Summary
Этот протокол описывает генерацию мышиных опухолей цистопластики у самок C57BL / 6J и мониторинг роста опухоли.
Abstract
Этот протокол описывает генерацию опухолей мочевого пузыря у самок C57BL / 6J мышей с использованием мышиных клеток рака мочевого пузыря линии MB49, который был модифицирован секретируют человеческого простат-специфического антигена (ПСА), а также порядок подтверждения имплантации опухоли. Короче говоря, мышей анестезируют с помощью инъекционных препаратов и сделаны лежать в положении лежа на спине. Моча освобождено из мочевого пузыря и 50 мкл поли-L-лизин (PLL) медленно закапывают со скоростью 10 мкл / 20 с помощью катетера 24 G IV. Он остается в мочевом пузыре в течение 20 мин с помощью укупоривая катетера. Катетер удаляют и ФАПЧ освобождаемые мягкое давление на мочевой пузырь. За этим следует закапывания мышиной линии клеток рака мочевого пузыря (1 х 10 5 клеток / 50 мкл) со скоростью 10 мкл / 20 с. Катетер закупоривают для предотвращения преждевременной эвакуации. Через 1 ч мышей возродил с лекарственным средством реверсирования, и мочевой пузырь освобождается. Медленная скорость закапывания важно,так как это уменьшает пузырно-мочеточниковый рефлюкс, который может вызывать опухоли происходить в верхних мочевых путей и в почках. Клеточная линия должна быть хорошо ресуспендировали уменьшить слипание клеток, так как это может привести к неравномерному размеров опухоли после имплантации.
Этот метод вызывает опухоли с высокой эффективностью. Рост опухоли контролировали секреции мочевой PSA. Мониторинг ПСА маркером является более надежным, чем ультразвук или флуоресцентных изображений для обнаружения присутствия опухолей в мочевом пузыре. Опухоли у мышей обычно достигают максимального размера, что негативно влияет на здоровье около 3 - 4 недель, если не лечить. Контролируя рост опухоли, можно дифференцировать мышей, которые были вылечены от тех, которые не были успешно имплантировали опухоли. Только с анализа конечной точки, последняя может быть ошибочно предполагается, что были вылечены с помощью терапии.
Introduction
Цель этого метода заключается в создании мышиный Ортотопическая опухолей мочевого пузыря и следить за имплантированных опухолей настолько точно, насколько это возможно, так что у мышей без имплантации опухоли не думали, были вылечены при анализе конечной точки. В целом, способ, показанный уменьшит потребность в большом количестве мышей для экспериментального анализа и обеспечения большей точности при определении терапевтических результатов.
Развитие ортотопической модели рака важно, так как имплантировать опухолевые клетки подкожно не перепросматривать окружающую среду клинического заболевания или способствовать развитию терапевтических стратегий. Архитектура мочевого пузыря позволяет инстилляции рака мочевого пузыря терапии непосредственно в мочевой пузырь с минимальным количеством системных эффектов. Таким образом, животные модели, которые Повторим эту среду, такие как ортотопической, имеют важное значение для оценки новых методов лечения. Выводы, сделанные из любой экспериментальной установки являются dependenт при ограничениях модели.
Несколько методов было разработано для производства ортотопической опухолей мочевого пузыря у мышей. Они полагаются на повреждения гликозаминогликаны слой мочевого пузыря, что позволяет опухолевые клетки для имплантации. Методы , используемые включают электрокоагуляции, что приводит к одной точке повреждения в стенке мочевого пузыря, что приводит к развитию опухоли на одном участке в мочевом пузыре 1,2. Тем не менее, вероятность успеха имплантации опухоли с использованием электрокоагуляции является функция зависит от оператора колеблется от 10 - 90%, и она включает в себя опасность, что стенка мочевого пузыря будет пробита, что приводит к развитию опухолей, развивающихся в брюшной полости. Химическое прижигание осуществляется с использованием нитрата серебра, который повреждает мочевой пузырь стенки 3. Аналогичным образом , кислота использовалась , чтобы привести к повреждению стенки мочевого пузыря 4. Трипсин был также использован , чтобы повредить мочевой пузырь а также 5. Эти методы могут привести к развитию более чем одной опухолью в мочевом пузыре.Кроме того, существует опасность серьезного повреждения мочевого пузыря, если химические вещества остаются в контакте со стенкой мочевого пузыря слишком долго. Метод , разработанный Ninalga и др. использует положительно заряженный поли-L-лизин (PLL) 6 молекул обволакивать стенки мочевого пузыря; Это позволяет отрицательно заряженные опухолевые клетки, чтобы прилипнуть к гликозаминогликанов слоя мочевого пузыря. Этот метод обычно приводит к более чем одной опухолью , развивающейся в мочевом пузыре, но имплантации опухоли на 80 - 100% 4,7. С технической точки зрения это также самый простой процедуры для выполнения. Для того, чтобы гарантировать, что опухоли, которые развиваются достаточно даже по размеру, важно, что опухолевые клетки не группируются в крупных комков перед имплантацией.
