNA הופק מהתאים. מינימום של 1 x 10 5 6 תאים היו לזיהוי על ידי ELISA. (C) 100 מפרישי PSA תאים / 1 x 10 6 תאים היו לזיהוי על ידי ניתוח בזמן אמת PCR. ערכי ציר y מייצגים את ממוצע RQ (כימות יחסית) ± סטיית התקן. ערכי RQ שינויים לקפל יחסית, מתקבלים על ידי נרמול ערכי C T של PSA כדי גן יקטין בטא ולעומת שלפוחית מלאה אשר מוגדרת ב 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
צמיחת גידולים בשלפוחית איור 2. וזיהוי. (א) בדיקה היסטולוגית של שלפוחית שתן 13 ימים לאחר השתלת גידול. שלפוחית ​​השתן פרפין מוטבע נותח ומוכתמים hematoxylin (כחול כהה), אשר STAins הגרעינים, ו eosin (ורוד), אשר מכתים את המרכיבים תאיים הנותרים. ה- PSA / קריאטינין x 10 6 וערך עבור השלפוחית זה בימים 5 ו -13 מוצגים 7/2688. ההגדלה היא 44.8X. סרגל סולם מייצג 1 מ"מ. (ב) שתן נאסף ע"י אחד העכברים הצבת בכלובים מטבולית לילה והעברת בשתן מהצינור אוסף לתוך 2 צינורות מ"ל (הפאנל העליון) או על ידי on-the-spot איסוף שתן מעכברים הרדים (הפאנל התחתון) לתוך 1.5 צינורות מ"ל , אשר לאחר מכן הועברו 0.6 צינורות מ"ל. (ג) לאחר השתלת הגידול, משקל העכברים היה פיקוח פעמיים בשבוע (הפאנל העליון). PSA שתן נמדד לפקח השתלת גידול וצמיחה בעכברים (פנל תחתון). ציר y PSA / crea מייצג PSA השתן מנורמל קריאטינין x 10 6. עכברים הופסקו פעם נרשם פסד של יותר מ -20% של משקל הגוף. הערה: ביטוי גנים PSA זוהה בשלפוחית ​​של העכבר 2 ביום 40, כאשר הוא היה termi נדחים, למרות שהיה לו PSA שתן נמוך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
PSA איור 3. והתפתחויות גידול שלפוחית שתן. (AD) סעיפים היסטולוגית של שלפוחיות עכברים וקצרו ביום 19 (A ו- B), יום 17 (ג) ויום 13 (ד) לאחר השתלת גידול. ביום 4 ו -13 יום או 14 יום השתן PSA / קריאטינין x 10 6 ערכים עבור כל שלפוחית השתן מוצג בצד ימין של כל תמונה ביום בפורמט 4 / יום 13 או 14. PSA השתן / ערכי קריאטינין להגדיל עם גודל הגידול . העכברים לספירת תמונות קבלו טיפולים שונים הסבר להבדלי גודל גידול. ההגדלה היא 41.4X. סרגל סולם מייצג 1 מ"מ."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55078/55078fig3large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. פרופיל של תאי MB49-PSA תווית עם פלורסנט דיי. (א) תאים ויטראז נותחו על ידי cytometry זרימה לפני הציפוי. תאי תווית נבצרו מדי כמה ימים כדי לנתח את עוצמת צבע פלואורסצנטי. (B) אחוז תאי MB49-PSA שכותרתו בתוך שער P2 מ- (A) ב התיוג שלאחר הימים שצוינו. Intensity (C) של צבע פלואורסצנטי נמדד ממוצע קרינה בעצמה (MFI) של האות. (ד) תמונות של עכברים 10 ימים לאחר ההשתלה עם תאים MB49-PSA שכותרתו באמצעות מערכת הדמיה vivo הראו הקרינה הלא ספציפית באזור הבטן.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. תמונות אולטרסאונד של שלפוחיות Murine. שלפוחיות עכברים (א) לפני השתלת גידול (ב) 8 ימים לאחר השתלת גידול. (ג) עד (ח) הם תמונות אולטרסאונד של עכברים שלפוחיות שבועיים לאחר ההשתלה. PSA / crea: PSA השתן מנורמל קריאטינין (10 6). גן PSA: ביטוי גנים של PSA ב בשלפוחית ​​השתן (יומן RQ) מוצג עבור כל שלפוחית ​​שתן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

