Summary
このプロトコルは、雌のC57BL / 6Jマウスにおけるマウス同所性膀胱腫瘍の発生および腫瘍増殖の監視について説明します。
Abstract
このプロトコルは、ヒト前立腺特異抗原（PSA）、および腫瘍移植の確認のための手続きを分泌するように改変されたマウス膀胱癌細胞株MB49を使用して、雌C57BL / 6Jマウスに膀胱腫瘍の発生について記載しています。簡潔には、マウスは、注射可能な薬剤を使用して麻酔し、仰臥位に配置するために形成されています。尿が膀胱から空いており、ポリ-L-リジン（PLL）の50μLをゆっくりと24 G IVカテーテルを用いて、10μL/ 20秒の速度で滴下します。これは、カテーテルを栓により20分間膀胱内に残されています。カテーテルを除去し、PLLは、膀胱に優しい圧力で空きました。これは、10μL/ 20秒の速度でマウス膀胱癌細胞株（1×10 5細胞/ 50μL）の注入が続きます。カテーテルは、早期の避難を防止するために栓をされています。 1時間後、マウスを反転薬物と復活され、膀胱が空にされます。遅い点滴速度が重要であり、それは腫瘍が上部尿路に、腎臓に発生させることができます膀胱・尿管逆流を減少させるので。細胞株は、よく、これは移植後凹凸腫瘍サイズをもたらすことができるように、細胞の凝集を減少させるために再懸濁されるべきです。
この技術は、高効率で腫瘍を誘導します。腫瘍の成長は、尿中のPSA分泌によって監視されています。 PSAマーカーのモニタリングは、膀胱内の腫瘍の存在を検出するための超音波又は蛍光イメージングよりも信頼性が高いです。放置すれば4週間 - マウスの腫瘍は、一般に、約3により最大サイズ悪影響を与える健康に達します。腫瘍増殖をモニタリングすることによって、正常に腫瘍を移植されなかったものから硬化したマウスを区別することが可能です。唯一のエンドポイント分析を用いて、後者は、誤って治療することによって硬化されていると仮定することができます。
Introduction
この方法の目的は、腫瘍移植なしのマウスは、エンドポイント分析で硬化されたと考えられないように、マウス同所性膀胱腫瘍を生成し、可能な限り正確に移植された腫瘍を監視することです。全体として、示された方法は、実験的な分析のためにマウスの多くの必要性を低減し、治療結果を決定する際に高い精度を確保します。
注入し、腫瘍細胞を皮下臨床疾患の環境を再現または治療戦略の開発を可能にしないように癌の同所性モデルの開発は、重要です。膀胱のアーキテクチャは、直接、最小限の全身作用を持つ膀胱に膀胱癌治療の点滴注入を可能にします。したがって、例えば、同所性モデルとして、この環境を再現する動物モデルは、新しい治療法を評価することが重要です。いずれの実験のセットアップから引き出された結論はdependenされていますモデルの限界時のトン。
いくつかの技術は、マウスにおける同所性膀胱腫瘍の産生のために開発されてきました。これらは、膀胱のグリコサミノグリカン層を損傷注入する腫瘍細胞を有効に頼ります。使用される技術は、膀胱1,2内の1つのサイトで、腫瘍の発生につながる、膀胱壁に損傷の一点につながる電気焼灼を含みます。しかし、電気メスを用いた腫瘍移植の成功率は、オペレータに依存10から変化している - 90％、およびそれが腹腔内現像腫瘍を引き起こす、膀胱壁がパンクする危険性を含みます。化学焼灼は硝酸銀、損傷膀胱壁3を用いて行われます。同様に、酸は、膀胱壁4を損傷するために使用されています。トリプシンはまた、ウェル5のように、膀胱に損傷を与えるために使用されています。これらの方法は、膀胱内の複数の腫瘍の発達をもたらすことができます。化学物質は長すぎるために膀胱壁に接触して残っている場合はさらに、膀胱に重大な損傷の危険性があります。 Ninalga らによって開発された方法。正に帯電したポリ-L-リジン（PLL）被覆膀胱壁への6分子を使用します。これは、膀胱のグリコサミノグリカン層に固執する負に帯電した腫瘍細胞を可能にします。この方法は、一般に、膀胱内に開発複数の腫瘍を生じるが、腫瘍移植80である- 100％の4,7。技術的には、また、実行するための最も簡単な手順です。開発腫瘍があってもサイズがかなりあることを確実にするために、腫瘍細胞は、移植前に大きな塊にグループ化されていないことが重要です。
治療効果を評価するためには、かなり類似したサイズの腫瘍を有するマウスにこの研究を実行するのが最善です。したがって、すぐに移植後に腫瘍の大きさを定量化することができ、良好な検出システムは、重要です。いくつかの戦略は、蜂を持っていますn個の腫瘍を評価するために使用されます。これらは、磁気共鳴イメージング（MRI）8-10、蛍光11、生物発光12,13、超音波14、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）15,16を含みます。 MRIと超音波が腫瘍細胞の改変を必要としないが、MRIのために敏感な機器およびコントラスト剤が必要とされています。 luminescence-、蛍光 - 、およびELISAベースのアッセイは、これらの方法によって検出することができるマーカータンパク質を発現する腫瘍細胞の改変を必要とします。発光のために、基板は、ルシフェラーゼ活性の検出のために必要とされます。このように、追加されたステップおよびコストの増大があります。発光と蛍光の両方が特殊な装置を必要とします。蛍光を生成するために、分子酸素によって触媒される緑色蛍光タンパク質（GFP）の環化は、必要とされます。このように、GFP発現は、このかなり信頼性の低いマーカー作り、酸素へのアクセスに応じて、腫瘍塊内で可変であってもよいです