Для оценки терапевтической эффективности, то лучше всего выполнить это исследование на мышах с довольно аналогичного размера опухолей. Таким образом, хорошая система обнаружения, которая может количественно оценить размер опухоли вскоре после имплантации имеет важное значение. Существует несколько стратегий имеют пчелыN используется для оценки опухоли. Они включают в себя магнитно - резонансной томографии (МРТ) 8-10, флуоресценцию 11, биолюминесценции 12,13, ультразвук 14 и иммуноферментного анализа (ИФА) 15,16. В то время как МРТ и УЗИ не требуют модификации опухолевых клеток, существует необходимость в чувствительной аппаратуры и контрастных агентов для МРТ. В флуоресцентные-,-люминесцентных и ELISA-анализы, основанные требуют модификации опухолевых клеток, чтобы выразить маркерные белки, которые могут быть обнаружены с помощью этих методов. Для люминесценции, подложка необходима для обнаружения активности люциферазы; Таким образом, есть дополнительный шаг, и увеличение стоимости. Оба люминесценции и флуоресценции требуют специального оборудования. Для получения флуоресценции, зеленый флуоресцентный белок (GFP), циклизации, которая катализирует молекулярным кислородом, требуется. Таким образом, выражение GFP может быть переменной в пределах массы опухоли в зависимости от доступа кислорода, что делает это довольно ненадежным маркером
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животное работа придерживается руководящих принципов Institutional Animal Care и использование комитета (IACUC) по использованию животных и обработки (номер протокола 084/12) в Национальном университете Сингапура.
1. Рост MB49-PSA клеток Эрлиха и измерение PSA Секретирование
- Поддержание мышиного рака мочевого пузыря клетки MB49-PSA 15 в полном Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 ммоль / л L-глутамина, и 0,05 мг / мл пенициллина-стрептомицина в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Добавить 200 мкг / мл гигромицину B для поддержания давления отбора PSA-секретирующих клеток.
- Для определения секреции PSA, пластина 1 х 10 6 клеток в культуре пластины 6-луночного и инкубировать при 37 ° С в присутствии 5% СО 2 в течение 48 ч.
- Через два дня, собирают супернатант для определения уровня ПСА.
- С помощью пипетки Пастера, перенесите вирernatant в 15 мл центрифужную пробирку.
- Центрифуга в течение 5 мин при 250 мкг для удаления плавающих клеток и мусора. Если анализ ПСА проводится в другой день, хранить супернатант при - 30 ° С в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Если нет, переходите к следующему шагу немедленно.
- Определить концентрацию PSA с использованием человеческого свободных PSA ELISA набор 7.
- Перечислим высевания клеток.
- С помощью пипетки Пастера, промыть клетки осторожно с 1 мл DMEM. Отберите и полностью удалить средства массовой информации.
- Добавить 1 мл свежей среды, и осторожно соскрести с клеточным скребком, чтобы вытеснить клетки из колодца.
- Передача клетки микроцентрифужных трубки и повторно приостанавливать их тщательно, чтобы обеспечить одной клеточной суспензии.
- Смешайте равные объемы клеточной суспензии и 0,4% -ным раствором трипанового синего. Подсчитывают живые клетки (которые не занимают красителя) с использованием гемоцитометра.
- Вычислить выражение PSA в нгПСА / мл среды / 10 6 клеток. Выражение PSA клеток MB49-PSA для имплантации у мышей составляет 80 - 120 нг / мл / 10 6 клеток.
2. Определение чувствительности измерений ПСА с помощью ELISA и анализа в реальном времени ПЦР
- Пластина клеток MB49-PSA в полной среды DMEM в культуральной пластины 6-луночного с различными количествами родительских клеток MB49 таким образом, что существует не более 1 × 10 6 клеток на лунку (т.е., 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 и 10 6 клеток MB49-PSA культивируют 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, 10 или 0 MB49 клетки, соответственно).
- Через день, собирают супернатант для определения уровня ПСА, как описано в пункте 1.3. Определить концентрацию PSA с использованием человеческого свободных PSA ELISA набор 7.
- Извлечение РНК из клеток.
- лизироватьклетки непосредственно в пластине путем добавления 1 мл реагента для экстракции РНК.
- Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре и переносят Клеточный лизат в микроцентрифужных трубки. Добавить 0,2 мл хлороформа и вихревые образцы энергично в течение 15 с. Выдержите их в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга образцов при 12000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Аккуратно перенести верхнюю водную фазу (0,5 мл) в чистую пробирку, не нарушая интерфазе.
- Добавить 0,5 мл изопропилового спирта. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре. Центрифуга образцов при 12000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант полностью, не тревожа осадок РНК в нижней части трубы.
- Промыть гранулу один раз с помощью 1 мл 75% -ного этанола. Центрифуга при 7500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить весь этанол и позволяют гранулы высохнуть на воздухе в течение 10 мин.
- Развести РНК в 30 мкл нуклеазы без воды. Выдержите в течение 5 мин при 60 ° С, чтобы увеличить такlubility.
- Количественной оценки РНК путем измерения оптической плотности с использованием ультрафиолетового (УФ) спектроскопии при 260 нм (А260). Для оценки чистоты РНК, измеряют поглощение при 280 нм (А280) и вычислить отношение A260 / A280, которое должно быть выше 1,6.
- Реверс-транскрибировать кДНК из 2 мкг РНК.
- Готовят реакционную смесь на лед и перенести его на 0,2 мл пробирки.
- Кратко центрифуге трубки, чтобы спина вниз содержимое и устранить пузырьки воздуха.
- Загрузить пробирки в амплификатор и выполнить обратную транскрипцию при следующих условиях: 60 мин при 37 ° С, а затем 5 мин при 95 ° С. После того, как бег завершается, сохранить образцы кДНК при температуре 4 ° С.
- Храните образцы при температуре - 30 ° С в течение длительного хранения.