PSA שתן דימות פלואורסצנטי הדמיה אולטראסאונד
שלבים (זמן נדרש) להרדים עכברים.
אסוף 110 שתן μL. (~ 1 שעות)
בצע PSA ELISA (זמן הדגירה הכולל: 2 שעות 30 דקות)
קריאטינין assay (זמן דגירה: 5 דקות) 		להרדים עכברים.
לגלח פרווה על אזור הבטן.
בצע הדמיה. 		להרדים עכברים.
לגלח פרווה על אזור הבטן.
לצנתר ולטעת 100 μL של תמיסת מלח לתוך שלפוחית ​​השתן.
החל ג'ל מוליך אל בטן תחתונה ולקבל תמונות אולטרסאונד.
ציוד מיוחד קורא צלחת ELISA (באורך גל של 450 ננומטר ו 510 ננומטר) מערכת הדמיה מערכת הדמיה אולטראסאונד
שינוי של תאים סרטניים required (להביע PSA) חובה (קרינה) לא דרוש
יתרונות אָמִין פשוט ומהיר ניתן לזהות גידולים גדולים
מגבלות לא יכול לקבל מספיק שתן
ערך שלילי זה לא אומר היעדר הגידול (ניתוח ביטוי גנים PSA מגביר את הרגישות אבל מוגבל לסיים נקודות ניתוח) 		בחירה קפדנית של צבע פלואורסצנטי נדרשה כדי למנוע רקע גבוה. לא ניתן לזהות גידולים קטנים.
עכבר אחת בכל פעם.

השוואה טבלה 1. שיטות לניטור גדילת גידולים עכבר שלפוחיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם 1) בהצלחה שמירה על tumorigenicity של הקו הסלולרי; 2) להבטיח הפרשת PSA למדידה לפני ההשתלה תאים סרטניים בעכברים; 3) יצירת השעית תא יחיד להשתלה כדי להפחית וריאציה בגודל גידולים; ו -4) הקניית תאים בקצב איטי כדי למנוע ריפלוקס vesico-השופכן, וכתוצאה מכך ההשתלה תאים סרטניים בכליות.

לאחר מעבר ממושך במבחנה, MB49 / תאי MB49-PSA יכולים להפסיד tumorigenicity שלהם, כפי שהוכח על ידי חוסר היכולת שלהם לייצר גידולים בעכברים. זה יכול להיות גורם בלבול באשר לשאלה האם או לא עכברים נרפאים אחרי הטיפול. בהעדר גידולים, לא ניתן להבדיל עכברים לרפא על ידי טיפול מעכברים נרפאו באופן ספונטני עקב גידולי immunogenic או מעכברים ללא גידולים בכלל, כי הקו הסלולרי אינו מסוגל ליצור גידולים. דרך אחת להתמודד עם זה היא מחדש מעבר התאים בעכברים על ידי ייצור suגידולים ב-עורית. אם מחדש passaging זה מתבצע בתדירות גבוהה מדי, גידולים אגרסיביים מדי נוצרים. איזון עדין על מנת לקבוע כשהתאים צריכים להיות מחדש passaged. באופן כללי, לפני סדרה עיקרית של ניסויים, את שורת התאים לתחייה ולאחר מכן מושתל עכברים מתחת לעור כדי לאשר את היכולת שלהם ליצור גידולים. הגידולים מנוטרים במשך כמה שבועות על מנת להבטיח כי אין מרפא ספונטני. עם זאת, אם הם נצפו מרפא ספונטני, אז הפרוטוקול בשלב 3 צריכה להתבצע. כמו כן, היכולת של תאי MB49-PSA לייצר PSA תמיד צריכה להיות אשרה לפני התאים משמשים להשתלת גידול.