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Protocol
すべての動物の作業は、動物使用上の施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインに付着し、シンガポール国立大学（プロトコル番号084/12）を取り扱います。
1. インビトロ MB49-PSAの細胞を増殖し、PSAの分泌を測定します
- マウス膀胱癌細胞を37℃インキュベーター内で10％ウシ胎児血清（FBS）、2ミリモル/ LのL-グルタミン、および0.05ミリグラム/ mlのペニシリン-ストレプトマイシンを補充した完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でMB49-PSA 15を維持します °C、5％CO 2。 PSA分泌細胞の選択圧を維持するために200μg/ mLのハイグロマイシンBを加えます。
- PSA分泌、プレート6ウェル培養プレート中で1×10 6個の細胞を決定し、48時間、5％CO 2の存在下で37℃でそれをインキュベートします。
- 2日後、PSA測定のための上清を収集します。
- パスツールピペットを使用して、SUPを転送します15mLの遠心管にernatant。
- 浮遊細胞および破片を除去するために、250×gで5分間遠心します。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ中で30°C - PSAアッセイは、異なる日に行われた場合、に上清を保存します。ない場合は、すぐに次のステップに進みます。
- 人間のフリーPSA ELISAキット7を使用して、PSA濃度を決定します。
- 播種した細胞を列挙します。
- パスツールピペットを用いて、DMEM 1mLで穏やかに細胞を洗浄します。吸引し、完全にメディアを取り出します。
- 新鮮な培地の1 mLを加え、よくから細胞を取り除くために、セルスクレイパーで軽くこすり。
- マイクロ遠心チューブに細胞を移し、単一細胞懸濁液を確実にするために十分に再懸濁します。
- 細胞懸濁液と0.4％トリパンブルー溶液を等量混合します。血球計数器を使用して（色素を取り込まない）生細胞を数えます。
- NGとPSA発現を算出メディア/ 10 6細胞のPSA / mLと。 120 ngの/ mLの/ 10 6細胞-マウスでの移植のためのMB49-PSA細胞のPSA発現は80です。
2. ELISAおよびリアルタイムPCR分析によって、PSA測定の感度を決定します
- ウェル当たり1×10 6個の細胞（ すなわち、10 0、10 1、10 2、10の最大値が存在するように、親MB49細胞の異なる量の6ウェル培養プレート中の完全DMEM培地中でプレートMB49-PSA細胞3、10 4、10 5、または10 6 MB49-PSA細胞）は、それぞれ、10 6、10 5、10 4、10 3、10 2、10 1、または10 0 MB49細胞と共に培養されます。
- 1日後、ステップ1.3で説明したように、PSAの測定のために上清を収集します。人間のフリーPSA ELISAキット7を使用して、PSA濃度を決定します。
- 細胞からRNAを抽出します。
- 溶解しますRNA抽出試薬1ミリリットルを添加することにより、直接プレート中の細胞。
- 室温で5分間インキュベートし、マイクロ遠心チューブに細胞溶解物を移します。クロロホルム0.2 mLを加え、15秒間激しくサンプルをボルテックス。室温で3分間、それらをインキュベートします。
- 4℃で15分間、12,000×gでサンプルを遠心。慎重に相間を乱すことなく、新鮮なチューブに上部の水相（0.5ミリリットル）を転送。
- イソプロピルアルコール0.5 mLを加え。室温で10分間インキュベートします。 4℃で10分間、12,000×gでサンプルを遠心。チューブの底にRNA沈殿物を乱すことなく、完全に上清を取り除きます。
- 75％エタノール1mLで一回ペレットを洗浄。 4℃で5分間、7500×gで遠心分離します。すべてのエタノールを除去し、10分間空気乾燥さペレットを許可します。
- ヌクレアーゼフリー水30μL中のRNAを溶解させます。従ってを増加させるために60℃で5分間インキュベートlubility。
- 260ナノメートル（A260）での紫外線（UV）分光法を用いて吸光度を測定することにより、RNAを定量します。 RNAの純度を評価するために、280 nmの（A280）での吸光度を測定し、1.6を超えるべきであるA260 / A280比を計算します。
- 2μgのRNAからcDNAを逆転写します。
- 氷上で反応液を調製し、0.2 mLチューブに移します。
- 簡単に言えば内容をスピンダウンし、気泡を除去するために、チューブを遠心します。
- 以下の条件でサーマルサイクラーにチューブをロードし、逆転写反応を行います。95℃で5分間、続いて37℃で60分。実行が完了した後、4℃でcDNAサンプルを保持します。
- 長期保存のために30°C - でサンプルを保管してください。