- Выполнение в режиме реального времени ПЦР-анализа для PSA и цитоплазматический бета-актина. Бета-актин используется для нормализации образцов. Выполнение анализа на 100 нг обратной транскрипции РНК в PLA 96-луночногот.е. Пробирной все образцы в трех экземплярах. Выполните 40 циклов со следующими параметрами: 2 мин при 50 ° С, 10 мин при 95 ° С, 15 с при 95 ° С для денатурации и 1 мин при 60 ° C. Установить нижний предел обнаружения при порога цикла (КТ) 35; Таким образом, любой образец со значением CT за 35 считается не обнаружено.
3. Поддержание туморогенности клеточной линии MB49-PSA
Примечание: продолженный рост в пробирке приводит к потере туморогенности. Для поддержания онкогенность, клеточная линия MB49-ПСА пассировать через мышь по крайней мере один раз в 2 года.
- Клетки.
- Урожай экспоненциально растущих клеток, очищая их осторожно стерильный клеточным скребком. Смешайте равные объемы клеточной суспензии и 0,4% -ным раствором трипанового синего. Количество живых клеток с использованием гемоцитометра. Не имплантировать, если более 20% клеток мертвы.
- Подсчитайте количество живых клеток требуется (1 х 107 клеток / мл) и передавать их на 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить супернатант. Повторное приостановить осадок клеток в DMEM пустой носитель. Повторите для стирки три раза, чтобы удалить все следы FBS до имплантации.
- Держите клеточной суспензии на льду, пока мыши не будут готовы к имплантации.
- Имплантат опухолевых клеток подкожно у мышей на спинном фланге.
- Обезболить длиной от 4 до 6-недельного возраста C57BL6 / J мышь, используя смесь кетамина анестетиков и медетомидин (75 мг / кг и 1 мг / кг, соответственно) вводили внутрибрюшинно в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.
- Бритье правый фланг, чтобы разоблачить кожу.
- Используя пару щипцов, поднимите кожу , чтобы отделить его от подлежащей мышцы и вводят по 0,1 мл суспензии клеток (1 × 10 6 клеток) подкожно иглой 24 G. При удалении иглы, зажать место инъекции в течение 5 до 10 с, так что опухолевые клетки делаютне истекают из места инъекции.
- Возроди мышь с подкожной инъекции атипамезола (1 мг / кг) в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.
- Монитор роста опухоли каждые два дня путем измерения диаметра опухоли с использованием калибров. Объем опухоли рассчитывали по формуле V = (AB 2) / 2, где "а" самый длинный размер и "б" перпендикуляр ширина, как в мм.
- Когда объем опухоли составляет по меньшей мере 50 мм 3 (примерно 7 дней), эвтаназии мышь с CO 2. Акцизный опухолевой массы с парой стерильных пинцетов и ножниц в асептических условиях и поместить в DMEM.
- В культуральный планшет 6-луночный, фарша опухоль на мелкие кусочки с помощью стерильных скальпелей. С помощью 1 мл шприца в качестве "пестик" для дальнейшей дезагрегации опухоли.
- Добавьте 3 мл полной среды DMEM и поддержания клеток в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- После того, как клетки придерживаться Platе (от одного до двух дней), удалите средства массовой информации, мусор и, не прилипшие клетки аспирационных осторожно стерильной пипетки Пастера. Промыть дважды с DMEM. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить клетки.
- Добавить 1 мл DMEM и сбора клеток путем соскабливания их с клеточным скребком. Для выбора и расширения отдельных колоний, подсчет клеток с помощью гемоцитометра и пластины 1 клетка на лунку в культуральной пластины с 96-луночного. Культуры клеток в DMEM с 200 мкг / мл гигромицина при 37 ° С и 5% CO 2.
- Изменение средств массовой информации и антибиотик каждые 4 - 5 дней. Монитор клетки, пока они не находятся на уровне 80-90% сплошности. Re-пластины клетки на 24-луночный планшет для культивирования с помощью пипетки вытеснить клетки из колодца.
- После того, как клетки в культуральную пластину 24-луночного являются сливающийся, смещать их путем соскоба с клеточным скребком и пластинчатые их в культуральный планшет 6-луночного.
- Экран различные клоны для секреции PSA, как описано в шаге 1. Крио-сохранить клон с самым высоким PSA секретиона и использовать его для будущих экспериментов мыши.
4. Имплантация Опухоль
Примечание: Каждая мыши имплантируют с 1 × 10 5 клеток MB49-PSA в 50 мкл DMEM пустой носитель в мочевом пузыре. Из-за мертвого пространства в катетере, всегда готовят дополнительный объем (по крайней мере, в количестве 100 мкл на мышь дополнительных). Альтернативный подход будет использовать воздух , наполненный шприц , как описано Касману и др. 5 , а не заполненный шприц.
- Клетки.
- За один день до имплантации, когда клетки примерно 80% сплошности, пассаж MB49-PSA опухолевые клетки в полной среде DMEM среде (с добавлением 10% FBS, 2 ммоль / л L-глутамина, 0,05 мг / мл пенициллина-стрептомицина, и 200 мкг / мл гигромицину в) при 37 ° с и 5% сО 2 при соотношении разделенного 1: 2.
- В день процедуры, сбора клеток путем соскабливания их осторожно стерильный клеточным скребком. Смешайте равные объемы клеточной суспензии и0,4% трипанового синего раствора. Количество живых клеток с использованием гемоцитометра. Не имплантировать, если более 20% клеток мертвы.