PSA שתן ניתן להשתמש כדי לפקח על הצמיחה של גידולים בשלפוחית ​​שתן הוקמו באמצעות תאי MB49-PSA. עם זאת, ערך PSA שלילי או "רגיל" שתן אינו אומר בהכרח היעדרות של תאים סרטניים, אבל רק כי פחות מ -1 x 10 5 תאים קיימים. כמו PSA השתן נקבע סביב יום 47 עד היום, עכברים שנראים אין גידול, בהתבסס על השווי של לעכברים רגילים + 3 SD, ניתן להסיר מהניסוי. חלק עכברים אלה עלולים לפתח גידולים במועד מאוחר יותר. הסרת עכברים ללא גידולים מבטיחה כי גידולים הם מאוד דומים בגודלם לפני תחילת כל טיפול. פעולה זו מפחיתה וריאציה בשל גודל הגידול בתגובה לטיפול. אחד הגורמים העיקריים וריאציה גודל הגידול הוא ובהצטברויות תאים לפני ההשתלה, כך המאמצים צריכים להיעשות כדי מחדש להשעות תאים לפני ההשתלה.

עם זאת, כאשר מספר קטן של עכברים משמשים, זה עשוי להיות נחוץ כדי לשמור את כל העכברים במחקר, גם אם הגידולים אינם מדידים ימים 4 - 7. ידי ניטור PSA ביום 11, היא עדיין עשויה להיות אפשרית לקטלג אלה עכברים כמי היו גידולים קטנים, וניתוח נקודת סיום יכול להתבצע ביחס לגודל הגידול הראשוני (מבוסס על הנוכחות של PSA שתן מדידים בימים 4 - 7 לעומת יום 11). היתרון של היכולת לכמת גידוליםעם ערכי PSA שונים הוא שכל העכברים עשויים להיכלל במחקר, ואת התגובה לטיפול יכולה להיקבע על בסיס ערכי PSA / קריאטינין שלהם ביחס לגודל הגידול המקורי. נקודה נוספת לדאגה היא ריפלוקס vesico-השופכן. זה יכול לגרום להתפתחות גידולים בכליות. צמצום נפח להיות החדירו מ 100 μL 50 μL וביצוע החדרה לאט מקטין את הסבירות של התרחשות מעין זו.

אחת הבעיות הקשורות מבוססי מבחני שתן היא איסוף שתן מופחת כפי שנצפה גידולים orthotopic לגדול בשלפוחית. בעוד שתן ניתן לאסוף בקלות מעכברים במהלך השבועות הראשונים לאחר ההשתלה, עם הזמן, את נפח השתן שנאסף עשוי שלא להספיק עבור מדידות PSA קריאטינין. ההיקף המינימאלי של שתן שדרוש הוא 110 μL, אבל יותר עדיף. לפיכך, קריאות PSA עשויות שלא להיות זמינות עבור כל העכברים בנקודות מאוחר יותר זמן. כמו כן, תמס של כדוריות דם אדומות בשתן נותן באופן כוזבקריאה גבוהה על ELISA PSA. Assay הלא שתן מבוססת יכול להתגבר על בעיה זו. למרבה הצער, אם כי דימות פלואורסצנטי היא פשוטה לשימוש, מצאנו כי להאכיל העכבר היה אדום פלואורסצנטי גם כן. זה נתן רקע גבוהה שכנגדה השלפוחית ​​לא ניתן היה לראות בקלות. יתכן כי באמצעות צבע פלואורסצנטי ירוק או חלבון יכול להתגבר על בעיה זו, כפי שתואר על ידי סוויני et al. 10 עבור הקרינה ואולטרסאונד הוא, עכברים צריכים להיות מגולחים על פני שטח הגחון.