- PSAと細胞質βアクチンのためのリアルタイムPCR分析を行います。ベータアクチンは、サンプルを正規化するために使用されます。 96ウェルナンプラーに逆転写されたRNA 100ngの上のアッセイを行いますTE。三連ですべてのサンプルをアッセイ。 50℃で2分間、変性95℃、95℃、15秒で10分間、および60℃で1分：次のパラメータを使用して40サイクルを行います。サイクル閾値35の（CT）での検出の下限を設定します。このように、35を超えたCT値を持つ任意のサンプルでは検出できないと考えられています。
3. MB49-PSAの細胞株の腫瘍形成性を維持
注：in vitroでの長期成長は腫瘍形成性の損失につながります。腫瘍形成性を維持するために、MB49-PSAの細胞株は、2年ごとに少なくとも一回、マウスを介して継代されています。
- 細胞。
- 収穫は指数関数的に無菌のセルスクレイパーで軽くそれらをこすることによって細胞を増殖させます。細胞懸濁液と0.4％トリパンブルー溶液を等量混合します。血球計数器を使用して生細胞を数えます。細胞の20％以上が死んでいる場合は移植しないでください。
- 必要な生きた細胞の量を計算し（1×107細胞/ mL）および15mLの遠心管に移します。 4℃で5分間、250×gで遠心分離し、上清を捨てます。 DMEMブランクメディアで細胞ペレットを再懸濁します。移植前にFBSのすべての痕跡を除去するために洗浄を3回繰り返します。
- マウスは移植のための準備が整うまで氷上で細胞懸濁液を保管してください。
- 背側腹部にマウスの皮下腫瘍細胞を移植。
- （それぞれ、75ミリグラム/ kg及び1mg / kg）で麻酔薬ケタミンの混合物を使用し、メデトミジン4〜6週齢のC57BL6 / Jマウスを麻酔、体重10gあたり0.1mLので腹腔内注射しました。
- 肌を露出させるために右脇腹を剃ります。
- ピンセットを用いて、皮下に24 G針を用いて、基礎となる筋肉からそれを分離し、細胞懸濁液（1×10 6細胞）の0.1 mLのを注入するために皮膚を持ち上げます。針を除去しながら、腫瘍細胞が行うように、5〜10秒間注入部位をピンチ注射部位から漏出しません。
- 体重10グラム当たり0.1 mLのアチパメゾール（1mg / kg）の皮下注射でマウスを復活させます。
- ノギスを用いて腫瘍直径を測定することにより、2日毎に腫瘍の増殖を監視します。腫瘍体積」は、「MMの両方において、最長寸法及び「b」は垂直な幅である、式V =（A-B）/ 2を使用して計算されます。
- 腫瘍体積が少なくとも50 mm 3で（約7日）の場合、CO 2でマウスを安楽死させます。 DMEM中で無菌条件下で滅菌ピンセットやハサミと場所との腫瘍塊を切り出します。
- 6ウェル培養プレートに、無菌の外科用メスを用いて小片に腫瘍をミンチ。さらに、腫瘍を脱凝集する「乳棒」として1 mLのシリンジプランジャを使用してください。
- 完全DMEMの3 mLを加え、維持する細胞をインキュベーター中、37℃で、5％CO 2。
- 細胞はプラットに付着したら、E（1と2日間）、滅菌したパスツールピペットで静かに吸引することによって、メディア、破片、および非接着細胞を除去します。 DMEMで二回洗浄します。細胞を乱さないように注意してください。
- DMEMの1 mLを加え、セルスクレーパーでそれらをこすることによって細胞を採取します。単一コロニーを選択して展開するには、96ウェル培養プレートにウェル当たり血球計数器およびプレート1細胞を用いて細胞数を計測します。培養の37℃での200μg/ mLのハイグロマイシンBを含むDMEM中で細胞を、5％CO 2。
- 5日間 - すべての4メディアおよび抗生物質を変更します。彼らは約80〜90％のコンフルエントになるまで細胞を監視します。再プレートピペッティングにより24ウェル培養プレート上の細胞をウェルから細胞を除去します。
- 24ウェル培養プレート中の細胞がコンフルエントになったら、細胞スクレーパーで掻き取ってそれらを除去し、6ウェル培養プレートにそれらをプレート。
- 最高のPSAの秘密を使用してクローンをクライオ保存する手順1で説明したように、PSA分泌のための異なるクローンを選別イオンとは、将来のマウス実験のためにそれを使用しています。
4.腫瘍を移植
注：各マウスは、膀胱内のDMEMブランクメディアの50μLで1×10 5 MB49-PSA細胞を移植されています。カテーテル内のデッドスペースに、常に余分なボリューム（マウス当たり余分少なくとも100μL）を準備します。別のアプローチは、Kasman らによって記載されているように、空気充填された注射器を使用することであろう。むしろ充填された注射器よりも5。
- 細胞。
- 一日、細胞を約80％コンフルエント、通路完全DMEM培地中のMB49-PSA腫瘍細胞（10％FBS、2ミリモル/ LのL-グルタミン、0.05ミリグラム/ mlのペニシリン - ストレプトマイシン、及び200を補充された移植前2：1のスプリット比で37℃、5％CO 2にて/ mlのハイグロマイシンB）。
- 手続きの日に、無菌のセルスクレイパーで軽くそれらをこすることによって細胞を採取します。細胞懸濁液を等量混合し、0.4％トリパンブルー溶液。血球計数器を使用して生細胞を数えます。細胞の20％以上が死んでいる場合は移植しないでください。