- Подсчитайте количество живых клеток требуется (2 × 10 6 клеток / мл) и передавать их на 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить супернатант. Повторное приостановить осадок клеток в DMEM пустой носитель. Повторите для стирки три раза, чтобы удалить все следы FBS до имплантации.
- Держите клеточной суспензии на льду, пока мыши не будут готовы к имплантации.
- Дайте 4- до 6-недельного возраста самка C57BL / 6J мышей акклиматизации в течение одной недели до процедуры. Все животное работы должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности для поддержания стерильных условий.
- Взвесить каждую мышь и вводят анестезию (75 мг / кг кетамина и 1 мг / кг медетомидин) внутрибрюшинно в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела. Массой тела должна составлять от 17 до 22 г. Подтвердите обезболивание путем наблюдения не не RESPONSE после схождения крайнем случае.
- Для идентификации, отметьте ухо с помощью ушного удар.
- Вводят раствор или соединение натрия лактат Гартмана внутрибрюшинно в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела каждые 1 - 2 ч для гидратации.
- Нанесите мазь стерильной глазной для обоих глаз с использованием стерильного ватный шарик, так как моргание рефлекс теряется под наркозом и глаза высыхают. Повторное применение в случае необходимости.
- Положите мышей в положении лежа на спине на бумажные полотенца на верхней части теплового пакета (активируется при контакте с воздухом) для поддержания температуры тела и ленты задние ноги вниз.
- С помощью пальца нанесите мягкое давление на нижней области живота и сбора мочи из мочевого пузыря в микроцентрифужных пробирку 1,5 мл. Этот пример служит базисной величины мочевого ПСА.
- Вывод стерильную поли-L-лизин (PLL) в 1 мл шприц и прикрепить внутривенный катетер 24 калибра, с иглой стилет удалены. Нанесите смазку на кончике катетера и иновERT катетер через уретру в мочевой пузырь с помощью щипцов для руководства катетеризацию. Остановитесь, когда ощущается сопротивление. Примечание: Исследователи должны обсудить с их ветеринарным персоналом о необходимости использования смазочной гель с анестетиком для внутрипузырные инстилляции и использования после процедуры анальгетиков.
- Закапывание 50 мкл ФАПЧ медленно, со скоростью 10 мкл каждые 20 секунд, чтобы избежать пузырно-мочеточниковый рефлюкс 18. Оставьте катетер в мочевом пузыре в течение 20 мин с пробкой для предотвращения выхода потока.
- Через 20 минут удалите катетер и освободить мочевой пузырь любого содержания, слегка нажав на нижнюю область живота. С помощью пустого шприца емкостью 1 мл, промойте все оставшиеся содержимое из катетера.
- Смешайте клетки MB49-PSA тщательно пипеткой и вывести их в 1 мл шприц. Прикрепите катетер и нанесите смазку. Закапывание 50 мкл 1 × 10 5 клеток с медленной скоростью 10 мкл каждые 20 сек. Заменить пробку накатетер. Дайте мышей контрольной группы по 50 мкл физиологического раствора.
- Через 1 ч, удалите катетеры и освободить мочевой пузырь любого содержимого. Удалите ленту на задних лапах и поместите мышей на их вентральной сторон. Возродить мышей подкожно инъекционного препарата реверсирования (1 мг / кг атипамезола) в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.
- Монитор мышей, пока не наблюдается моторики. Возвращение мышей в их клетки.
- После завершения протокола обнаружения опухоли (разделы 5, 7 или 8), усыпить мышей использованием CO 2. Обнаружение опухоли Посмертное описано в разделе 6.
5. Мониторинг роста опухоли с ELISA
Примечание: наличие опухоли и рост контролируется у мышей путем измерения секреции ПСА в моче. Исследователи должны проконсультироваться со своим ветеринарным персоналом по мониторингу состояния здоровья животных и благополучия имплантации после опухоли и гуманные конечные точки.
- Есть два метода для сбора мочи у мышей.
- Сбор мочи в течение ночи, помещая одну мышь в индивидуальной метаболическую клетку предназначенной для отделения мочи от фекального материала. Если установка не имеет охлаждение, добавить ингибитор протеазы (100 мкл) в пробирку для сбора мочи, чтобы предотвратить деградацию PSA в течение ночи. Тем не менее, количество доступных метаболические клетки ограничивает полезность этого метода сбора мочи.
- Там, где это технически невозможно использовать клетей метаболические (например, в ABSL2 комнатах), собирают мочу пятна с помощью пальца, чтобы оказывать давление на нежную нижней абдоминальной области в то время как мыши под наркозом, как описано в шаге 4.2.1. Обычно это делается до того, как терапия закапывают. По нашему опыту, по крайней мере, 150 мкл мочи можно собрать через 1 ч после анестезии.
- Немедленно поместите собранную мочу на льду. Гематурия может быть виден со второй недели после имплантации опухоли. Высоко гемолизированные образцы могут повлиять на анализ ELISA. Поэтому, мочадолжны быть размещены на льду и обрабатываются быстро после сбора.
- Центрифуга трубки мочи при 6700 х г в течение 5 мин при 4 ° С для удаления клеток и мусора.