תמונות אולטרסאונד להיראות טוב כמו ביטוי גנים PSA באיתור גידולים. עם זאת, החסרון של הדמית אולטרסאונד הוא כי השלפוחית ​​חייבת להיות נפוחה במהלך הדמיה כדי לקבל ויזואליזציה גידול טובה. בעוד התמונות ברורות כאשר הגידול בשלפוחית ​​הוא גדול, קשה להבדיל גידולים קטנים בעכברים מהעדר הגידולים. זה כבר דווח כי אולטרסאונד יכול לזהות גידולים סביב 1.5 מ"מ קוטר 22, אבל ביום 4לאחר ההשתלה, גידולים קטנים בהרבה מזה. לכן, שיטה זו לא יכולה להיות טובה עבור זיהוי של גידולים ביום 4. טבלה 1 משווה 3 מערכות בקרת גידול השונות; ה- PSA ELISA היא הקלה ביותר לשימוש ואינו דורש מערכות הדמיה קטנים בעלי חיים, אשר לא יכול להיות זמין בכל מתקני בעלי חיים.

בהתחשב הרגישות רבה יותר של ניתוח בזמן אמת PCR של ביטוי גני PSA, ניתן להשתמש בו במקום של אימונוהיסטוכימיה לאשר עכברים נרפאו כאשר הופסק הניסוי. עם אימונוהיסטוכימיה, גידול של 0.2 - 0.3 מ"מ ניתן לזהות על ידי יום 4 לאחר ההשתלה 15. עם זאת, זוהי שיטה לניתוח נקודת סיום כי לא ניתן להשתמש כדי לפקח על השתלת גידול. במחקר זה, MRI לא הוערך, אבל זה כבר דיווח להיות מסוגל לזהות את נוכחותם של גידולים ביום 10 לאחר השתלת 8. על ידי שינוי תאי להביע את החלבון פלורסנט ירוק (GFP), זה אניאפשרי כדי לאשר השתלת גידול על ידי יום 7. שילוב של PSA שתן מוקדם לזהות השתלת גידול וניתוח בזמן אמת PCR בסיום הטיפול מספקים חיווי קולי וחזותית של השתלת גידול יעילות טיפולי בין קבוצות טיפול השונות.

חסרון של הפרוטוקול שלנו הוא בעיקר כי assay ELISA לא יכול לאשר את קיומו של גידולים כאשר מספר התא הנוכחי הוא פחות מ -10 5 תאים. לכן יותר מבחנים רגישים צריכים להיות מפותחים כמו גם מבחנים מהר כדי להפחית את הזמן דרוש לגילוי PSA. ELISA לוקח כמה שעות כדי לבצע. שיטה מהירה כגון assay קריאטינין אשר מבוסס על השיטה היפה 23 לוקח בערך 5 דקות כדי לבצע ייפשט מאוד ניטור של גידול. לשם כך, שיטת אנזים מבוסס כדי לזהות פעילות PSA הוערכה, אבל זה לא היה מוצלח. השימוש בזהב קולואידים ומערכות assay מבוסס ננו-חלקיק יכול להפחית את הזמן שנדרש כדי לבצע א assaynd להגדיל את הרגישות 24. בהקשר זה, חיישנים מבוססי אלקטרודה וחיישנים מבוססים אלקטרוכימי באמצעות חלקיקים פותחו כדי assay PSA אדם 25-27 ואם העלות היא סבירה עשויות לחול על במודל החיה. מערכת assay יכולה להיות גם שיפור באמצעות מערכת הפרשת חלבון שונה כגון GFP או בלוציפראז שבו assay מבוצעת בתנאים אופטימליים במבחנה ולא תלוי הדמית in vivo אשר תלוי חמצון רקמות.