- 必要生細胞（2×10 6細胞/ mL）の量を計算し、15mLの遠心管に移します。 4℃で5分間、250×gで遠心分離し、上清を捨てます。 DMEMブランクメディアで細胞ペレットを再懸濁します。移植前にFBSのすべての痕跡を除去するために洗浄を3回繰り返します。
- マウスは移植のための準備が整うまで氷上で細胞懸濁液を保管してください。
- 4〜6週齢の雌C57BL / 6Jマウスは、手順の前に1週間順化することができます。すべての動物の作業は、無菌状態を維持するために、生物学的安全キャビネット内で実行する必要があります。
- 体重10グラム当たり0.1 mLで腹腔内に各マウスを計量し、麻酔を注入（75ミリグラム/ kgのケタミンおよび1mg / kgのメデトミジン）。 Bodyweightsは17と22グラムの間であるべきです。何RESPOを観察しないことにより、麻酔を確認つま先のピンチの後にNSE。
- 識別のために、耳パンチを用いて耳をマーク。
- 水分補給のための2時間-体重10グラム毎に1あたり0.1 mLで腹腔内ハルトマンの溶液または化合物の乳酸ナトリウムを注入します。
- まばたき反射が麻酔下で失われ、目が乾くされているので、滅菌綿球を使用して、両眼に無菌眼軟膏を適用します。必要なときに再適用します。
- 体温を維持するために（空気との接触によって活性化される）熱パックの上にペーパータオル上で仰臥位でマウスを置き、下に後ろ足をテープで固定します。
- 指で、下腹部に穏やかな圧力を適用し、1.5 mLのマイクロ遠心チューブに膀胱から尿を収集します。このサンプルでは、尿中のPSAの基礎値として機能します。
- 1 mLシリンジに無菌のポリ-L-リジン（PLL）を撤回し、削除針スタイレットで、24ゲージIVカテーテルを添付します。カテーテルおよびインの先端に潤滑剤を塗布カテーテル法を導くために鉗子を使用して膀胱に尿道を通してカテーテルをERT。抵抗が感じられるときに停止します。注：研究者は、膀胱内点滴注入のための麻酔薬との潤滑ゲルを使用する必要性および処置後の鎮痛薬の使用についての彼らの獣医学スタッフと議論する必要があります。
- 膀胱尿管逆流18を回避するために、10μLのすべての20 sの速度で、ゆっくりとPLLの50μLを植え付けます。流出を防ぐためにストッパーで20分間膀胱内のカテーテルを残します。
- 20分後、カテーテルを取り外し、ゆっくりと下腹部を押して、任意のコンテンツの袋を空けます。空の1mLの注射器を使用して、カテーテルのうち残りの内容をフラッシュ。
- ピペッティングにより完全MB49-PSAの細胞を混合し、1 mLシリンジにそれらを撤回。カテーテルを取り付け、潤滑剤を塗布。 10μLごとに20秒の低速で1×10 5細胞の50μLを植え付けます。ストッパーを上に置き換えカテーテル。対照マウスに生理食塩水50μLを与えます。
- 1時間後、カテーテルを除去し、任意のコンテンツの袋を空けます。後ろ足でテープを外し、自分の腹側面にマウスを置きます。体重10グラム当たり0.1 mLの逆転薬（1ミリグラム/キログラムアチパメゾール）を皮下注射によってマウスを復活させます。
- 運動が観察されるまでマウスを監視します。ケージにマウスを返します。
- 腫瘍検出プロトコル（セクション5、7、または8）が完了すると、CO 2を使用して、マウスを安楽死させます。死後腫瘍検出部6に記載されています。
ELISA 5.モニタリング腫瘍増殖
注：腫瘍の存在と成長は尿中のPSA分泌を測定することにより、マウスに監視されています。研究者は、動物の健康と幸福後腫瘍移植および人道的エンドポイントを監視する上での獣医のスタッフに相談してください。
- マウスから尿を収集するための二つの方法があります。
- 糞便物質からの尿を分離するように設計された個々の代謝ケージに一匹のマウスを置くことによって、尿一夜を収集します。セットアップは、冷蔵されていない場合は、一晩PSAの劣化を防止するために、尿収集チューブにプロテアーゼ阻害剤（100μL）を加えます。しかし、利用可能な代謝ケージの数は、尿収集のこの方法の有用性を制限しています。
- それは（そのようなABSL2の部屋のように）代謝ケージを使用するロジスティック不可能である場合には、ステップ4.2.1で説明したように、マウスを麻酔しながら、下腹部に穏やかな圧力をかけるために指を使用して、スポット尿を収集します。治療が点眼される前に、これは通常行われています。私たちの経験から、尿の少なくとも150μLは、麻酔1時間後に収集することができます。
- 直ちに氷上に採取した尿を置きます。血尿は、腫瘍移植後の第2週目から見ることができます。高い溶血サンプルは、ELISA分析に影響を及ぼし得ます。したがって、尿氷の上に置き、収集した後、迅速に処理しなければなりません。
- 細胞またはデブリを除去するために4℃で5分間、6700×gで尿管を遠心。
- 新しいチューブに尿尿マウスとの間出力、一定分量の違いを正規化し、アッセイキット7を使用してELISAキット7を使用して、PSAおよびクレアチニンのための分析を行うまで-30℃で保管してください。マウスは、PSAを産生しないにもかかわらず、ELISAを用いて検出された結合、非特異的低レベルがあります。サンプルが陽性であるとみなされるためには、しきい値は正常マウス+ 3標準偏差（SD）15よりも大きい値に設定する必要があります。
リアルタイムPCR 6.検出腫瘍のプレゼンス
- 終了時に、マウスの腹腔を分析し、膀胱を探します。膀胱を切除し、クリオバイアルにそれを置きます。液体窒素中で直ちに凍結します。
- RNA EXTRで組織を均質化することにより、RNAを抽出アクション試薬。
- セクション2で説明したように、PSAのための逆転写およびリアルタイムPCR分析を行います。
蛍光イメージング7.モニタリング腫瘍増殖
- 近赤外蛍光色素19で1×10 7 MB49-PSAの細胞を標識。
- プレート-Reおよび細胞は20フローサイトメトリーにより生存度および蛍光を保持するかどうかをチェックするために日4、7、11、14、18、および21上の標識細胞を収穫。
- セクション4で上述したように、マウスの膀胱中の標識MB49-PSAの細胞を移植します。
- 2日毎に蛍光イメージングシステムを用いて、腫瘍の増殖をモニターします。
- 撮影の日に、（それぞれ、75ミリグラム/ kg及び1mg / kg）麻酔薬ケタミンの混合物とメデトミジンを使用して、マウスを計量し、麻酔、体重10グラム当たり0.1 mLで腹腔内注射。
- 肌を露出するために腹部を剃ります。
- 撮像チャンバーにマウスを置き、取得イメージング・システムに付属のソフトウェアを使用して膀胱の画像。
- 体重10グラム当たり0.1 mLの逆転薬（1ミリグラム/キログラムアチパメゾール）を皮下注射によってマウスを復活させます。
高周波超音波イメージング8.モニタリング腫瘍増殖
- 4章で前述したように、マウスにおける移植片腫瘍を、。
- 2日毎に、超音波イメージングを用いて腫瘍の成長を監視します。
- 撮影の日に、（それぞれ、75ミリグラム/ kg及び1mg / kg）麻酔薬ケタミンの混合物とメデトミジンを使用して、マウスを計量し、麻酔、体重10グラム当たり0.1 mLで腹腔内注射。
- 肌を露出するために腹部を剃ります。
- 24ゲージIVカテーテルを用いて膀胱内に0.9％滅菌生理食塩水の100μLを植え付けます。生理食塩水は、膀胱を膨張させると、超音波画像中の視認性が向上します。
- 超音波プラットフォーム上にマウスを置き、リットルに導電性ゲルを適用owerの腹部。
- 皮膚へのハンドヘルドプローブを下げて撮影台21上の袋のBモード画像を取得します。
- 体重10グラム当たり0.1 mLの逆転薬（1ミリグラム/キログラムアチパメゾール）を皮下注射によってマウスを復活させます。
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Representative Results
MB49細胞からのPSAの分泌は、増殖培地と共に変化することが見出されました。これは、増加したPSA分泌（ 図1A）をもたらすため、MB49-PSAは、DMEM培地で増殖させます。 PSA ELISAおよびリアルタイムPCRの感度を決定するために、MB49-PSA分泌細胞の異なる数がMB49親細胞と混合しました。リアルタイムPCR分析は100 PSA分泌細胞/ 1×10 6細胞（ 図 1C）を検出しながら、PSA ELISAは、1×10 5 PSA分泌細胞/ 1×10 6細胞（ 図1B）の最小値を検出します。このように、リアルタイムPCRは、ELISAより高感度であるが、それだけで全膀胱を行うことができます。これは、エンドポイント分析にその有用性を制限しています。膀胱に開発複数の腫瘍における腫瘍移植結果のPLL方式（ 図2A）。代謝ケージを使用して、尿の一晩のコレクション（ 図2Bの両方図2B、下のパネル）は、ELISAによってPSAを測定するために使用することができます。すべての動物実験は、マウスの体重は、健康状態（ 図2C、上パネル）の指標として注目され、そして尿PSAは、腫瘍増殖の尺度として、毎週（ 図2C、下のパネル）で監視されています。 PSAによって測定されるように、マウスの体重と腫瘍の大きさとの間に良好な相関関係は、一般的にあります。大きな腫瘍を有するマウスは、（ 図2C、マウス3及び5）体重を減らすために開始します。 図2Cにおいて観察されたいくつかのマウスは大きな腫瘍を持っているが、まだ正常な体重を表示することができます。したがって、単独で体重は、腫瘍増殖の十分な尺度ではありません。 PSAは、腫瘍増殖（ 図3A-D）の良好な代用マーカーとして役立ちます。マウスを約3安楽死させ、 - 14日目にPSAのための5日間の尿分析後膀胱断面の画像は、腫瘍の大きさと対応する14日PSA /クレアチニン×10 6 REAを示します鼎。腫瘍の大きさの変化は、マウスが受けた治療に関連しています。 図3、パネルADは、3つの異なる治療群のマウスを表します。細胞のPSAの修正に代わる戦略は、色素による細胞の標識です。この戦略は、細胞形質転換および選択の必要性を排除します。蛍光色素でMB49-PSA細胞の標識は（ 図4A）を実行するのは簡単です、そしてインビトロ監視に細胞複製（ 図4BおよびC）にもかかわらず、信号の生存の面で約束を示しました。マウスフィードも腹部での非特異的な蛍光をもたらした自然な赤色蛍光（ 図4D）を 、持っていたので、しかし、in vivoイメージングでは 、成功しませんでした。比較は、超音波イメージング、PSA尿分泌、およびPSAのエンドポイント分析の間で行われました。膀胱（ 図5A-H）の超音波イメージングは、識別のためによかったです大きな腫瘍が、それは、小さな腫瘍を有するので、成功しませんでした。
図1. PSAのMB49-PSA細胞から分泌およびELISAおよびリアルタイムPCR解析を用いた検出限界の決意。 （A）1×10 6 MB49-PSAの細胞は、異なる増殖培地中で増殖させ、上清中のPSAの分泌は、ELISAによって2日後に検出されました。増殖培地は以下の通りであった：プレミアムFBS（RPMI（P））、代わりのFBSを含むRPMI（RPMI（H））、およびFBSを含むDMEM（DMEM）でFBS-を含むRPMI（RPMI）、RPMI。 DMEM培地で増殖させたMB49-PSAの細胞は、より高いPSA分泌を有していました。 （B）MB49-PSAセル（1セルに10 6細胞）を、親MB49細胞（10 6個の細胞に1セル）と混合し、24時間平板培養しました。 PSA ELISA上清に行い、RNAを細胞から抽出しました。 1×10 5の最小6細胞を、ELISAによって検出可能でした。 （C）100 PSA分泌細胞/ 1×10 6個の細胞を、リアルタイムPCR分析によって検出可能でした。 Y軸の値は、平均RQ（相対定量）は、標準偏差を±表します。 RQ値は、βアクチン遺伝子に対するPSAのC T値を正規化したと1に設定された制御膀胱と比較した相対倍率変化、ある。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. 膀胱腫瘍増殖および検出。 （A）13日腫瘍移植後の膀胱の組織学的検査。パラフィン包埋し、膀胱を切片とヘマトキシリン（ダークブルー）、駅で染色しました残りの細胞成分を染色する、核をINS、およびエオシン（ピンク）。日5および13でこの膀胱のためのPSA /クレアチニン×10 6値は2688分の7として示されています。倍率は44.8Xです。スケールバーは1mmとを表します。 （B）尿を1.5 mLチューブに麻酔したマウス（下のパネル）から一晩代謝ケージ内のいずれかの配置マウスにより収集し、2 mLチューブ（上パネル）にコレクションチューブから尿を転送したりすることによってオンザスポット採尿しました。 、これは、次いで、0.6mLのチューブに移しました。腫瘍移植後（C）は 、マウスの体重を週に2回（上のパネル）をモニターしました。尿PSAは、マウスにおける腫瘍移植及び成長（下パネル）をモニターするために測定されました。 y軸PSA /クレアはクレアチニン×10 6個に正規化尿PSAを表します。マウスが一旦終了した体重の20％以上の損失がありました。注：それはTERMIた時PSA遺伝子発現は、40日目に、マウス2の膀胱で検出されましたそれは低い尿PSAを持っていたにも関わらず、いますか。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. PSAおよび膀胱腫瘍増殖。 （AD）マウスの19日目（AとB）で回収ブラダー、17日目（C）および腫瘍移植後13日目（D）の組織切片。各ブラダーのための4日目と13日目または14日目の尿PSA /クレアチニン×10 6の値が、フォーマット日に各画像の右側に示されている4/13日または14クレアチニン値は、腫瘍の大きさで増加/尿PSA 。画像のADのマウスは、腫瘍の大きさの違いを占め異なる治療を受けました。倍率は41.4Xです。スケールバーは1mmとを表します。「http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55078/55078fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
蛍光色素で標識MB49-PSA細胞の4プロファイル図。 （A）染色した細胞をプレーティングする前に、フローサイトメトリーにより分析しました。標識された細胞は、蛍光色素の強度を分析するために数日おきに採取しました。 （B）指定された日後の標識で（A）からP2のゲート内でラベルを付けられたMB49-PSA細胞の割合。 （C）シグナルの平均蛍光強度（MFI）によって測定された蛍光色素の強度。 10日間のin vivoイメージングシステムを用いて標識MB49-PSA細胞と移植後のマウスの（D）画像は、腹部内の非特異的蛍光を示しました。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マウス膀胱の5超音波画像を図。腫瘍移植及び8日目、腫瘍移植後（B）の前にマウス膀胱（A）。 （H）から（C）は 、マウスの超音波画像である二週間移植後袋。 PSA /クレア：クレアチニンに正規化された尿PSA（10 6）。 PSA遺伝子：ブラダ（RQをログ）におけるPSAの遺伝子発現は、各膀胱のために示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 尿PSA | 蛍光画像 | 超音波画像 | |
| ステップ（時間が必要） | マウスを麻酔。 110μLの尿を収集します。 （約1時間） PSA ELISA（2時間30分の総インキュベーション時間）を行います クレアチニンアッセイ（インキュベーション時間：5分） | マウスを麻酔。 腹部の毛を剃ります。 撮影を行います。 | マウスを麻酔。 腹部の毛を剃ります。 カテーテルを挿入し、膀胱内に生理食塩水100μLを植え付けます。 腹部を低下させ、超音波画像を得るために導電性ゲルを適用します。 |
| 特殊な装置 | ELISAプレートリーダー（450 nmおよび510 nmの波長で） | 結像系 | 超音波イメージングシステム |
| 腫瘍細胞の改変 | RequirED（PSAを発現しています） | 必須（蛍光） | 必須ではありません |
| メリット | 信頼性のある | 簡単かつ迅速 | 大きな腫瘍を検出することができます。 |
| 制限事項 | 十分な尿を取得できない場合があります 負の値は、（PSA遺伝子発現解析は、感度は向上しますが、エンドポイント分析に限定されている）は、腫瘍が存在しないことを意味するものではありません | 蛍光色素の注意深い選択は、高いバックグラウンドを防ぐために必要とされます。 | 小さな腫瘍を検出することはできません。 一度に一つのマウス。 |
マウス膀胱内の腫瘍増殖をモニタリングするための方法の表1の比較。
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Discussion
プロトコルの中で最も重要なステップは、1）が正常細胞株の腫瘍形成性を維持しています。 2）マウスにおける腫瘍細胞移植の前に測定可能なPSAの分泌を確実。腫瘍の大きさのばらつきを低減するように、3）移植のための単一細胞懸濁液を生成します。そして4）腎臓における腫瘍細胞移植の結果、膀胱尿管逆流を防止するために、遅い速度で細胞を浸透させます。
in vitroでの長時間の経過後、MB49 / MB49-PSAの細胞は、マウスにおいて腫瘍を生成することができないことによって示されるように、それらの腫瘍形成性を失う可能性があります。これは、マウスを治療した後に硬化されるか否かの交絡因子である可能性があります。細胞株は、腫瘍を形成することができないため、腫瘍の非存在下では、原因で、免疫原性の腫瘍または全く腫瘍を有するマウスから自然に治癒したマウスの治療により硬化マウスを区別することは不可能です。これに対処する一つの方法は、再通路をするマウスにおける細胞SUを生成することによるものですB-皮膚腫瘍。この再継代が頻繁に行われる場合、過度に攻撃的な腫瘍を発生します。微妙なバランスは、細胞が再継代する必要がある時を決定するために必要とされます。一般に、実験の主要な一連の前に、細胞株が復活され、その後、腫瘍を形成するそれらの能力を確認するためにマウスの皮下に移植しました。腫瘍は、自発的な治療法がないことを確認するために数週間のために監視されています。自発的治癒が観察されている場合は、ステップ3で、プロトコルを実行する必要があります。細胞は腫瘍移植のために使用される前に、同様に、PSAを産生するMB49-PSA細胞の能力を常に確認する必要があります。
尿PSAは、MB49-PSAの細胞を用いて確立された膀胱腫瘍の増殖をモニターするために使用することができます。しかし、負または「正常」尿PSA値は、必ずしも腫瘍細胞の存在しないことを意味するものではありませんが、以下の1×10 5細胞が存在していることだけ。尿PSAは4日目の周りに決定されたように7日目には、何の腫瘍を有していないように見えるマウスは、正常マウス+ 3 SDの値に基づいて、実験から除去することができます。これらのマウスのうちのいくつかは、後日、腫瘍を開発することがあります。腫瘍なしでマウスを削除すると、腫瘍は、任意の治療を開始する前に、サイズが非常に類似していることを保証します。これは、治療に応答して腫瘍の大きさに起因する変動を低減します。腫瘍の大きさの変動の主な原因は、移植前の細胞の凝集なので、努力は、移植前に再懸濁細胞になされるべきです。
11日目にPSAをモニターすることによって7、まだこれらを分類することが可能である - マウスの少数が使用される場合しかし、腫瘍は日4によって測定されない場合でも、研究にすべてのマウスを維持する必要があるかもしれません小さい腫瘍を有した、およびエンドポイント分析は（ - 11日目対 7日の測定尿PSAの存在に基づいて）最初の腫瘍の大きさに対して行うことができるようにマウス。腫瘍を定量化することができるという利点別のPSA値を有する全てのマウスが研究に含まれてもよいし、治療への応答は、元の腫瘍サイズに対するそれらのPSA /クレアチニン値に基づいて決定することができることです。懸念のもう一つのポイントは、膀胱尿管逆流です。これにより、腎臓における腫瘍の発達をもたらすことができます。 50μLに100μLから点眼するボリュームを削減し、点滴を行うことが、ゆっくりと、この発生の可能性を減少させます。
尿ベースのアッセイに関連する一つの問題は、同所性腫瘍が膀胱に成長として観察減少尿コレクションです。尿が簡単に移植後最初の数週間の間、マウスから採取することができますが、時間の経過とともに、採取した尿の量は、PSAおよびクレアチニンの測定のために十分ではないかもしれません。必要な尿の最小容量は110μLですが、より優れています。したがって、PSAの測定値は、後の時点で、すべてのマウスのために利用できない場合があります。また、尿中の赤血球の溶解が誤って与えPSA ELISAで高い読書。非尿ベースのアッセイは、この問題を克服することができます。蛍光イメージングは、使用するのは簡単ですが、残念ながら、我々は、マウスの飼料も同様に赤色蛍光を持っていたことが分かりました。これは、膀胱が容易に見ることができませんでした、それに対して高いバックグラウンドを与えました。スウィーニーらによって記載されているように、緑色蛍光色素またはタンパク質を使用して、この問題を克服することが可能です。 10蛍光と超音波の両方のために、マウスは、腹面に剃らする必要があります。
超音波画像は、腫瘍の位置を特定するには、PSA遺伝子発現と同様に良好であるように思われます。しかし、超音波イメージングの欠点は、膀胱が良い腫瘍の可視化を得るために撮像中に膨張しなければならないことです。膀胱腫瘍が大きい場合には画像が明確であるが、腫瘍の非存在下のマウスに小さな腫瘍を区別することは困難です。超音波は、直径22で約1.5ミリメートルの腫瘍を検出するが、4日目にすることができることが報告されています移植後、腫瘍は、これよりはるかに小さいです。したがって、この方法は当日の腫瘍の検出のために良くないかもしれません4. 表1は、3つの異なる腫瘍監視システムを比較します。 PSA ELISAを使用するのが最も簡単ですし、すべての動物施設では利用できない場合があり小動物イメージングシステムを必要としません。
PSA遺伝子発現のリアルタイムPCR分析の高い感度を考えれば、実験を終了したときにマウスを硬化させたかどうかを確認するために免疫組織化学の代わりに使用することができます。免疫組織化学では、0.2の腫瘍- 0.3ミリメートルは、移植15日後4によって検出可能です。しかし、これは、腫瘍移植をモニターするために使用することができないエンドポイント分析法です。この研究では、MRIは評価されなかったが、移植の8日後10によって腫瘍の存在を同定することができると報告されています。緑色蛍光タンパク質（GFP）、それIを発現するように細胞を変更することによって終了時の腫瘍移植及びリアルタイムPCR分析は、異なる治療群の間で腫瘍移植及び治療効果の確認を提供して検出するために、7日目により早く尿PSAの組合せを腫瘍移植を確認することが可能です。
我々のプロトコルの欠点は、存在する細胞の数が10未満5細胞である場合にELISAアッセイは、腫瘍の存在を確認することができないことが主です。したがってより高感度なアッセイは、PSAの検出に必要な時間を短縮する高速アッセイと同様に開発する必要があります。 ELISAは、実行するのに数時間かかります。例えばヤッフェ法23に基づいて実行するのに約5分を要するれるクレアチニンアッセイなどの迅速な方法が大幅に腫瘍増殖のモニタリングを簡素化するであろう。この目的のために、PSAの活性を検出するための酵素に基づく方法を評価し、それが成功しませんでした。コロイド金ナノ粒子に基づくアッセイシステムの使用は、アッセイAを実行するのにかかる時間を減らすことができますND感度24を増加させます。この点において、電極ベースのセンサおよびナノ粒子を用いた電気化学ベースのセンサーは、ヒトPSA 25-27をアッセイするために開発されているコストは、動物モデルに適用することができる合理的である場合。アッセイシステムはまた、そのようなアッセイは、インビトロでの最適な条件で行うのではなく、組織の酸素化に依存しているインビボイメージングに依存するGFPまたはルシフェラーゼのような別のタンパク質分泌系を使用することによって改善することができます。
マウスでの化学発癌が変異28の点でヒト癌に類似して腫瘍を発生させるが、それらは実験のコストを増大させるマウスの多数を必要とする、生産に時間がかかると動物の大きさのように比較することはできません。ヒトタンパク質を認識する標的化剤を評価する場合、ヒト異種移植片をヌードまたは重症複合免疫不全に皮下移植します（SCID）マウスが唯一のオプションです。これらのモデルは、抗体認識の概念の証拠を提供したが、無傷の免疫系の欠如は、免疫活性化の評価を妨げます。人間の異種移植片29を用いた膀胱癌のためのヒト化マウスモデルの最近の開発は、いくつかの免疫洞察を提供しますが、細胞が移植されるように皮下にそれは実際にヒトの疾患の環境を再現しません。免疫不全マウスに同所性腫瘍を生成するために技術的に困難です。それは臨床状況と宿主免疫細胞の影響を評価する能力をモデル化治療への制御された曝露を可能にする適切な組織の場所を提供するようにこのようにその限界にもかかわらず、同系同所性モデルはまだ膀胱癌のための評価と治療法の開発のための良好なモデルであります癌治療中。全てこれは、急速な腫瘍マウスの開発で費用効果の高いモデルで腫瘍増殖の結果を監視する能力と組み合わせます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4 - 6 wk old | |
| Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack - HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24 G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye - VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
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