- Для того, чтобы нормализовать разницу в диуреза между мышами, аликвоты мочи в новые пробирки и хранить их при температуре -30 ° C до выполнения анализов для PSA с использованием набора ELISA 7 и креатинин с использованием набора для анализа 7. Даже если мыши не производят PSA, существует низкий уровень неспецифического связывания обнаруженных с помощью ELISA. Для образцов , чтобы считать положительным, порог должен быть установлен при значениях больше , чем у нормальных мышей + 3 стандартных отклонений (SD) 15.
6. Определение Опухоль присутствия с ПЦР в реальном времени
- По окончании, рассекают брюшную полость мыши и найдите мочевого пузыря. Акцизный мочевого пузыря и поместите его в криопробирку. Замораживание немедленно в жидком азоте.
- Извлечение РНК гомогенизацией ткани в РНК ЕхПИДействие реагента.
- Выполнение обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени анализ ПСА, как описано выше в разделе 2.
7. Мониторинг роста опухоли с флуоресцентной томографии
- Добавьте 1 х 10 7 MB49-PSA клетки с ближней инфракрасной флуоресцентного красителя 19.
- Re-пластины и урожай меченых клеток на дни 4, 7, 11, 14, 18, и 21 , чтобы проверить , если клетки сохраняют жизнеспособность и флуоресценции с помощью проточной цитометрии 20.
- Имплантат меченые клетки MB49-PSA у мышей пузырями, как описано выше в разделе 4.
- Мониторинг роста опухоли с использованием системы флуоресценции изображений каждые два дня.
- В день обработки изображений, взвешивают и анестезию мышей с использованием смеси кетамина анестетиков и медетомидин (75 мг / кг и 1 мг / кг, соответственно) вводили внутрибрюшинно в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.
- Бритье области живота, чтобы подвергать кожу.
- Место мышей в камере формирования изображения и приобрестиИзображения баллонах с использованием программного обеспечения, поставляемого с системой визуализации.
- Возродить мышей подкожно инъекционные развороту препарата (1 мг / кг атипамезола) в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.
8. Мониторинг роста опухоли с Высокочастотный ультразвуковой визуализации
- Имплантаты опухоли у мышей, как описано выше в разделе 4.
- Каждые два дня, контролировать рост опухоли с помощью ультразвуковой визуализации.
- В день обработки изображений, взвешивают и анестезию мышей с использованием смеси кетамина анестетиков и медетомидин (75 мг / кг и 1 мг / кг, соответственно) вводили внутрибрюшинно в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.
- Бритье области живота, чтобы подвергать кожу.
- Привить 100 мкл стерильного 0,9% физиологического раствора в мочевой пузырь с помощью внутривенного катетера 24 калибра. Солевой будет растягиваться мочевого пузыря и улучшают видимость во время ультразвуковой визуализации.
- Поместите мышь на ультразвуковой платформе и применять токопроводящий гель для лАуэр живота.
- Опустить карманный зонда к коже и приобрести в В-режиме изображения мочевого пузыря на платформе 21 формирования изображения.
- Возродить мышей подкожно препарата реверсирования инъекционного (1 мг / кг Атипамезол) в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
было обнаружено секреции PSA из клеток MB49 изменяется в зависимости от питательной среды. MB49-PSA выращивают в DMEM средах , так как это приводит к увеличению секреции PSA (рис 1А). Для того, чтобы определить чувствительность к PSA ELISA и ПЦР в реальном времени, различные числа MB49 PSA-секретирующих клеток смешивали с MB49 родительских клеток. PSA ELISA обнаруживает минимум 1 × 10 5 PSA-секретирующих клеток / 1 × 10 6 клеток (рис 1В), в то время как в режиме реального времени ПЦР - анализ обнаруживает 100 PSA-секретирующих клеток / 1 × 10 6 клеток (рис 1C). Таким образом, ПЦР в реальном времени более чувствителен, чем ELISA, но она может быть выполнена только на весь мочевой пузырь. Это ограничивает его полезность для анализа конечной точки. Метод ФАПЧ результатов имплантации опухоли в разных опухолях (рис 2А) , развивающихся в мочевой пузырь. И в течение ночи сбор мочи с использованием клеток метаболических (рис 2B (Фигура 2В, нижняя панель) может быть использован для измерения ПСА с помощью ELISA. Для всех исследований на животных, вес мыши отмечается как мера здоровья (рис 2С, верхняя панель) и мочевой PSA контролируется на еженедельной основе (рис 2С, нижняя панель) в качестве меры роста опухоли. Существует в целом хорошая корреляция между массой тела мыши и размера опухоли, как измерено PSA. Мыши с большими опухолями начинают терять вес (рис 2С, мыши 3 и 5). Некоторые мыши , наблюдаемые на фиг.2С , может иметь большую опухоль , но до сих пор отображения нормального веса тела. Таким образом, одна масса тела не является достаточной мерой роста опухоли. PSA служит хорошим суррогатного маркера роста опухоли (рис 3A-D). Мыши были умерщвлены около 3 - 5 дней после того, как анализ мочи ПСА на 14 день Образы мочевого пузыря сечений показывают размер опухоли и соответствующий день 14 PSA / креатинин х 10 6 Reaдинь. Изменение размера опухоли связано с обработкой Мышам. На рисунке 3, панели AD представляют мышей от 3 -х различных группах лечения. Альтернативной стратегией для модификации PSA клеток является маркировка клеток с красителем. Эта стратегия устраняет необходимость в трансформации и селекции клеток. Маркировку клеток MB49-PSA с флуоресцентным красителем легко выполнить (Фиг.4А) и экстракорпоральное мониторинга показали обещание с точки зрения выживания сигнала, несмотря на клеточной репликации (фиг.4В и C). Однако в естественных изображений не была успешной, так как подача мыши также имел естественную красную флуоресценцию (рис 4D), что привело к неспецифической флуоресценции в брюшной области. Сравнение проводили между ультразвуковой визуализации, PSA мочевой секреции, а также анализ ПСА конечной точки. Ультразвуковое исследование мочевого пузыря (рис 5A-H) был хорош для идентификациибольшие опухоли, но это не было настолько успешным, с небольшими опухолями.
Рисунок 1. PSA секреция от MB49-PSA клеток и определение пределов обнаружения с использованием ELISA и ПЦР в реальном времени анализа. (А) 1 х 10 6 MB49-PSA клетки выращивали в различных средах роста и секреции PSA в надосадочной жидкости определяли через 2 дня с помощью ELISA. Среды для выращивания: RPMI с FBS- (RPMI), RPMI с FBS Премиум (RPMI (P)), RPMI с альтернативным FBS (RPMI (H)) и DMEM с FBS (DMEM). Клетки MB49-PSA, выращенные в DMEM СМИ имели более высокую секрецию PSA. (В) клетки MB49-PSA (10 6 клеток на 1 клетку) смешивали с родительских клеток MB49 (1 клеток на 10 6 клеток) и высевали в течение 24 ч. ПСА-ELISA проводили на надосадочной жидкости, и РНК экстрагировали из клеток. Минимум 1 х 10 5 6 клеток PSA-секретирующих были обнаружены с помощью ELISA. (C) 100 PSA-секретирующих клеток / 1 × 10 6 клеток были обнаружены с помощью анализа в реальном времени ПЦР. Значения по оси Y представляют собой среднее RQ (относительная количественная оценка) ± стандартное отклонение. Значения RQ относительные изменения складки, полученные путем нормализации значения С Т PSA к гена бета актина и сравнивали с контрольной мочевой пузырь , который установлен в 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Пузырь роста опухоли и обнаружения. (А) Гистологическое исследование мочевого пузыря через 13 дней после имплантации опухоли. Парафин мочевого пузыря разрезали и окрашивали гематоксилином (темно-синий), который стабильIns ядра и эозином (розовый), который окрашивает оставшиеся клеточные компоненты. PSA / креатинин х 10 6 значение этого пузыря на дни 5 и 13 показаны как 7/2688. Увеличение находится на 44.8X. Шкалы представляет 1 мм. (В) Мочу собирали либо путем размещения мышей в метаболических клетках в течение ночи и переноса мочи из пробирки в 2 мл пробирки (верхняя панель) , либо на рабочем месте сбора мочи с наркозом мышей (нижняя панель) в 1,5 мл пробирки , которые затем переносили в 0,6 мл пробирки. (С) После имплантации опухоли мышей весом контролировали два раза в неделю (верхняя панель). Мочевой ПСА измеряли для мониторинга имплантации опухолевых и роста у мышей (нижняя панель). Ось у PSA / Crea представляет мочевой PSA нормированы на креатинин × 10 6. Мыши были прекращены когда-то была потеря более чем на 20% от веса тела. Примечание: экспрессия гена ПСА был обнаружен в мочевой пузырь мыши 2 в день 40, когда он был TERMI пересылается, даже если он имел низкий мочевой PSA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. ПСА и роста опухоли мочевого пузыря. (AD) гистологические срезы мышей мочевой пузырь добываемых на 19 -й день (А и В), 17 -й день (C) и день 13 (D) после имплантации опухоли. На следующий день 4 день и 13 или 14 -й день недержание PSA / креатинин × 10 6 значений для каждого пузыря показана на правой стороне каждого изображения в формате день 4 / день 13 или 14. Мочевой PSA / креатинин значения увеличиваются с размером опухоли , Мыши в изображениях AD получили различные методы лечения, учитывающие различия размера опухоли. Увеличение находится на 41.4X. Шкалы представляет 1 мм."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55078/55078fig3large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Профиль MB49-PSA клеток маркируется с флуоресцентным красителем. (A) Окрашенные клетки анализировали с помощью проточной цитометрии , прежде чем покрытие. Меченые клетки собирали через каждые несколько дней, чтобы проанализировать интенсивность флуоресцентного красителя. (B) Процент меченых клеток MB49-PSA в пределах Р2 ворот от (А) в указанные дни пост- маркировки. (С) Интенсивность флуоресцентного красителя , измеренной средней интенсивности флуоресценции (MFI) сигнала. (D) Изображения мышей через 10 дней после имплантации с меченых клеток MB49-PSA с использованием естественных условиях системы формирования изображения в показал неспецифическую флуоресценцию в брюшной области.Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Ультразвуковые изображения мышиного пузырями. Мыши мочевые пузыри (а) до имплантации опухоли и (В) через 8 дней после имплантации опухоли. (С) до (Н) изображения ультразвука мышей мочевых пузырей через две недели после имплантации. PSA / Crea: недержание PSA нормированы на креатинин (10 6). ген PSA: экспрессия гена ПСА в мочевом пузыре (Log RQ) показаны для каждого мочевого пузыря. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Мочевой PSA | флуоресцентной томографии | Ультразвуковое исследование | |
| Этапы (требуется время) | Обезболить мышей. Соберите 110 мкл мочи. (~ 1 ч) Выполните PSA ELISA (общее время инкубации: 2 ч 30 мин) Креатинин анализ (время инкубации: 5 мин) | Обезболить мышей. Бритье мех на брюшной области. Выполните визуализацию. | Обезболить мышей. Бритье мех на брюшной области. Катетеризировать и привить 100 мкл физиологического раствора в мочевой пузырь. Применяют токопроводящий гель для нижней части живота и получения ультразвуковых изображений. |
| специализированное оборудование | ELISA-ридер (при длине волны 450 нм и 510 нм) | Imaging System | Ультразвуковая система обработки изображений |
| Модификация опухолевых клеток | Requirред (выражающий PSA) | Необходимое (флуоресценции) | Не требуется |
| преимущества | надежный | Простой и быстрый | Можно обнаружить большие опухоли |
| Ограничения | Может не получить достаточное количество мочи Отрицательное значение не означает отсутствие опухоли (анализ экспрессии генов ПСА повышает чувствительность, но ограничена конечной точкой анализа) | Тщательный отбор красителя флуоресценции необходим для предотвращения высокого фона. | Не удается обнаружить небольшие опухоли. Одна мышь в то время. |
Таблица 1. Сравнение методов мониторинга роста опухоли у мыши пузырями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важные шаги в протоколе: 1) успешно поддерживая туморогенности клеточной линии; 2) обеспечение секреции измеримое ПСА до имплантации опухолевых клеток у мышей; 3) получение суспензии одноклеточных для имплантации так, чтобы уменьшить изменение размера опухоли; и 4) прививать клетки с низкой скоростью, чтобы предотвратить пузырно-мочеточниковый рефлюкс, что приводит к имплантации опухолевых клеток в почках.
После длительного прохождения в пробирке, клетки MB49 / MB49-PSA могут потерять свою онкогенность, о чем свидетельствует их неспособность вызывать раковые опухоли у мышей. Это может быть обескураживающий фактор в отношении того или нет мышей вылечили после терапии. При отсутствии опухолей, не представляется возможным дифференцировать мышей излечены терапии у мышей, вылеченных спонтанно из-за иммуногенных опухолей или от мышей, без каких-либо опухолей вообще, так как клеточная линия не может образовывать опухоли. Один из способов борьбы с этим является повторно пассажа клеток у мышей, производя суб-кожный опухоли. Если повторная пассажи выполняется слишком часто, слишком агрессивные опухоли образуются. Прекрасный баланс необходимо, чтобы определить, когда клетки должны быть вновь пассировать. Как правило, перед основной серии экспериментов, клеточная линия возрождается, а затем имплантировали мышам подкожно, чтобы подтвердить их способность образовывать опухоли. Опухоли контролируются в течение нескольких недель, чтобы убедиться, что нет спонтанные затвердевает. Тем не менее, если наблюдаются спонтанные затвердевает, то протокол на этапе 3 должно быть выполнено. Аналогичным образом, способность клеток MB49-PSA для производства PSA всегда должны быть подтверждены до того, как клетки используются для имплантации опухоли.
Мочевой PSA может быть использован для контроля роста опухолей мочевого пузыря, созданных с использованием клеток MB49-PSA. Тем не менее, отрицательное или "нормальной" недержание значение ПСА не обязательно означает отсутствие опухолевых клеток, но только , что менее 1 × 10 5 клеток присутствуют. Поскольку мочевой ПСА определяется вокруг 4-й деньна 7-й день, у мышей, которые появляются, не имеют опухоли, основанные на значении нормальных мышей + 3 SD, могут быть удалены из эксперимента. Некоторые из этих мышей может развиться опухоль на более позднем этапе. Удаление мышей без каких-либо опухолей гарантирует, что опухоли очень близки по размерам перед началом любой терапии. Это уменьшает изменение из-за размера опухоли в ответ на терапию. Основной причиной изменения размера опухоли является слипание клеток перед имплантацией, так что должны быть предприняты усилия, чтобы вновь приостановить клетки перед имплантацией.
Тем не менее, когда небольшое количество мышей используются, это может быть необходимо, чтобы держать все мышей в исследовании, даже если опухоль не измеримо дней 4 - 7. Путем мониторинга ПСА на 11-й день, он все еще может быть обеспечена возможность классифицировать эти мыши как будто они имели небольшие опухоли, и анализ конечных результатов может быть выполнена по отношению к исходному размеру опухоли (на основании наличия измеримой мочевом ПСА на дни 4 - 7 по сравнению с 11 -й день). Преимущество быть в состоянии определить количество опухолейс различными значениями PSA является то, что все мыши могут быть включены в исследование, и ответ на терапию может быть определена на основе их ПСА / креатинин значений по отношению к исходному размеру опухоли. Другая точка беспокойства является пузырно-мочеточниковый рефлюкс. Это может привести к развитию опухоли в почках. Уменьшение объема следует привили от 100 мкл до 50 мкл и выполнение инстилляцию медленно снижает вероятность возникновения подобной ситуации.
Одна из проблем, связанных с анализами мочи на основе приведенная для сбора мочи наблюдается как ортотопической опухоли растут в мочевом пузыре. В то время как моча может быть легко собрана из мышей в течение первых нескольких недель после имплантации, со временем, объем мочи, собранной не может быть достаточным для PSA и креатинин измерений. Минимальный объем мочи требуется 110 мкл, но больше, тем лучше. Таким образом, показания PSA не могут быть доступны для всех мышей в более поздние моменты времени. Кроме того, лизис красных кровяных клеток в моче дает ложновысокие показатели по PSA ELISA. Пробирного без мочи на основе может решить эту проблему. К сожалению, хотя флуоресцентных изображений прост в использовании, мы обнаружили, что подача мыши имели красную флуоресценцию, а также. Это дало высокий фон, на котором мочевой пузырь не может быть легко увидеть. Вполне возможно , что с помощью зеленого флуоресцентного красителя или белок , может решить эту проблему, как описано Sweeney и др. 10 Для обеих флуоресценции и ультразвука, мыши должны быть выбриты на вентральной поверхности.
Ультразвуковые изображения по всей видимости, столь же хорошо, как экспрессии генов ПСА в локализации опухолей. Тем не менее, недостаток ультразвукового изображения является то, что мочевой пузырь должен быть растянут во время формирования изображения, чтобы получить хорошую визуализацию опухоли. В то время как изображения ясно, когда опухоль мочевого пузыря велика, то трудно дифференцировать небольших опухолей у мышей с отсутствием опухолей. Сообщалось , что ультразвук может обнаружить опухоли около 1,5 мм в диаметре 22, а на 4 -й деньпосле имплантации опухоли, намного меньше, чем это. Таким образом, этот метод не может быть хорошо для обнаружения опухолей на день 4. В таблице 1 приведено сравнение 3 -х различных систем мониторинга опухолей; ПСА ELISA является самым простым в использовании и не требует систем визуализации мелких животных, которые не могут быть доступны на всех объектах животных.
Учитывая большую чувствительность ПЦР в реальном времени анализ экспрессии генов ПСА, он может быть использован на месте иммуногистохимии, чтобы подтвердить, были ли вылечить мышей, когда эксперимент был закончен. С иммуногистохимии, опухоль 0,2 - 0,3 мм обнаруживается на 4 -й день после имплантации 15. Тем не менее, это метод анализа конечных точек, которые не могут быть использованы для мониторинга имплантации опухоли. В данном исследовании МРТ не оценивали, но сообщалось , чтобы быть в состоянии определить наличие опухолей по 10 -й день после имплантации 8. Изменяя клетки для экспрессии белка зеленый флуоресцентный (GFP), это яS можно подтвердить имплантации опухоли на день 7. Комбинация раннего мочевого PSA для обнаружения имплантации опухоли и в режиме реального времени ПЦР-анализа при завершении обеспечивает подтверждение имплантации опухоли и терапевтической эффективности между различными группами лечения.
Недостатком нашего протокола является в основном то , что анализ ELISA , не может подтвердить наличие опухоли , когда количество клеток , присутствующих составляет менее 10 5 клеток. Таким образом, более чувствительные тесты должны быть разработаны, а также более быстрые анализы, чтобы сократить время, необходимое для обнаружения ПСА. ИФА занимает несколько часов, чтобы выполнить. Быстрый способ , такой как анализ креатинина , который основан на методе Jaffe 23 и занимает около 5 минут , чтобы выполнить значительно упростит контроль роста опухоли. С этой целью метод на основе ферментов для выявления активности PSA оценивали, но он не был успешным. Использование коллоидного золота и наночастиц на основе систем анализа может сократить время, необходимое для выполнения анализа использовалиго повышения чувствительности 24. В связи с этим, датчики на основе электродов и электрохимических датчиков на основе использования наночастиц были разработаны для анализа человеческого PSA и 25-27 , если стоимость является разумным , может быть применима к животной модели. Система анализа также может быть улучшена с помощью другой системы секреции белка , такие как GFP или люциферазы , где анализ проводят в оптимальных условиях в пробирке , а не в зависимости от визуализации в естественных условиях , которая зависит от оксигенации тканей.
В то время как химический канцерогенез у мышей генерирует опухоли с сходством неоплазий человека с точки зрения мутаций 28, они занимают больше времени , чтобы производить и не сравнимыми по размеру между животными, требуя большего количества мышей , что повышает стоимость экспериментирования. При ориентации агентов, распознающие человеческие белки должны быть оценены, человеческие ксенотрансплантаты имплантировали подкожно в обнаженном или тяжелым комбинированным иммунодефицитом(SCID) мышей является единственным вариантом. Хотя эти модели обеспечивают доказательство концепции распознавания антител, отсутствие неповрежденной иммунной системы затрудняет оценку активации иммунной системы. Недавнее развитие гуманизированного мышиной модели рака мочевого пузыря с использованием человеческих ксенотрансплантаты 29, действительно обеспечивает некоторые иммунные идеи, но , как клетки имплантируют подкожно он фактически не перепросматривать окружающую среду болезни человека. Это технически трудно производить ортотопической опухолей у иммунодефицитных мышей. Таким образом, сингенная ортотопическая модель, несмотря на ограничения по-прежнему является хорошей моделью для оценки и развития лечения рака мочевого пузыря, поскольку он обеспечивает расположение правильную ткани, позволяет контролировать воздействие терапии моделирование клинической ситуации и способность оценивать влияние иммунных клеток-хозяев во время терапии рака. Все это в сочетании с развитием быстрого опухолей у мышей и способность контролировать результаты роста опухоли в экономически эффективной модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4 - 6 wk old | |
| Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack - HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24 G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye - VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
- Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
- Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181 (2013).
- Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
- Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684 (2011).
- Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
- Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
- Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3 (2016).
- Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
- Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
- Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
- Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
- Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
- Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
- Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
- Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172 (2012).
- Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075 (2007).
- Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
- Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718 (2015).
- Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
- Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
- Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
- Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
- Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
- Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
- Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
- Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).