בעוד סרטן כימי בעכברים מייצר גידולים עם דמיון הסרטן בבני אדם במונחים של מוטציות 28, נדרשו זמן רב יותר לייצר אינם כפי דומים בגודלו בין בעלי החיים, הדורשים מספרים גדולים יותר של עכברים אשר מגדיל את העלות של ניסויים. כאשר מיקוד סוכני הכרת חלבונים אנושיים הם להיבדק, xenografts אדם מושתל מתחת לעור ב חיסוני משולבת בעירום או חמור(SCID) עכברים הם האפשרות היחידה. אף על פי מודלים אלה מספקים הוכחה של מושג הכרת נוגדן, היעדר מערכת חיסון ללא פגע מעכבת הערכת ההפעלה חיסונית. ההתפתחות האחרונה של מודל עכברי למחלת סרטן שלפוחית השתן באמצעות xenografts אדם 29, מספקת כמה תובנה חיסוניות, אבל כמו תאים מושתלים מתחת לעור זה לא באמת לשחזר את סביבת מחלות האנושית. מהבחינה טכנית, קשה לייצר גידולי orthotopic בעכברים חסרים חיסוניים. לכן מודל orthotopic syngeneic למרות מגבלותיו הוא עדיין מודל טוב ההערכה והפיתוח של טיפול בסרטן שלפוחית ​​השתן כפי שהוא מספק את מיקום רקמות הנכון המאפשר חשיפה מבוקרת לטיפול דוגמנות המצב הקליני ואת היכולת להעריך את ההשפעה של תאי חיסון של פונדקאי במהלך הטיפול בסרטן. כל זה בשילוב עם התפתחות גידולים מהירה בעכברים ואת היכולת לעקוב אחר תוצאות צמיחת גידול במודל חסכוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MB49-PSA cells N/A N/A ref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 media HyClone SH30027.01 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media Biowest L0102
Fetal Bovine Serum (FBS) South American Biowest S1810
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium Biowest S181B
Fetal Bovine Serum (FBS) HyClone SH30088.03 
L-glutamine Biowest X0550
Penicillin-Streptomycin Biowest L0022
Hygromycin B Invitrogen 10687-010
free PSA (Human) ELISA kit Abnova KA0209
TRIzol Reagent for RNA extraction  Ambion 15596026
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor Applied Biosystems 4374967
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb Applied Biosystems 4331182 Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 Applied Biosystems 4331182 Hs00426859_g1
C57BL/6J female mice In Vivos 4 - 6 wk old
Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine) Local pharmacy
Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole) Local pharmacy
Ear punch Electron Microscopy Sciences 72893-01
Hartmann's solution or Compound sodium lactate B Braun
Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment Alcon
Heat pack - HotHands handwarmers Heatmax Inc
Introcan Certo IV catheter B Braun 4251300 24 G x 3/4″
Aquagel Lubricating jelly Local pharmacy
Poly-L-lysine solution, 0.01%, Sigma P4707
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001
Quantichrom Creatinine Assay Kit BioAssay Systems DICT-50 
Fluorescent dye - VivoTrack 680 Perkin Elmer NEV12000 
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution Ambion 4427575
Name Company Catalog number Comments
Equipment and Software
7500 Realtime PCR System Applied Biosystems
7500 Software v2.3 Applied Biosystems
Metabolic Cage Tecniplast  Vertical type rack for 12 cages
BD FACSCanto I system  BD Biosciences
BD FACSDiva software v7 BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system  Caliper Life Sciences 
Living Image Software v3.1 Caliper Life Sciences 
Vevo 2100 imaging system  VisualSonics 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
  2. Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  3. Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
  4. Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
  5. Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181 (2013).
  6. Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
  7. Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684 (2011).
  8. Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
  9. Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
  10. Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3 (2016).
  11. Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
  12. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
  13. Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
  14. Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
  15. Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
  16. Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
  17. Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
  18. Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172 (2012).
  19. Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075 (2007).
  20. Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
  21. Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718 (2015).
  22. Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
  23. Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
  24. Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
  25. Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
  26. Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
  27. Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
  28. Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
  29. Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).

Tags

Cancer Research גיליון 119 שלפוחית ​​השתן גידולים עכברים orthotopic מודל איתור שתן
מודל גידול Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן סרטן מערכת איתור
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tham, S. M., Esuvaranathan, K.,… More

Tham, S. M., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System. J. Vis. Exp. (119), e55078, doi:10.3791/55078 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter